使用线扫描振动和频产生显微技术的多模态非线性高光谱化学成像

摘要

开发了一种多模态快速高光谱成像框架，用于获取宽带振动和频生成（VSFG）图像，同时结合明场和二次谐波产生（SHG）成像模式。由于红外频率与分子振动共振，该方法可揭示具有对称性允许特性的样品的微观结构和介观形貌信息。

摘要

振动和频产生（VSFG）是一种二阶非线性光学信号，传统上被用作光谱技术来研究界面分子，其空间分辨率约为 100 µm。然而，该光谱技术对样品的异质性不敏感。为了研究介观尺度上具有异质性的样品，我们与他人共同将 VSFG 光谱技术的分辨率极限推进至约 1 µm 水平，并构建了 VSFG 显微镜。这种成像技术不仅能够通过成像解析样品的形貌，还能在图像的每个像素点上记录宽带 VSFG 光谱。作为一种二阶非线性光学技术，其选择定则使得生物学、材料科学及生物工程等领域中常见的非中心对称或手性自组装结构得以可视化。本文将引导读者了解一种倒置透射式设计，该设计可实现对未固定样品的成像。本研究还展示了将 VSFG 显微技术与神经网络函数求解器相结合，能够解析单个自组装片层的化学特异性几何信息。最后，通过对多种样品在明场、SHG 和 VSFG 配置下获得的图像进行简要讨论，阐述了 VSFG 成像所揭示的独特信息。

引言

振动和频产生（Vibrational sum-frequency generation, VSFG）是一种二阶非线性光学技术^1,2，已被广泛用作光谱学工具，用于对具有对称性允许特性的样品进行化学表征^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16....}

方案

1. 高光谱线扫描VSFG显微镜

1. 激光系统
   1. 使用中心波长为 1025 nm ± 5 nm 的脉冲激光系统（参见材料表）。将激光设置为 40 W、200 kHz（200 µJ/脉冲），脉宽约为 290 fs。
      注意：重复频率可略有变化，通常较高的重复频率激光更适用于该VSFG显微镜。
   2. 将种子激光的输出引导至商用光学参量放大器（OPA）以生成中红外（MIR）光束（参见材料表）。将MIR调谐至目标频率（图1A）。
      注意：在本研究中，MIR中心波长为 3450 nm ± 85 nm（约 2900 ± 72 cm^-1），脉冲持续时间约为 290 fs，脉冲能量约为 6 µJ，覆盖了部分-CH_x官能团区域。
2. 上转换光束
   1. 将来自OPA的残余1025 nm光束通过法布里-珀罗标准具（参见材料表），以产生光谱窄化的上转换光束，其半高全宽（FWHM）约为 4.75 cm^-1。
   2. 使用8 µm蓝宝石针孔对窄化后的1025 nm光束进行空间滤波。
      注意：可使用近红外（NIR）卡观察1025 nm光束。
   3. 使用λ/2波....

结果

图5：SDS@β-CD的分子结构、形貌及可能的取向。（A）SDS@β-CD的顶视图化学结构；（B）侧视图化学结构。（C）介观尺度片层在样品平面上的代表性非均匀分布。分子亚基在基底上的取向和排列方式可能各不相同，目前尚不明确。本图经改编自Wagner等人的研究²⁷。

讨论

最关键的步骤是1.42至1.44。为了实现光学空间分辨率，必须精确对准物镜。同时，有效收集发射信号、中继并以线状将扫描光束投射到入口狭缝处也至关重要。正确的对准可确保最佳分辨率和信噪比。对于典型的样品，如 SDS@2β-CD 100 µm × 100 µm 的片状样品，获得一幅高信噪比、分辨率良好（约1 µm）的图像需要20分钟。这已经比之前版本的仪器更快^24,26。通过使用更高重复频率的激光器，可进一步提高数据采集速度。

目前的局限性在于空间分辨率，通过使用更高数值孔径（NA）的物镜以及基于非线性光学的超分辨率技术，该分辨率有望进一步提升⁴⁵。外差探测已被应用于振动和频生成（VSFG）光谱中，以解析其相位并提取分子取向信息^{5,46,4.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x 相机转接器	Thorlabs	WFA4100	将相机连接至显微镜或光学系统
25.0 mm 直角棱镜镜，镀保护金膜	Thorlabs	MRA25-M01	反射光线并产生后向反射，将光线沿原路径返回
3” 通用立柱支架-5件装	Thorlabs	UPH3-P5	固定和支撑各种尺寸与配置的立柱
30 mm 转 60 mm 笼式安装板，厚度 4 mm	Thorlabs	LCP4S	在 30 mm 笼式系统与 60 mm 笼式系统之间进行转换
500 mm 高 Cerna 显微镜主体带落射照明臂	Thorlabs	CEA1500	实现显微镜顶部照明技术的功能
60 mm 笼式安装 Ø50.0 mm 可调光阑	Thorlabs	LCP50S	控制通过光学系统的光量
60 mm 笼式安装支架	Thorlabs	LCP01B	在光学装置中安装和定位 60 mm 笼式系统
空气间隔标准具	SLS Optics Ltd.	定制	生成窄带 1030 nm 光
笼式安装板支架	Thorlabs	KCB2	以精确角度固定和调节反射镜
CCD	Andor Technologies	Newton	用于频率和空间分辨的二维 CCD
共线光学参量放大器	Light Conversion	Orpheus-One-HP	可调中红外光源
氯化铜	Thermo Fischer Scientific	A16064.30	自组装组分
定制二向色镜	Newport	定制	根据波长或偏振态选择性反射或透射光线
外螺纹转 M32 内螺纹适配器	Thorlabs	SM1A34	提供兼容性，便于连接具有不同螺纹类型的组件
无限远校正折射物镜	Zeiss	420150-9900-000	折射物镜
无限远校正施瓦兹希尔德物镜	Pike Technologies Inc.	891-0007	反射式物镜
激光器	Carbide, Light-Conversion	C18212	激光光源
M32x0.75 外螺纹转 RMS 内螺纹	Thorlabs	M32RMSS	适配或转换显微物镜的螺纹尺寸或类型
M32x0.75 外螺纹转 M27x0.75 内螺纹刻字	Thorlabs	M32M27S	适配或转换显微物镜的螺纹尺寸或类型
手动中高程聚光镜调焦模块	Thorlabs	ZFM1030	调节光学元件的焦点
单色仪	Andor Technologies	Shamrock 500i	为每条线扫描提供频率分辨
带 1" 行程的边缘安装臂电动模块	Thorlabs	ZFM2020	控制成像物镜的垂直位置
纳米定位器	Mad City Labs Inc.	MMP3	三维样品台
共振扫描器	EOPC	SC-25	325 Hz 共振光束扫描器
RGB 彩色 CCD 相机	Thorlabs	DCU224C	明场相机，已停产，但其他相机同样适用
RGB 管镜	Thorlabs	ITL200	白光收集
直角运动学光学平台	Thorlabs	OPX2400	集成具有两个固定位置的滑动机构
30 mm 直角运动学反射镜架	Thorlabs	KCB1	以精确角度固定和调节反射镜
60 mm 直角运动学反射镜架	Thorlabs	KCB2	以精确角度固定和调节反射镜
SM2，用于 Cerna 调焦平台的 60 mm 笼式臂	Thorlabs	CSA2100	安全安装和定位聚光镜
60 mm 笼式系统快拆盖，长 24 英寸	Thorlabs	C60L24	封闭并保护笼内组件
十二烷基硫酸钠	Thermo Fischer Scientific	J63394.AK	自组装组分
用于 1" Cerna 行程平台的三通道控制器与旋钮盒	Thorlabs	MCM3001	控制 ZFM2020
管镜	Thorlabs	LA1380-AB - N-BK7	SFG 信号收集
可见光 LED 套件	Thorlabs	WFA1010	为成像系统提供照明
白光光源	Thorlabs	WFA1010	用于明场成像的白光照明光源
WPH05M-1030 - Ø1/2" 零级半波片，Ø1" 安装架，1030 nm	Thorlabs	WPH05M-1030	改变通过其的光的偏振态
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" 安装式低阶四分之一波片，3.5 µm	Thorlabs	WPLQ05M-3500	改变通过其的光的偏振态
X 轴长行程钢制延长接触滑台	Optosigma	TSD-65122CUU	提供水平（X）方向长行程的定位平台
XT95 4 英寸导轨载具	Thorlabs	XT95RC4	安装和定位光学元件
带 360 度旋转的 X-Y 轴平移台	Thorlabs	XYR1	实现物体在二维方向上的精确定位与移动，并具备平台旋转能力
XY(1/2") 线性平移器，中心带 SM1 通孔	Thorlabs	XYT1	提供二维方向上的精确定位与移动
掺镱固体激光器	Light Conversion	CB3-40W	种子激光器
β-环糊精	Thermo Fischer Scientific	J63161.22	自组装组分