大鼠模型中改良尾静脉和阴茎静脉穿刺采血法

摘要

本文介绍了一种为大鼠模型提供快速、简便且可靠的血液采集替代方法的实验方案。我们根据不同的实验条件描述了三种不同的采血方法：在麻醉状态下或清醒动物上进行的尾静脉穿刺，以及在麻醉状态下进行的背侧阴茎静脉穿刺。

摘要

在大多数动物实验设计中，需要采集血液样本以评估各种血液学参数。本文介绍了大鼠采血的两种方法：侧尾静脉穿刺法和背侧阴茎静脉穿刺法，这两种方法相较于先前描述的其他技术具有显著优势。本研究表明，这两种方法均可实现快速采样（耗时少于10分钟），并能获得足以满足大多数检测需求的血量（202 μL ± 67.7 μL）。背侧阴茎静脉穿刺必须在麻醉状态下进行，而侧尾静脉穿刺则可在清醒且被固定的大鼠上实施。

因此，交替使用这两种技术可以在任何情况下实现采血。尽管在操作过程中始终建议由另一人协助以确保动物福利，但与大多数需要两人配合的采血方法不同，这两种技术仅需一名操作者即可完成。此外，与之前所述的方法（如颈静脉穿刺、锁骨下静脉采血）相比，后者需要经过 extensive 的前期培训才能避免对动物造成伤害或导致其死亡，而尾静脉和背侧阴茎静脉穿刺极少引发动物死亡。基于上述所有原因，并结合具体实验情境（例如，针对雄性大鼠的研究、围手术期或术后即刻阶段、尾静脉较细的动物），可交替使用这两种技术，以实现重复采血。

引言

血液采样是大多数动物研究的必要步骤 体内 和 体外在大鼠实验中，由于采血频率和采血量可能较大，采用多种不同的采血方法十分有益。已有先前研究描述了多种采血技术。

最常用的技术是尾静脉穿刺和隐静脉采血。尾静脉采血适用于所有大鼠品系。经过适当培训后，该操作简单易行，且对动物造成的应激最小¹。同样，隐静脉采血如果操作得当，也是一种快速而简单的采血方法。这两种方法均不需要麻醉，且均可多次采集少量血液。然而，隐静脉穿刺通常获得的血量较少¹，并且需要两人配合，以便暴露一侧后肢进行穿刺²。

如果需要从单只动物采集大量血液，可采用心脏穿刺或腔静脉穿刺（通过心脏穿刺可从一只150 g的大鼠采集多达10 mL血液²）。这些技术需要麻醉，且属于终末性操作。动物在采用这两种技术之一后必须实施安乐死²。如果在尚未达到实验终点的研究中需要采集大量血液，可选择颈静脉采血作为替代方法。然而，该技术同样需要较高的操作技能，以避免对动物造成伤害；因此，其使用应受到限制³。

其他技术，例如锁骨下静脉采血，无需在采血前使用麻醉剂，且允许反复采集少量血液。然而，该技术需要对动物进行适当固定以及精准的针头穿刺。操作不当可能导致动物疼痛甚至死亡，且该方法的培训可能较为繁琐⁴。

其他经验性操作包括眶后穿刺和舌下静脉穿刺，这两种方法均需要使用麻醉剂，且均不被推荐或广泛使用。尽管先前的研究表明，与尾静脉穿刺相比，眶后穿刺采血速度更快，但研究发现，在乙醚麻醉下进行眶后穿刺的耐受性较差（依据动物的兴奋评分和尿液产生量）⁵。此外，该方法的操作效果高度依赖操作者的技能水平，主要由经验丰富的兽医实施。相比之下，舌下静脉穿刺对动物造成的应激较小，适用于重复采血⁶。然而，该技术可能引发严重不良反应，例如食物和水的摄入量显著减少，甚至可能导致动物死亡⁷。

本研究介绍了我们实验室用于重复采血的两种方法。尾静脉穿刺可在清醒动物上进行，组织损伤和不良影响极小。本研究对该技术的改进包括用食指和中指固定尾巴，使单个操作者即可完成采血。背侧阴茎静脉穿刺此前已有用于简单静脉注射的描述。该技术在麻醉下进行，当其他方法存在困难时（例如术后即期、小型动物、在麻醉下进行围手术期采血），可提供可靠的血液来源。与尾静脉采血类似，穿刺部位的损伤对动物的整体影响相较于上述其他技术也较小⁸。本文方法学的目的在于根据不同实验情境，为缺乏经验的研究人员提供简单且可靠的采血替代方案（例如在麻醉下进行的操作、涉及雄性大鼠的研究、尾静脉较细的动物）。

方案

实验在3月龄、体重为300-400 g的雄性Lewis大鼠上进行。共纳入24只动物，分为三种穿刺条件：12只大鼠接受无麻醉尾静脉穿刺（尾静脉无麻醉组），另外12只大鼠在麻醉后分别接受尾静脉穿刺（尾静脉有麻醉组）和阴茎静脉穿刺（阴茎静脉有麻醉组）。所有操作均获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指导原则。所有动物在研究结束时（随访1个月后）通过过量二氧化碳实施安乐死。有关本方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 一般准则

1. 根据IACUC指南，确保每2周采集的血液总量不超过总血容量的10%⁹例如，一只300 g的大鼠总血容量约为19.2 mL。若实验方案仅在第一周内需要进行四次采血（第0天、第1天、第3天、第7天），则每次采血量应限制在最大不超过 250 μL 每份样品的血液量。
2. 对于在麻醉下进行的操作，给予异氟烷 通过 使用精密蒸发器对动物进行麻醉。在麻醉诱导舱中以3%-5%异氟烷剂量诱导麻醉，持续5分钟；术中通过鼻罩以1%-3%异氟烷维持麻醉。根据呼吸频率的持续监测结果调整异氟烷浓度。在开始操作前，通过夹捏足趾验证镇静是否充分。
3. 在操作过程中或动物未恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
4. 采血后，需持续监测动物直至其完全恢复，然后方可将其放回笼中；在完全恢复前，不得将其与其他动物同笼饲养。
   注意：根据与兽医服务部门的共识，尾静脉或阴茎静脉穿刺术后无需给予镇痛药物。

2. 从阴茎静脉采血

1. 准备
   1. 准备以下器材：无菌纱布、手套、酒精棉片、微毛细血管血液收集EDTA管（紫色管帽）和30 G胰岛素注射器（30 U或50 U）。
   2. 将大鼠从笼中取出，放入异氟烷诱导室 通过 使用精密蒸发器（剂量：3%-5%）。动物麻醉后，将其转移至操作台，仰卧放置，鼻部置于鼻锥中以维持麻醉状态。监测呼吸频率，并根据情况调整异氟烷浓度（维持剂量：1%-3%）。操作开始前，通过脚趾夹捏测试确认动物已充分麻醉。
2. 血液采样
   1. 将注射器活塞前后移动数次以使吸取过程更顺畅。通过拉动活塞在注射器内产生负压，以抽出数微升液体。
   2. 借助非优势手将阴茎包皮从阴茎头端向后牵拉，并用拇指和食指夹住阴茎头，轻轻牵拉。背侧阴茎静脉将呈现为一条表浅的蓝色条索状结构。参见 图1 和 图2.
   3. 针尖朝上，以一定角度将胰岛素注射器插入静脉 35°一旦针头进入静脉，血液便会流入注射器。
   4. 以缓慢且稳定的速度回抽注射器活塞，以吸取所需体积的液体。
      注意：不要过快回抽针栓，否则会导致静脉塌陷并阻断血流。
   5. 如果血流减少，可将针头轻微顺时针或逆时针旋转。
   6. 移除注射器。穿刺部位将形成一滴血液，吸取该血滴可在非无菌操作情况下额外收集几微升血液。
   7. 如果首次穿刺失败，应将针头在静脉上更近端的位置重新插入。
      注意：与尾静脉采样不同，阴茎背静脉的反复穿刺通常不成功。
   8. 对穿刺部位施加轻柔压力以止血，并用新的酒精棉片擦拭该区域。
   9. 将阴茎恢复至中立位置。
   10. 关闭异氟烷，监测大鼠直至完全恢复，然后将其放回笼中。

3. 尾静脉穿刺

1. 准备
   1. 准备以下设备：塑料固定装置、无菌纱布、手套、酒精棉片、微量毛细血管采血EDTA管（紫色盖）以及28 G 1/2胰岛素注射器（30 U或50 U）。
   2. 将大鼠从笼中取出，迅速将其固定在塑料束缚锥中。将锥体大端紧贴尾根部固定。确保动物舒适，并在整个操作过程中呼吸不受限制。
   3. 将尾巴浸入温水（37 °C）中约1分钟，以扩张静脉。用纸巾擦干尾巴。将动物（连同固定装置）腹面朝下放置，尾巴置于加热垫上。
   4. 通过整体旋转动物至任一侧，选择右侧或左侧尾静脉（蓝色线条）进行采样（以避免尾部扭曲）。在尾部远端三分之一处进行血管穿刺，因为该区域血管更表浅。动脉位于腹侧，两条静脉位于侧方¹⁰。
   5. 用70%乙醇棉片擦拭穿刺部位。
   6. 将尾巴置于加热垫边缘，使尾部远端三分之一形成一定角度。此举可使静脉更突出，并为采样提供更多操作空间。
2. 采血
   1. 将注射器活塞来回抽动数次，以使抽吸顺畅。通过拉动活塞抽取数微升液体，在注射器内形成负压。
   2. 用非优势手的食指和中指将尾巴平稳固定在加热垫上。中指置于近端，食指置于远端，穿刺点位于两指之间。中指施加的压力应大于食指，以固定尾巴并在近端阻断血管，使血液在远端聚集。参见图1和图3。
   3. 针尖朝上，沿食指方向滑动胰岛素注射器，直至针头刺入静脉（此时针头与尾巴之间形成约35°角）。一旦针头进入静脉，血液将流入注射器。此时，松开食指和中指的压力，确保血流不受阻。
   4. 以稳定速度缓慢回抽注射器活塞，采集所需血量。
      注意：切勿过快回抽活塞，否则会导致静脉塌陷并中断血流。
   5. 若血流减少，可轻微向任一方向旋转针头。
   6. 将注射器从尾巴拔出。穿刺部位将形成血滴。在非无菌操作情况下，吸取此血滴可额外收集数微升血液。
   7. 若首次穿刺失败，可将针头在静脉上更近端处重新插入。
      ​注意：静脉越靠近尾根部位置越深。若注射器内无血流，可增大注射器与尾巴之间的角度，或旋转针头。
   8. 对穿刺部位施加压力以止血，并用新的酒精棉片擦拭该区域。将大鼠从塑料锥中取出，放回笼中。
3. 麻醉状态下尾静脉穿刺
   1. 执行步骤2.1.1和2.1.2以诱导和维持麻醉。
   2. 执行步骤3.1.3–3.2.7进行血液采集；参见图1。
   3. 执行步骤2.2.10进行动物复苏。

图1：本实验方案中不同穿刺方法的示意图。（A）对清醒且固定状态下的动物进行改良尾静脉穿刺；（B）在麻醉条件下进行改良尾静脉穿刺和阴茎静脉穿刺。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

成功定义为在10分钟内（从穿刺时间到采血结束）采集到至少100 µL的血液；失败定义为采集的血液量少于100 µL，或获取所需血量耗时超过10分钟。每次采样最多允许采集250 µL血液。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组比较，并使用卡方检验。数据以均值±标准差表示，以p < 0.05作为判断统计学显著性的临界值。

成功率的比较显示，清醒大鼠尾静脉穿刺（92%）与麻醉下阴茎静脉穿刺（83%）的结果相似（p = 0.0543），如图4所示。有趣的是，在麻醉状态下，尾静脉变得极不可靠，本研究中麻醉下尾静脉穿刺的成功率仅为25%，这可能是由于静脉变细所致。在需要麻醉的情况下，阴茎静脉穿刺采样的成功率显著高于尾静脉穿刺（p < 0.0001）。

我们比较了在麻醉状态下大鼠尾静脉和背侧阴茎静脉穿刺以及在清醒状态下大鼠尾静脉穿刺所采集的血量及操作持续时间。

讨论

尾静脉穿刺是一种从清醒大鼠获取血液的有效方法。然而，当动物处于麻醉状态时，异氟烷的作用可能导致血管痉挛，从而使尾静脉穿刺不再适用¹¹。本研究显示，在这种情况下可采用另一种方法，即从阴茎静脉采血，该方法成功率更高，且能在更短时间内获得显著更多的血量。需要注意的是，若首次尝试阴茎静脉采血失败，后续尝试可能也难以成功。相比之下，尾静脉穿刺在首次尝试困难时，仍可进行多次后续穿刺（因存在两条静脉，可尝试在尾部更高位置穿刺）¹。然而，反复穿刺可能导致样本溶血，因血红蛋白及红细胞膜内部成分释放而干扰实验结果，尤其在分析血浆时更为明显¹²。因此，应尽量避免多次穿刺，优先选择单次采血完成样本获取。

本研究中，每次采血量未超过 250 µL，符合本方案及 IACUC 指南对多次采血情况下动物福利的保护要求。生物分析技术的进步使得利用少于 50 µL 的微量样本即可评估血液生化及代谢参数¹³。因此，250 µL 的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL | 28 G ½  胰岛素注射器	BD	329424	用于尾静脉穿刺
0.5 mL | 30 G x 5/16 胰岛素注射器	BD	320468	用于阴茎静脉穿刺
250 L  含K2EDTA的Microtainer采血管	BD	365974
纱布敷料	Curity	6939
异氟烷自动流量麻醉机	E-Z Systems	EZ-190F	用于阴茎静脉穿刺
异氟烷，USP级	Patterson Veterinary	1403-704-06	用于阴茎静脉穿刺
麻醉用鼻罩	World Precision Instruments	EZ-112	用于阴茎静脉穿刺
啮齿类动物固定锥形管	Harvard Apparatus	ST2 52-95-86	用于尾静脉穿刺
小型动物加热手术台（可调节）	Peco Services Ltd	69023
Webcol 酒精消毒片	Simply Medical	5110