使用富集微球与有限消化相结合的宿主细胞蛋白分析

宿主细胞蛋白 （HCP） 是从宿主生物体的细胞培养物中释放出来并与单克隆抗体 （mAb^{） 共}纯化的杂质1,2,3,4。痕量HCPs会^{对药品的质量}产生负面影响5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15，因此^，需要一种灵敏的HCP分析方法来检测亚ppm至ppm水平的HCP。

正交方法可用于检测低丰度的 HCP。酶联免疫吸附测定 （ELISA） 通常用于定量整体 HCP，如果有相应的抗体，它也可以检测和定量单个 HCP¹⁶。然而，HCP特异性抗体的生产既费时又费力。相比之下，液相色谱-质谱联用（LC-MS）可以提供有关单克隆抗体药物产品中单个HCP的全面信息，并广泛用于HCP鉴定4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20^， 21、22、23、24、²⁵、^26、27。

已经开发了几种使用 LC-MS/MS 检测 HCP 的方法，包括有限酶切²⁰、过滤¹⁷、蛋白 A 缺失²¹、免疫沉淀 （IP） 和 ProteoMiner 富集 （PM）¹⁸。大多数方法旨在减少mAb的用量，并在LC-MS/MS分析之前富集HCP，从而减小mAb肽和HCP肽之间的动态范围。该协议提出了一种蛋白质组学样品富集方法，该方法结合了 ProteoMiner 技术和有限消化 （PMLD）²⁸。ProteoMiner 富集原理涉及使用市售的蛋白质组富集微球，其中包含多种组合肽配体库。这些配体特异性地与抗体药物产品上的蛋白质结合，从而去除多余的分子，同时将低丰度宿主细胞蛋白 （HCP） 集中在它们各自的亲和配体上。另一方面，有限消化的原理涉及使用低浓度的胰蛋白酶。该浓度足以消化低丰度的HCP，但不足以消化所有抗体药物产品。这种方法能够从溶液中回收和富集消化的HCP肽。

与过滤方法相比，PMLD技术不受检测到的HCPs大小的限制¹⁷。蛋白 A 缺失方法特异性地检测与抗体相关的 HCP²¹，而免疫沉淀仅限于来自特定细胞系（例如中国仓鼠卵巢 （CHO） 细胞系）的预定义 HCP，其中产生抗 HCP 抗体⁴。相比之下，PMLD可用于检测来自任何药物模块的HCP，以及与来自不同细胞系的药物产品共同纯化的宿主细胞蛋白。此外，与上述方法相比，PMLD 表现出更好的灵敏度¹⁷、^18、20、^21、24。

这种方法可以将HCP浓度富集7000倍，并将检测限降低到0.002 ppm²⁸。实验设置如图 1所示。

协议中使用的缩写列于 补充表1中。

1. 溶液和缓冲液的制备

注:所有试剂的商业细节均列在 材料表中。

1. 通过将 1 mL 的 1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入玻璃小瓶中的 9 mL 去离子水中，制备 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液，并通过涡旋充分混合。在4°C下储存长达3个月。
2. 通过将 10 mg SDC 溶解在 1 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中来制备 24 mM 脱氧胆酸钠 （SDC）。
3. 通过将 7 mg SLS 溶解在 1 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，制备 24 mM 月桂酰肌氨酸钠 （SLS）。
4. 通过以 1:1 （v/v） 的比例混合 24 mM SDC 和 24 mM SLS 来制备洗脱缓冲液。
5. 通过将 400 μL 去离子水加入 20 μg 胰蛋白酶中来制备 50 ng/μL 胰蛋白酶溶液。
6. 通过将 308 μL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入 7.7 mg DTT 中，制备 25 mg/mL 二硫苏糖醇 （DTT）。
7. 通过将 1.2 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入 56 mg IAM 中，制备 0.25 M 碘乙酰胺 （IAM）。
8. 通过将 1 mL 三氟乙酸 （TFA） 加入 9 mL 去离子水中来制备 10% TFA。涡旋 4 秒并向下旋转。在4°C下储存长达3个月。
9. 通过将 1 mL 10% TFA 加入 99 mL 去离子水中来制备缓冲液 A。
10. 通过将 1 mL 10% TFA 和 49 mL 去离子水加入 50 mL 乙腈 （ACN） 中来制备缓冲液 B。
11. 通过将 37 mg L-组氨酸和 54.8 mg L-组氨酸一水合物加入 50 mL 水中，制备 10 mM 组氨酸缓冲液。

2. 单克隆抗体（mAb）溶液的制备

1. 对于浓度高于 50 mg/mL 的药品，在 2 mL 微量离心管中用去离子水稀释 15 mg 单克隆抗体 （mAb）（参见 材料表），总体积为 300 μL，最终 pH 值为 ~6。如有必要，使用乙酸或Tris-HCl调节pH值。
2. 对于浓度低于 50 mg/mL 的药品，请按照步骤 2.2.1 至 2.2.5 进行缓冲液置换。
   1. 将每个样品的20mg转移到10k离心过滤装置（参见 材料表）中，并以14,000× g 离心25分钟（室温，RT），直到剩余约100μL体积。
   2. 将 350 μL 10 mM 组氨酸（参见 材料表）、pH 6.0 缓冲液加入过滤器中，涡旋并在室温下以 14,000 x g 离心 25 分钟。 重复一次。
   3. 倒置过滤器并将其放入样品收集管中，然后在室温下以1000× g 离心样品5分钟，以检索收集管中的全部体积。用 200 μLof 10 mM 组氨酸缓冲液洗涤过滤器并上下移液以回收任何剩余的蛋白质样品。将整个溶液转移到同一个收集管中，涡旋并向下旋转。
   4. 通过NanoDrop测量样品浓度。在与富集珠孵育之前，通过添加组氨酸缓冲液将每个蛋白质样品的浓度调节至 50 mg/mL。
   5. 将 300 μL 样品转移到 2 mL 微量离心管中。

3. 蛋白质组富集微球的制备

1. 从商业蛋白质富集试剂盒获得的每个离心柱上取下顶盖和底盖（参见 材料表）。不要丢弃盖子，因为它们稍后会用到。
2. 取离心柱并将其放置在不带盖的 2 mL 微量离心管中。在室温下以1,000× g 离心30-60秒，以消除储存溶液。处理在此步骤中收集的材料。
3. 将 200 μL 洗涤缓冲液加入市售富集珠中（参见 材料表），并上下移液数次。将离心柱置于 2 mL 微量离心管中，并在室温下以 1,000 x g 离心 30-60 秒以除去缓冲液。丢弃收集的材料。
   注:洗涤缓冲液包含在商业蛋白富集试剂盒中。
4. 重复步骤 3.3 两次。
5. 更换底盖并加入 200 μL 水，然后更换顶盖。

4. 蛋白质富集

1. 上下移液（从步骤3.5开始），并将40μL浆液转移到步骤2中制备的样品中。在室温下孵育并旋转试管2小时。
2. 使用 16 G 针头制作带有筛板的吸头（参见 材料表）以获得合适的筛板尺寸，然后将其插入 200 μL 吸头的尖端。
3. 将带有珠子的样品转移到步骤4.2中制备的尖端。用 2 mL 微量离心管以 200 x g 离心 3 分钟，在室温下除去溶液。
4. 通过向吸头中加入 200 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子，并用 2 mL 微量离心管以 200 x g 在室温下离心 2 分钟以除去洗涤溶液。重复该步骤两次。
5. 通过向吸头加入 200 μL 水来洗涤珠子，并在室温下用 2 mL 微量离心管以 200 x g 离心吸头 2 分钟以除去水分。
6. 通过向吸头中加入 10 μL 洗脱缓冲液（步骤 1.4）从珠子中洗脱蛋白质，并将浆液移液在吸头中移液 10 次，以确保珠子被洗脱缓冲液浸泡。
7. 在室温下用新的 0.5 mL 微量离心管以 200 x g 离心吸头 30 秒以收集洗脱液。重复步骤4.6-4.7两次，并将所有洗脱液合并到一个0.5mL微量离心管中。
8. 将1.5μL胰蛋白酶溶液（步骤1.5）加入洗脱液中，在28°C下过夜消化。 加入1.5μL的25mg / mL DTT（步骤1.6），并在90°C下加热样品20分钟。
9. 加入1.5μL的0.25M IAM（步骤1.7），并在室温下在黑暗中孵育20分钟。 加入3.5μL 10%TFA（步骤1.8），涡旋2分钟，并确保pH值为~2-3。
10. 在室温下以 14,400 × g 离心 10 分钟以沉淀 SDC 和 SLS。收集上清液进行脱盐。
11. 按照以下步骤进行脱盐。
    1. 向 GC 脱盐吸头中加入 50 μL 缓冲液 B（步骤 1.10）（参见 材料表）。在室温下用支架以1000× g 离心吸头3分钟。 丢弃收集的材料。
    2. 向吸头中加入 50 μL 缓冲液 A（步骤 1.9）。在室温下用支架以1000× g 离心吸头3分钟。 丢弃收集的材料。
    3. 将酸化样品添加到吸头中。在室温下用支架以500× g 离心吸头6分钟。
    4. 通过向吸头中加入 50 μL 缓冲液 A 来清洗吸头。在室温下用支架以500× g 离心吸头3分钟。 丢弃收集的材料。重复一次。
    5. 通过向 GC 脱盐尖端加入 50 μL 缓冲液 B，从尖端洗脱肽。在室温下用新管以500× g 离心3分钟。重复该步骤一次并合并洗脱液。
    6. 用真空浓缩器干燥洗脱液（参见 材料表）。
12. 将干燥的洗脱液重悬于 30 μL 0.1% 甲酸 （FA） 溶液中。
13. 用分光光度计测量肽混合物在214nm处的UV（参见 材料表）。肽混合物的浓度应在 0.1 至 0.5 mg/mL 之间。
14. 将 10 μL 每个消化样品转移到 LC 样品瓶中，然后将 1 μg 每个消化样品注入纳米 LC-MS/MS 中（参见 材料表）。按照步骤 5 执行分析。将其余消化的样品储存在-80°C冰箱中。

5. 纳米LC-MS/MS分析

1. 将肽混合物注入与质谱仪偶联的纳米LC系统中。将肽混合物（~1μg）加载到 具有表1A 中提供的梯度的C18捕获柱上进行脱盐，然后在40°C下加载到C18分析柱上进行分离。
   注:流动相A缓冲液由0.1%FA的超纯水溶液组成，流动相B由0.1%FA的80%乙腈溶液组成。
2. 分离肽，并以 表1B 中提供的梯度洗脱，流速为250nL/min。
   注:质谱仪在数据相关模式（DDA）下运行，循环时间为3秒。离子通过高能碰撞解离 （HCD） 发生碎裂，每次完整 MS 扫描的归一化碰撞能量为 30%。扫描分辨率为60,000，自动增益控制（AGC）目标为3e6，最大注入时间为20 ms，m/z范围为380-1600。MS/MS事件的分辨率为15,000，AGC目标为1e5，最大进样时间为60 ms，m/z范围为200-2000。排除持续时间设置为 45 秒。离子源属性见表 1C，具体质谱参数见 表2A-F。

6. 数据分析

1. 根据 UniProt mus+musculus 数据库²⁹ 搜索 NISTmAb 质谱原始文件。此外，在 UniProt Cricetulus Griseus 数据库³⁰ 中搜索重组蛋白加标 mAb DS 质谱原始文件。
   注:这些搜索是在Proteome Discoverer软件（见 材料表）中使用Sequest HT和Mascot搜索引擎进行的。使用的数据库没有冗余条目。
2. 对于质谱搜索，应用10 ppm的质量公差，并将片段质量公差设置为0.02 Da。
   注:检索标准包括半胱氨酸残基的静态脲甲基化（+57.0214 Da）和蛋氨酸残基氧化的可变修饰（+15.9949 Da）。此外，还应用了脱氨的可变修饰（+0.984 Da）。
3. 使用胰蛋白酶消化进行数据库搜索，最多允许两个遗漏的切割。将蛋白质和肽的误发现率设置为 0.01。
   注:为了明确鉴定宿主细胞蛋白 （HCP），至少需要两种独特的肽。 表 3 提供了通过 Proteome Discoverer 软件分析的与 NIST mAb 相关的已鉴定 HCP 的代表性摘要。

该协议提供了一种样品制备工作流程，称为蛋白质富集与有限消化（PMLD）相结合，用于分析单克隆抗体（mAb）样品中的宿主细胞蛋白（HCP）。图 1 说明了 PMLD 的分步过程。研究人员比较了使用直接消化（如图 2 顶部面板所示）和 PMLD（如图 2 底部面板所示）的 HCP 分析结果。总离子色谱图（TIC）图谱表明，PMLD显著减少或消除了主要的mAb肽，同时可以观察到一些与mAb肽相当的HCP肽。提供了纳米LC（表1）和MS/MS（表2）分析的详细参数。此外，表3还汇总了与NIST单克隆抗体相关的已鉴定HCP，包括种质号、HCP名称、物种、覆盖率、PSM、独特肽、分子量、预期等电点（pI）、Mascot评分、Sequest HT评分以及Mascot和Sequest HT鉴定的肽数等信息。

图 1:蛋白质富集与有限酶切 （PMLD） 相结合的样品制备工作流程。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:NIST mAb HCP 分析的总离子色谱图 （TIC） 图。上图:使用直接酶切对 NIST mAb 进行 HCP 分析的 TIC 曲线。下图:使用 PMLD 对 NIST mAb 进行 HCP 分析的 TIC 曲线。从TIC图中可以明显看出，与直接酶解相比，大多数主要的mAb肽在PMLD后已经减少或消除，而一些属于HCP的肽可以观察到，并且与mAb肽相当。请点击这里查看此图的较大版本.

表1:nano LC的参数。 （A）加载泵梯度。（B）NC泵梯度。（C） 离子源特性。 请按此下载此表格。

表 2:MS/MS 的参数。 （A） 全扫描属性。（B） MIPS特性。（C） 强度特性。（D） 电荷状态属性。（E） 动态排除。（F） 与数据相关的 MS2 扫描属性。 请按此下载此表格。

表 3:通过 Proteome Discoverer 软件分析的与 NIST mAb 相关的已鉴定 HCP 的代表性汇总表。 该表包括种令号、HCP名称、物种、覆盖率、肽谱匹配数（PSM）、独特肽数、分子量、预期等电点（pI）、Mascot评分、Sequest HT评分以及Mascot和Sequest HT鉴定的肽数等信息。 请按此下载此表格。

补充表1:使用的缩略语列表。请按此下载此表格。

作者没有相互竞争的经济利益。