使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑

摘要

本研究提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方案，并描述了分析正畸牙齿移动过程中牙槽骨重塑的方法，从而揭示了骨骼机械生物学。

摘要

牙槽骨，周转率高，是人体重塑最活跃的骨骼。正畸牙齿移动 （OTM） 是一种常见的人工过程，即响应机械力进行牙槽骨重塑，但其潜在机制仍然难以捉摸。由于动物模型相关的限制，以往的研究无法揭示任何时间和空间骨重塑的确切机制。信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 在骨代谢中很重要，但其在 OTM 期间成骨细胞中的作用尚不清楚。为了提供 体内 证据证明 STAT3 在特定时间点参与 OTM，特别是在 OTM 期间参与细胞，我们生成了他莫昔芬诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠模型，施加正畸力，并分析牙槽骨表型。

显微计算机断层扫描（Micro-CT）和立体显微镜用于访问OTM距离。组织学分析选择位于上颌骨横截面第一磨牙（M1）三个根部内的区域作为感兴趣区域（ROI），评估成骨细胞和破骨细胞的代谢活性，表明正畸力对牙槽骨的影响。简而言之，我们提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠来研究正畸力下的骨重塑的方案，并描述了分析 OTM 期间牙槽骨重塑的方法，从而为骨骼机械生物学提供了新的思路。

引言

众所周知，根据沃尔夫定律^1,2，^骨骼在一生中不断进行重建^，以响应机械力。适当的机械刺激，如重力和日常锻炼，通过刺激成骨细胞和破骨细胞来维持骨量和力量，并防止骨质流失。负责骨吸收的破骨细胞 3,4,5,6,7 和负责骨形成的成骨细胞 8,9,10 维持骨稳态并在骨重塑的生物过程中共同发挥作用。相反，在没有负荷刺激的情况下，如宇航员在长期微重力下，骨骼会遭受 10% 的骨密度损失，从而增加骨质疏松症的风险^11,12。此外，非侵入性和方便的机械疗法，包括正畸和牵张成骨术，已成为骨骼疾病的治疗方法^13,14。所有这些都表明，机械力在维持骨骼质量和数量方面起着至关重要的作用。最近的研究通常使用耗时的模型（例如跑轮和尾部悬架测试）分析响应机械负载的骨骼重塑，这些模型通常需要 4 周或更长时间来模拟力加载或卸载^15,16。因此，需要一种方便高效的动物模型来研究受力载荷驱动的骨重塑。

牙槽骨在骨重塑方面最为活跃，周转率高¹⁷。牙齿正畸移位 （OTM） 是咬合不正的常见治疗方法，是一种响应机械力的牙槽骨重塑的人工过程。然而，与其他实验周期较长的模型相比，诱导快速骨重塑^的OTM18也是一种节省时间的研究机械力对骨重塑影响的方法。因此，OTM是研究机械刺激下骨重塑的理想模型。值得注意的是，牙槽骨重塑的机制往往具有时效性，需要观察建模后某些时间点牙槽骨重塑的变化。具有DNA重组的时空调控和组织特异性的双重优势，诱导条件基因敲除小鼠模型是OTM研究的合适选择。

传统上，OTM介导的牙槽骨重塑分为涉及骨形成的张力区和涉及骨吸收的压力区19,20,21^，这更详细但难以调节。此外，Yuri 等人报告说，OTM 中的骨形成时间在拉伸和压缩侧不同²²。此外，先前的一项研究表明，第一磨牙可以在正畸力下启动上颌牙槽骨的广泛重塑，而正畸力不受张力和压力区的限制²³。因此，我们选择位于上颌骨横截面 M1 三个根部内的区域作为感兴趣区域 （ROI），并描述了评估同一区域成骨细胞和破骨细胞活性的方法，以评估 OTM 下的牙槽骨重塑。

作为一种核转录因子，信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 已被证明在骨稳态中至关重要^24,25。先前的研究报道了 Stat3 突变小鼠的低骨密度和复发性病理性骨折^26,27。我们之前的研究表明，Osx⁺ 成骨细胞中 Stat3 的缺失会导致颅面畸形和骨质疏松症，以及自发性骨折²⁸。最近，我们提供了诱导型成骨细胞特异性 Stat3 缺失小鼠模型 （Col1α2^CreERT2;Stat3 fl^/fl，以下称为 Stat3^{Col1α2ERT2），STAT3} 在介导正畸力驱动牙槽骨重塑的影响中至关重要²⁹.在这项研究中，我们提供了使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方法和方案，并描述了分析 OTM 过程中牙槽骨重塑的方法，从而阐明骨骼力学生物学。

方案

本文所述涉及动物的所有方法均经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会（第82101048号）批准。

1. 建立诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠

注: Stat3 fl^/fl小鼠是商业获得的; Col1α2^CreERT2菌株是一份礼物（详见 材料表 ）。为所有动物提供标准化的实验室颗粒食物和水以及标准的实验室环境条件（室温为22°C至26°C，湿度为50%-55%）。

1. 将一只性成熟的雄性小鼠和两只雌性小鼠放在同一个笼子里。18 天后，每天检查新生儿。将任何怀孕的雌性小鼠移到空笼子中，必要时单独饲养它们。如果雌性小鼠在30天内未怀孕，则将雄性小鼠放入其他不同的繁殖笼中。
2. 生成 Stat3^fl/+;通过将 Stat3 fl^/fl 小鼠与 Col1α2 ^CreERT2 小鼠杂交来 Col1α2 ^CreERT2 小鼠;将所有这些小鼠保持在C57BL / 6背景上。收集 2-5 mm 尾尖进行基因分型，并保持雄性 Stat3^fl/+;Col1α2^CreERT2 小鼠直到它们性成熟 （F1）。
3. 杂交 6 周龄雄性 Stat3^{fl/ +};Col1α2^CreERT2 小鼠与雌性 Stat3 fl^{/ fl} 小鼠。当小鼠2周龄时收集2-5毫米尾尖进行基因分型，并保持雄性 Stat3 fl^{/ fl}; Col1α2^CreERT2（Stat3^Col1α2ERT2）小鼠，直到它们性成熟（F2）。
4. 杂交 6 周龄雄性 Stat3 fl^{/ fl};Col1α2^CreERT2 小鼠与雌性 Stat3 fl^/fl 小鼠 （F3）。当小鼠2周龄时收集2-5毫米尾尖进行基因分型，并在适当时使用相同基因型的年轻小鼠替换较老的繁殖小鼠（F3 + N）。
   注意:小鼠的繁殖能力在8个月大后下降，因此必须仔细监测繁殖笼中的小鼠，并根据需要进行更换。此外，根据实验要求，应适当增加繁殖笼的数量，以避免目标基因小鼠灭绝。

2. 他莫昔芬诱导表达 Col1α2 的成骨细胞中 Stat3 的缺失

1. 在离心管中将他莫昔芬溶解在玉米油中至20mg / mL，并用箔纸包裹避光。将铝箔覆盖的离心管放在旋转混合器上，在室温下混合直至完全溶解。
   注:他莫昔芬是商业获得的，并在4°C的黑暗中储存。
2. 选择10只6周龄雄性小鼠，将它们分为Stat3 fl ^{/ fl}和Stat3 ^Col1α2ERT2组，每组5只小鼠。他莫昔芬（100 mg·^kg-1·bw）每2天一次，腹腔注射1周。

3. 正畸牙齿移动 （OTM） 模型

1. 准备一个灭菌的塑料小鼠解剖平台作为手术台，以固定小鼠。
   注:小鼠解剖台是商业获得的，由四个可调节的橡胶柱和一个用于固定小鼠的金属棒组成。在整个手术过程中使用无菌器械和工具。
2. 在每个橡胶柱上系上松紧带以固定肢体。
3. 在两个上部橡胶柱之间系上一条松紧带;将一根线系在松紧带上以固定下切牙;并将另一根线系在金属杆上以固定上门牙。
4. 术前腹腔注射用0.1mL盐酸右美托咪定（0.1mg·kg-1·bw）和唑来地尔（盐酸替他明20mg·kg-1·bw和盐酸唑拉西泮20mg·^kg-1·bw）溶于盐水中的溶液麻醉7周龄雄性小鼠。确保小鼠在整个手术过程中处于适当的麻醉状态。
   注意:注意药品的有效使用日期，不要使用过期药品。
5. 通过用手指挤压后肢的脚趾来确认小鼠处于适当的麻醉状态。
   注意:如果小鼠对测试没有反应，则意味着它们失去知觉并且麻醉已达到所需的深度。此时，小鼠处于肢体肌肉松弛状态，呼吸和心率平稳，可以开始手术。
6. 在小鼠的眼睛上使用兽医软膏以防止干燥，并将麻醉的小鼠置于手术台上的仰卧位。使用橡胶柱上的四根松紧带固定四肢，一根线连接到金属棒上以固定上门牙，另一根连接到两根上橡胶柱之间的松紧带以钩住下门牙以保持下颌张开。
7. 准备闭合螺旋弹簧（0.25 毫米线径，直径 0.76 毫米，长度 1 毫米）用于正畸力矫治器。
   注意: 为每只鼠标剪下八根弹簧线。中间有四根长度为 1 毫米的螺纹用于受力器具，两端各有两根螺纹，用于使用钢结扎线进行结扎。
8. 将弹簧的一端结扎到上颌骨左第一磨牙。用Q-tip在门牙上涂上粘合剂后，用0.1mm的钢结扎线将另一端绑扎到中切牙上，用光固化修复树脂加固，产生10g的稳定力，用测力计测量。
9. 完成手术后，将小鼠与其他相同品系的小鼠一起放入笼子中，或将每只小鼠单独放入空笼中。确保小鼠在手术后2-4小时恢复足够的意识以保持胸骨卧位之前不会无人看管。在接下来的几天里，给小鼠喂食软食并定期观察，以确保没有并发症发生并确定术后疼痛的程度;根据需要给予镇痛药。
   注意:在完全康复之前，接受过手术的小鼠不应返回其他小鼠的陪伴。不要让术后小鼠与未麻醉的小鼠一起恢复。小鼠在恢复期间必须保持温暖。
10. 每天检查正畸矫治器，排除任何移位的实验小鼠。

4. 标本采集

1. 通过颈椎脱位在三个不同的时间点对小鼠实施安乐死:OTM开始后4天（d4），7天（d7）和10天（d10）。
2. 用眼科剪刀将皮肤从颈部垂直切下，然后将头部与身体分开，并解剖头部的整个皮肤。
3. 切除从双侧口鳃口肌到下颌骨后部区域的皮肤和颊肌。完全断开颊肌和附着在喙突上的肌腱，以去除下颌骨并修剪多余的骨头以获得完整的上颌骨。然后，去除双侧第三磨牙后面的骨头，撕下腭粘膜。最后，断开正畸矫治器，沿腭正中缝合线切断切牙之间的骨头，得到左右两侧的牙槽骨。
   注意: 确保从门牙到第三磨牙的区域两侧保持完整。

5.石蜡切片的准备

1. 固定:将收获的牙槽骨浸入4%多聚甲醛中48小时，并在通风橱中用眼科剪刀修剪第6节和第7节。
2. 脱钙:用1x PBS轻轻洗涤标本3 x 10分钟。在通用组织固定剂（pH 8.0）中脱钙标本，每2天用新鲜溶液更换一次，持续5周，直到骨头可以很容易地被针尖穿透。
3. 脱水:在1x PBS中洗涤标本3 x 10分钟，然后依次将其浸入95%乙醇，100%乙醇和二甲苯中，每个溶液2 x 1小时。
4. 将样品浸入二甲苯和石蜡的1:1混合物中30分钟，然后在65°C下浸入石蜡中过夜。
5. 包埋:选择合适的包埋槽。将牙槽骨均匀放置，牙齿朝上在同一水平。从包埋槽中取出标本并将其转移到-20°C冰箱中，然后在石蜡完全冷却和固体时对它们进行编号。
6. 使用切片机，在横向平面上连续切割20至40个4μm厚的切片，并漂浮在37°C的水面上。将切片粘附在显微镜载玻片上，并在42°C下烘烤过夜。

6. OTM距离测量

1. 通过立体显微镜从咬合平面垂直拍摄三个时间点的标本。
2. 用Micro-CT扫描仪扫描牙槽骨。按照制造商的说明，使用扫描仪的支持软件重建上颌牙槽骨最大矢状面的 3D 图像，其中三颗臼齿完全可见。
3. 使用 ImageJ 软件测量 OTM 距离:
   1. 打开 ImageJ 软件并使用 直线工具 创建已知距离的线段。
   2. 单击 "分析 "（Analyze），然后选择 "设置比例"（Set Scale ），在"已知距离"（ Known distance ） 中输入绘制的线距离值，并在"长度单位"（ Unit of length） 中输入单位。
   3. 在 M2 的近中边缘脊的中点和 M1 的远端边缘脊之间画一条线，然后单击 测量。"长度"列中显示的结果表示 OTM 距离。

7. 组织学分析

1. 感兴趣区域 （ROI） 选择:将第一磨牙 （M1） 的牙槽骨定义为 ROI，正好位于上颌骨横截面 M1 的三个根内。该区域不仅在颊舌方向到达第一磨牙的皮质骨，而且还延伸到近颊根长轴的中部，包括远颊根和腭根之间的半区域。
2. 成骨分析
   1. 钙黄绿素和茜素红双标记分析
      1. 钙黄绿素和茜素红制剂:将钙黄绿素溶解在 2% NaHCO₃ 溶液中至 1 mg/mL 中，将茜素红 S 溶解在 H 2 O 至₂mg/mL 中。
         注:在这项研究中，钙黄绿素和茜素红是商业获得的。
      2. OTM 开始后，在第 1 天通过腹腔注射给予钙黄绿素 （20 mg·kg-1·bw），在第 8 天给予茜素红 S （40 mg·^kg-1·bw）。在第10天对小鼠实施安乐死并收获肺泡骨。
      3. 按照步骤 5.1 和 5.3-5.5 准备标本并嵌入它们。有关详细信息，请参阅 Yang et ^al.30。
      4. 使用旋转切片机，在横向平面上连续切割5μm厚的切片。将切片粘附在显微镜载玻片上，并使用中性香脂用盖玻片安装。
         注意:其余样品必须在室温下用干燥剂储存。
      5. 在荧光显微镜下检查和拍摄切片，并根据前面描述的方法计算矿物质吸收率（MAR）和骨形成率（BFR / BS）³⁰。
   2. 免疫荧光
      1. 选择合适的石蜡切片，在65°C烘烤30分钟。
      2. 脱蜡:将切片浸入二甲苯中5分钟，每次用新鲜二甲苯重复两次。
      3. 再水化:将切片依次浸入95%乙醇，75%乙醇，50%乙醇和ddH₂O中，每次浸泡5分钟。
      4. 用1 x PBS轻轻洗涤切片2 x 5分钟。
      5. 抗原修复:将切片浸入Tris-HCl（0.05M，pH 8.0），EDTA（0.01M，pH 8.0）和蛋白酶K（10μg/ mL）的混合物中ddH₂O中，并在37°C下孵育15分钟。
      6. 用 1 x PBS 轻轻洗涤切片 3 x 5 分钟。
      7. 阻塞:从切片中去除多余的液体，并使用疏水性记号笔在目标区域周围画一个圆圈。为了阻断非特异性结合，用含有10%牛血清白蛋白的封闭缓冲液覆盖，并在室温下孵育1小时。
         注意: 注意不要将切片干燥太久，以免影响结果。
      8. 一抗孵育:用抗体稀释液将抗骨桥蛋白（OPN）抗体稀释至推荐浓度，每个样品中加入30-50μL;在加湿室中在4°C孵育过夜。
         注意:务必在腔室中留下一些水并盖上盖子，以防止抗体液蒸发。
      9. 用1 x PBS轻轻洗涤切片3 x 10分钟。
         注意:步骤 7.2.2.10-7.2.2.12 应在黑暗中执行。
      10. 荧光二抗孵育:选择与一抗相对应的合适荧光二抗，稀释至推荐浓度。向每个样品中加入30-50μL，并在室温下孵育1小时。
      11. 用1 x PBS轻轻洗涤切片2 x 10分钟。
      12. 使用含有 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的抗淬灭封固剂封片试样。将这些部分存放在黑暗中并尽快拍照。
      13. 使用数码相机进行荧光显微镜检查和拍照切片，并对感兴趣区域 （ROI） 中的阳性细胞进行计数。
3. 破骨细胞生成分析
   1. 抗酒石酸盐酸性磷酸酶 （TRAP） 染色
      1. 选择合适的石蜡切片。按照步骤7.2.2.1-7.2.2.3进行脱蜡和再水化。
      2. 根据制造商的说明，使用 TRAP 染色试剂盒制备新鲜染色溶液，并预热至 37°C。
      3. 向每个样品中加入30-50μL染色溶液，并在37°C下在加湿室中孵育20-30分钟。每 5 分钟检查一次，直到在光学显微镜下看到红色多核破骨细胞。用ddH2O终止反应。
      4. 在苏木精溶液中复染30秒，在1%氨溶液中浸泡1分钟，使蓝色稳定。用缓慢流动的自来水冲洗。
      5. 使用中性香脂用盖玻片安装切片并干燥过夜。
      6. 在显微镜下拍摄照片，并按照我们之前的方案³⁰计算具有三个以上细胞核的TRAP阳性细胞的数量。
   2. 免疫荧光:使用推荐浓度的组织蛋白酶K（CTSK）抗体进行免疫荧光，并遵循上述第7节中描述的方案。

结果

使用该协议，我们建立了诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠 （Stat3^Col1α2ERT2） 模型，以检查 STAT3 缺失对正畸力驱动的牙槽骨重塑的影响（图 1A、B）。通过牙槽骨的免疫荧光染色证实成骨细胞中的STAT3缺失（图1C）。

立体显微镜检查显示，WT小鼠在d4、d7和d10处的OTM距离增加。然而，在 Stat3^Col1α2ERT2 小鼠中，OTM距离减小（图2B）。d10 的显微 CT 分析也证实了这一现象，表明成骨细胞 Stat3 缺失使 OTM 减速（图 2C）。

对于组织学分析，位于上颌骨横切面M1三个根内的区...

讨论

由于咬合不正是影响呼吸、咀嚼、说话甚至外观的最常见口腔疾病之一，因此对正畸的需求与日俱增，发病率从 70% 上升到 93%，根据之前的流行病学调查^31,32。如何加速牙槽骨重塑，安全地提高正畸治疗效率，成为该领域的热点话题;因此，有必要阐明OTM驱动的牙槽骨重塑机制。在以往的研究中，研究人员利用体内药物注射来研究动物模型中OTM的机制^21,33，简单易行^，但很难排除药物对其他系统细胞的影响。因此，研究体内正畸力下骨重塑的机理十分必要。

近年来，基因敲除小鼠得到了广泛的应用，为基因功能的研究和治疗靶点的探索提供了坚实的基础³⁴。在这些技术中，全基因敲除技术是最早的方法。采用Adrb2-^/- 肾上腺素能受体（Adrb2）敲除小鼠模型探讨交感神经系统在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	北京 Solarbio Science &科技有限公司	P1020
4% 多聚甲醛	武汉服务生物科技有限公司	G1101
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533
抗 CTSK 抗体	Santa Cruz	sc-48353
抗 OPN 抗体	R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯	AF808
钙黄绿素	Sigma-Aldrich	C0875
闭圈弹簧	创新材料和器件，中国上海	CS1006B
Col1α2CreERT2 小鼠			来自中国科学院上海生命科学研究院 Bin 周 的礼物。
盐酸右美托咪定	Orionintie Corporation， Orion Pharma 埃斯波工厂
EDTA	Beyotime Biotechanology	ST069
包埋罐	Citotest Labware Manufacturing Co.， Ltd	80106-1100-16
乙醇	国药化学试剂有限公司
ImageJ 软件	NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国
带有 DAPI	Beyotime Biotechanology	P0131
小鼠解剖平台	华科实验仪器和材料有限公司。	HK105
石蜡	桑贡生物科技有限公司
用于基因分型			Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA;Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA;Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG;Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
蛋白酶 K	Sigma-Aldrich	539480
自固化修复树脂	3M ESPE，美国明尼苏达州圣保罗	712-035
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co.， Ltd	D000527
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648
TRAP 染色试剂盒	Sigma-Aldrich	387A
Tris-HCl	Beyotime Biotechanology	ST780
通用型组织固定剂	武汉服务生物科技有限公司	G1105
甲苯	化学试剂有限公司
Zoletil	VIRBAC