使用可诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑

Yuanqi Liu; Siyuan Sun; Ziyi Jiang; Xinyi Gong; Yiling Yang; Yanfei Zhu; Hongyuan Xu; Anting Jin; Xiangru Huang; Xin Gao; Tingwei Lu; Jingyi Liu; Xinyu Wang; Qinggang Dai; Lingyong Jiang

doi:10.3791/65613

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方法文章

使用可诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑

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DOI：

10.3791/65613

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2023年7月21日

Yuanqi Liu^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Siyuan Sun^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Ziyi Jiang^*⁶ , Xinyi Gong¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Yiling Yang¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Yanfei Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Hongyuan Xu¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Anting Jin¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Xiangru Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Xin Gao¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Tingwei Lu¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Jingyi Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Xinyu Wang¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Qinggang Dai²^,³^,⁴^,⁵^,⁷ , Lingyong Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, ³National Center for Stomatology, ⁴National Clinical Research Center for Oral Diseases, ⁵Shanghai Key Laboratory of Stomatology, ⁶Shanghai Starriver Bilingual School, ⁷The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提供了一种利用可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠研究正畸力作用下骨重建的实验方案，并描述了分析正畸牙齿移动过程中牙槽骨重建的方法，从而为骨骼力学生物学研究提供新的视角。

摘要

牙槽骨具有很高的更新率，是体内活性最强的骨重建组织。正畸牙齿移动（OTM）是一种常见的牙槽骨重建人工过程，由机械力刺激引发，但其潜在机制仍不明确。由于动物模型的限制，以往研究无法在时间和空间上精确揭示骨重建的机制。信号转导及转录激活因子3（STAT3）在骨代谢中具有重要作用，但其在OTM过程中成骨细胞中的功能尚不清楚。为了提供STAT3在OTM特定时间点及特定细胞中参与作用的体内证据，我们构建了他莫昔芬诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠模型，施加正畸力后，分析了牙槽骨的表型变化。

采用微型计算机断层扫描（Micro-CT）和体视显微镜测量牙移动距离（OTM）。组织学分析选取上颌骨横截面上第一磨牙（M1）三个牙根之间的区域作为感兴趣区（ROI），以评估成骨细胞和破骨细胞的代谢活性，从而反映正畸力对牙槽骨的影响。简而言之，我们提供了一种利用可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠研究正畸力作用下骨重建的实验方案，并描述了分析OTM过程中牙槽骨重建的方法，从而为骨骼力学生物学研究提供了新的见解。

引言

众所周知，根据沃尔夫定律¹^,²，骨骼在一生中会持续不断地进行重建，以响应机械力的作用。适当的机械刺激（如重力和日常运动）可通过同时激活成骨细胞和破骨细胞来维持骨量和骨强度，并防止骨质流失。其中，负责骨吸收的破骨细胞³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷与负责骨形成的成骨细胞⁸^,⁹^,¹⁰共同参与骨重建这一生物学过程，联合维持骨的稳态与功能。相反，在缺乏负荷刺激的情况下（例如长期处于微重力环境的宇航员），骨骼会出现约10%的骨矿物密度下降，从而增加骨质疏松的风险¹¹^,¹²。此外，包括正畸治疗和牵张成骨在内的非侵入性且便捷的机械疗法，已逐渐成为治疗骨科疾病的方法¹³

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方案

本文所涉及的所有动物实验均经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准（编号：82101048）。

1. 建立可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠

注意：Stat3^fl/fl 小鼠为商业获取；Col1α2^CreERT2 小鼠品系为馈赠（详见材料表中的所有信息）。所有动物均给予标准化实验室颗粒饲料和饮水，并在标准实验室环境条件下饲养（室温 22 °C 至 26 °C，湿度 50%–55%）。

将一只性成熟的雄性小鼠与两只雌性小鼠共同置于同一笼中。18天后，每天检查是否有新生幼鼠。如有怀孕的雌性小鼠，将其移至空笼中单独饲养（必要时）。若雌性小鼠在30天内未怀孕，则将雄性小鼠转移至其他不同的繁殖笼中。
通过将Stat3^fl/fl小鼠与Col1α2^CreERT2小鼠杂交，获得Stat3^fl/+; Col1α2^CreERT2小鼠；所有小鼠均维持在C57BL/6遗传背景上。采集2–5 mm尾尖组织用于基因型鉴定，并保留性成熟雄性Sta....

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结果

利用本方案，我们建立了一种可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠模型（Stat3^Col1α2ERT2），用于研究STAT3缺失对正畸力诱导的牙槽骨重塑的影响（图1A，B）。通过牙槽骨免疫荧光染色证实了成骨细胞中STAT3的缺失（图1C）。

立体显微镜显示，野生型小鼠在第4天、第7天和第10天的正畸牙齿移动（OTM）距离增加。然而，在Stat3^Col1α2ERT2小鼠中，OTM距离减小（图2B）。Micro-CT分析在第10天也证实了这一现象，表明成骨细胞中Stat3基因的缺失减缓了OTM（图2C）。

在组织学分析中，将上颌骨横断面中.......

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讨论

错颌畸形是最常见的口腔疾病之一，会影响呼吸、咀嚼、言语甚至外观。根据既往流行病学调查，其发病率从70%上升至93%，因此人们对正畸治疗的需求与日俱增。³¹^,³²如何安全地加速牙槽骨重塑以提高正畸治疗效率已成为该领域的热点问题；因此，有必要阐明正畸牙齿移动（OTM）驱动的牙槽骨重塑机制。在以往的研究中，研究人员使用了体内通过药物注射研究动物模型中OTM的机制²¹^,³³，方法简单易行，但难以排除药物对其他系统细胞的影响。因此，深入研究正畸力作用下骨重建的机制具有重要意义体内.

近年来，基因敲除小鼠被广泛应用，为基因功能研究和治疗靶点的探索提供了坚实的基础³⁴。在这些技术中，全基因敲除技术是最早采用的方法。Adrb2^-/- 肾上腺素受体（Adrb.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分得到了中国国家自然科学基金（81870740、82071083、82271006、82101048、81800949）；上海市自然科学基金（21ZR1436900、22ZR1436700）；上海市学术/技术带头人计划（20XD1422300）；上海市申康医院发展中心临床研究计划（SHDC2020CR4084）；上海交通大学医学院附属第九人民医院跨学科研究基金（JYJC201902、JYJC202116）；上海市高水平地方高校创新团队项目（SSMUZLCX20180501）；上海交通大学医学院附属第九人民医院、上海交通大学医学院口腔学院研究学科基金（KQYJXK2020）；上海交通大学医学院附属第九人民医院原创探索项目（JYYC003）；上海交通大学医学院“双百人”计划项目；上海交通大学医学院生物材料与再生医学研究所合作研究项目（2022LHB02）；上海交通大学医学院附属第九人民医院生物样本库建设项目（YBKB201909、YBKB202216）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1× PBS	北京索莱宝科技有限公司 & Technology Co.,Ltd.	P1020
4% 多聚甲醛	武汉赛维尔生物科技有限公司	G1101
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533
抗CTSK抗体	Santa Cruz	sc-48353
抗OPN抗体	R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国	AF808
钙黄绿素	Sigma-Aldrich	C0875
闭合线圈弹簧	中国上海，创新材料与器件	CS1006B
Col1α2^CreERT2 小鼠			中国科学院上海生命科学研究院周斌惠赠
盐酸右美托咪定	Orionintie Corporation，Orion Pharma Espoo园区
EDTA	碧云天生物技术	ST069
包埋盒	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	80106-1100-16
乙醇	国药集团化学试剂有限公司	100092183
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国
含DAPI的封片剂	碧云天生物技术	P0131
小鼠解剖平台	上海华科实验设备与材料有限公司	HK105
石蜡	Sangon Biotech Co., Ltd.	A601889
基因分型引物			Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA；Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA；Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG；Cre R-CGCATAACCAGTGAAACAGC
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	539480
自凝修复树脂	3M ESPE，美国明尼苏达州圣保罗	712-035
Stat3^fl/fl 小鼠	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648
TRAP 染色试剂盒	Sigma-Aldrich	387A
Tris-HCl	碧云天生物技术	ST780
通用组织固定液	武汉赛维尔生物科技有限公司	G1105
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司	10023418
Zoletil	VIRBAC

参考文献

Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
Frost, H. M.

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