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使用可诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑

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DOI：

10.3791/65613

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2023年7月21日

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1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

通讯作者： Qinggang Dai <daiqinggang@126.com>, Lingyong Jiang <jianglingyong@sjtu.edu.cn>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提供了一种利用可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠研究正畸力作用下骨重建的实验方案，并描述了分析正畸牙齿移动过程中牙槽骨重建的方法，从而为骨骼力学生物学研究提供新的视角。

摘要

牙槽骨具有很高的更新率，是体内活性最强的骨重建组织。正畸牙齿移动（OTM）是一种常见的牙槽骨重建人工过程，由机械力刺激引发，但其潜在机制仍不明确。由于动物模型的限制，以往研究无法在时间和空间上精确揭示骨重建的机制。信号转导及转录激活因子3（STAT3）在骨代谢中具有重要作用，但其在OTM过程中成骨细胞中的功能尚不清楚。为了提供STAT3在OTM特定时间点及特定细胞中参与作用的体内证据，我们构建了他莫昔芬诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠模型，施加正畸力后，分析了牙槽骨的表型变化。

采用微型计算机断层扫描（Micro-CT）和体视显微镜测量牙移动距离（OTM）。组织学分析选取上颌骨横截面上第一磨牙（M1）三个牙根之间的区域作为感兴趣区（ROI），以评估成骨细胞和破骨细胞的代谢活性，从而反映正畸力对牙槽骨的影响。简而言之，我们提供了一种利用可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠研究正畸力作用下骨重建的实验方案，并描述了分析OTM过程中牙槽骨重建的方法，从而为骨骼力学生物学研究提供了新的见解。

引言

众所周知，根据沃尔夫定律1,2，骨骼在一生中会持续不断地进行重建，以响应机械力的作用。适当的机械刺激（如重力和日常运动）可通过同时激活成骨细胞和破骨细胞来维持骨量和骨强度，并防止骨质流失。其中，负责骨吸收的破骨细胞3,4,5,6,7与负责骨形成的成骨细胞8,9,10共同参与骨重建这一生物学过程，联合维持骨的稳态与功能。相反，在缺乏负荷刺激的情况下（例如长期处于微重力环境的宇航员），骨骼会出现约10%的骨矿物密度下降，从而增加骨质疏松的风险11,12。此外，包括正畸治疗和牵张成骨在内的非侵入性且便捷的机械疗法，已逐渐成为治疗骨科疾病的方法13,14。上述研究均表明，机械力在维持骨质量和数量方面发挥着关键作用。近期研究通常采用耗时较长的模型（如跑轮实验和尾部悬吊实验）来分析机械负荷对骨重建的影响，这些方法通常需要4周或更长时间才能模拟出力学加载或卸载的效果15,16。因此，亟需建立一种便捷且高效的动物模型，用于研究力学加载驱动下的骨重建过程。

牙槽骨在骨重建方面最为活跃，具有很高的 turnover rate17。正畸牙齿移动（OTM）是错𬌗畸形的常见治疗方法，是一种在机械力作用下人工诱导牙槽骨重建的过程。然而，与实验周期较长的其他模型相比，OTM 能够诱导快速的骨重建18，是研究机械力对骨重建影响的省时方法。因此，OTM 是研究机械刺激下骨重建的理想模型。值得注意的是，牙槽骨重建的机制通常具有时间敏感性，有必要在建模后的特定时间点观察牙槽骨重建的变化。由于可诱导的条件性基因敲除小鼠模型具有对 DNA 重组的时间和空间控制以及组织特异性的双重优势，是进行 OTM 研究的合适选择。

传统上，正畸牙齿移动（OTM）介导的牙槽骨改建被划分为张力区（涉及骨形成）和压力区（涉及骨吸收）19,20,21，这种划分更为详细，但调控较为困难。此外，Yuri 等人报道，在正畸牙齿移动过程中，张力侧和压缩侧的骨形成时间存在差异22。另外，既往研究已表明，第一磨牙在正畸力作用下可引发上颌牙槽骨的大范围改建，而不仅局限于张力区和压力区23。因此，我们选择上颌骨横截面上位于第一磨牙（M1）三个牙根范围内的区域作为感兴趣区（ROI），并描述了在同一区域内评估成骨细胞和破骨细胞活性的方法，以评价正畸牙齿移动过程中的牙槽骨改建情况。

作为一种核转录因子，信号转导子和转录激活子3（STAT3）已被证实对骨稳态具有关键作用24,25既往研究报道了低骨密度和反复发生的病理性骨折 Stat3-突变小鼠26,27我们之前的研究表明，缺失 Stat3 在 Osx+ 成骨细胞导致颅面畸形和骨质疏松，以及自发性骨折28最近，我们提供了 体内 可诱导的成骨细胞特异性证据 Stat3 基因敲除小鼠模型（Col1α2CreERT2Stat3fl/fl，此后称为 Stat3Col1α2ERT2) 表明STAT3在介导正畸力诱导牙槽骨重塑的作用中至关重要29本研究中，我们提供了使用可诱导成骨细胞谱系特异性方法与实验方案 Stat3 利用基因敲除小鼠研究正畸力作用下的骨重建，并描述在正畸牙齿移动过程中分析牙槽骨重建的方法，从而揭示骨骼力学生物学的机制。

方案

本文所涉及的所有动物实验均经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准（编号：82101048）。

1. 建立可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠

注意：Stat3fl/fl 小鼠为商业获取；Col1α2CreERT2 小鼠品系为馈赠（详见材料表中的所有信息）。所有动物均给予标准化实验室颗粒饲料和饮水，并在标准实验室环境条件下饲养（室温 22 °C 至 26 °C，湿度 50%–55%）。

  1. 将一只性成熟的雄性小鼠与两只雌性小鼠共同置于同一笼中。18天后，每天检查是否有新生幼鼠。如有怀孕的雌性小鼠，将其移至空笼中单独饲养（必要时）。若雌性小鼠在30天内未怀孕，则将雄性小鼠转移至其他不同的繁殖笼中。
  2. 通过将Stat3fl/fl小鼠与Col1α2CreERT2小鼠杂交，获得Stat3fl/+; Col1α2CreERT2小鼠；所有小鼠均维持在C57BL/6遗传背景上。采集2–5 mm尾尖组织用于基因型鉴定，并保留性成熟雄性Stat3fl/+; Col1α2CreERT2小鼠（F1代）。
  3. 将6周龄雄性Stat3fl/+; Col1α2CreERT2小鼠与雌性Stat3fl/fl小鼠杂交。在小鼠2周龄时采集2–5 mm尾尖组织进行基因型鉴定，并保留雄性Stat3fl/fl; Col1α2CreERT2（Stat3Col1α2ERT2）小鼠直至其性成熟（F2代）。
  4. 将6周龄雄性Stat3fl/fl; Col1α2CreERT2小鼠与雌性Stat3fl/fl小鼠杂交（F3代）。在小鼠2周龄时采集2–5 mm尾尖组织进行基因型鉴定，并根据需要适时用同基因型的年轻小鼠替换年老的繁殖小鼠（F3+N代）。
    注意：小鼠在8个月龄后繁殖能力下降，因此必须密切监测繁殖笼中小鼠的状态并及时更换。此外，根据实验需求，应适当增加繁殖笼数量，以避免目标基因型小鼠品系的丢失。

2. 通过他莫昔芬诱导删除表达 Col1α2 的成骨细胞中的 Stat3

  1. 在离心管中将他莫昔芬溶于玉米油，配制成20 mg/mL的溶液，并用铝箔包裹避光。将包有铝箔的离心管置于旋转混合仪上，室温下混合至完全溶解。
    注意： 他莫昔芬为市售品，于4 °C避光保存。
  2. 选取10只6周龄雄性小鼠，分为Stat3fl/fl 组和Stat3Col1α2ERT2 组，每组5只。通过腹腔注射给予他莫昔芬（100 mg·kg-1·bw），每2天一次，持续1周。

3. 正畸牙齿移动（OTM）模型

  1. 准备一个已灭菌的塑料小鼠解剖平台作为手术台，用于固定小鼠。
    注意：小鼠解剖台为市售产品，包含四个可调节的橡胶柱和一根金属杆，用于固定小鼠。整个操作过程中应使用无菌器械和工具。
  2. 在每个橡胶柱上安装弹性绑带，用于固定四肢。
  3. 在两个上方的橡胶柱之间系一根弹性绑带；将一根线系在该弹性绑带上以固定下门齿；另将一根线系在金属杆上以固定上门齿。
  4. 通过腹腔注射给予7周龄雄性小鼠0.1 mL盐水溶液，其中包含右美托咪定盐酸盐（0.1 mg·kg-1·bw）和赛拉嗪（替来他明盐酸盐20 mg·kg-1·bw和唑拉西泮盐酸盐20 mg·kg-1·bw），进行麻醉。确保小鼠在整个手术过程中保持适当的麻醉状态。
    注意：注意药物的有效期，切勿使用过期药物。赛拉嗪具有强效镇痛和外科麻醉作用。
  5. 通过手指轻捏后肢脚趾确认小鼠是否处于适当麻醉状态。
    注意：若小鼠对刺激无反应，则表明其已失去意识，麻醉深度已达到要求。此时小鼠表现为四肢肌肉松弛，呼吸和心率平稳，可开始手术操作。
  6. 在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止干燥，并将麻醉后的小鼠仰卧位放置于手术台上。使用四个橡胶柱上的弹性绑带固定四肢，一根线连接金属杆以固定上门齿，另一根线连接两个上方橡胶柱之间的弹性绑带并钩住下门齿，以保持下颌张开。
  7. 准备用于施加正畸力的闭合线圈弹簧（丝径0.25 mm，直径0.76 mm，长度1 mm）。
    注意：每只小鼠需准备八段弹簧。中间四圈（1 mm长度）用于施力装置，两端各两圈用于使用钢结扎丝进行结扎固定。
  8. 将制备好的弹簧一端结扎固定于上颌左侧第一磨牙，另一端使用0.1 mm钢结扎丝与中央门齿固定，并在用棉签对门齿进行粘接处理后，辅以光固化修复树脂加强固定，从而产生稳定的10 g力（通过测力计测量确认）。
  9. 手术完成后，将小鼠放入与其他同品系小鼠共用的笼中恢复，或单独放入空笼中。确保小鼠在术后2−4小时内恢复足够意识、能够维持胸卧位之前不得无人看管。术后数天内给予软质饲料喂养，并定期观察，确保无并发症发生，评估术后疼痛程度；必要时给予镇痛药物。
    ​注意：接受手术的小鼠在完全恢复前不应与其他小鼠合笼。切勿将术后小鼠与未麻醉小鼠共同恢复。恢复期间必须保持小鼠体温。
  10. 每天检查正畸装置，剔除任何发生装置脱落的实验小鼠。

4. 标本采集

  1. 在开始正畸力作用（OTM）后的第4天（d4）、第7天（d7）和第10天（d10）三个不同时间点，通过颈椎脱位法处死小鼠。
  2. 使用眼科剪从颈部垂直剪开皮肤，然后将头部与身体分离，并完整剥离头部皮肤。
  3. 从双侧口角向下颌后部剪除皮肤及颊肌。完全切断附着于喙突的颊肌及肌腱，以取出下颌骨，并修剪多余骨骼以获得完整的上颌骨。随后，去除双侧第三磨牙后方的骨组织，并撕除腭侧黏膜。最后，拆除正畸装置，沿腭中缝在切牙之间切断骨骼，分离出左右两侧的牙槽骨。
    ​注意：确保两侧从切牙至第三磨牙的区域保持完整。

5. 石蜡切片的制备

  1. 固定：将收获的牙槽骨浸入4%多聚甲醛中固定48小时，并在通风橱中使用眼科剪刀修剪，以制备第6和第7节段。
  2. 脱钙：用1×PBS轻轻冲洗样本，每次10分钟，共3次。将样本置于通用组织固定液（pH 8.0）中进行脱钙，每2天更换新鲜溶液，持续5周，直至骨组织可被针尖轻松穿透。
  3. 脱水：用1×PBS洗涤样本，每次10分钟，共3次；随后依次将样本浸入95%乙醇、100%乙醇和二甲苯中，每种溶液各浸泡2次，每次1小时。
  4. 将样本浸入二甲苯与石蜡体积比为1:1的混合液中30分钟，然后转移至65 °C石蜡中过夜。
  5. 包埋：选择合适的包埋盒，将牙槽骨连同牙齿朝上、保持水平均匀放置。从包埋盒中取出样本，转移至-20 °C冰箱冷冻，待石蜡完全冷却凝固后编号。
  6. 使用切片机在横断面上连续切取20至40张厚度为4 µm的切片，漂浮于37 °C水中展开，贴附于载玻片上，并在42 °C下烘烤过夜。

6. OTM 距离测量

  1. 使用体视显微镜从𬌗平面垂直方向拍摄三个时间点的标本照片。
  2. 使用微型CT扫描仪扫描牙槽骨。根据制造商说明，利用扫描仪配套软件重建上颌牙槽骨最大矢状面的三维图像，确保三个磨牙完全可见。
  3. 使用ImageJ软件测量牙齿移动距离（OTM距离）：
    1. 打开ImageJ软件，使用直线工具绘制一段已知长度的线段。
    2. 点击分析，选择设置比例尺，在已知距离栏中输入所绘线段的数值，并在长度单位栏中输入相应单位。
    3. 在M2近中边缘嵴中点与M1远中边缘嵴中点之间画一条线，然后点击测量。结果中“长度”列显示的数值即为OTM距离。

7. 组织学分析

  1. 感兴趣区域（ROI）的选择：将上颌骨横断面上位于第一磨牙（M1）三个牙根正中间的牙槽骨定义为感兴趣区域（ROI）。该区域不仅在颊舌方向上延伸至第一磨牙的皮质骨，还沿近中颊根的长轴中线延伸，包括远中颊根与腭根之间的一半区域。
  2. 骨生成分析
    1. 钙黄绿素与茜素红双荧光标记及分析
      1. 钙黄绿素和茜素红的配制：将钙黄绿素溶解于2% NaHCO₃中3 溶液配制为1 mg/mL的茜素红S（alizarin red S）在H20 至 2 mg/mL。
        注意：本研究中，钙黄绿素和茜素红为商业购得。
      2. 注射钙黄绿素（20 mg·kg⁻¹）-1·bw）第1天以及茜素红S（40 mg·kg-1·bw），在OTM开始后第8天通过腹腔注射给药。于第10天处死小鼠并采集牙槽骨。
      3. 制备样本并按照步骤 5.1 和 5.3–5.5 进行包埋。更多细节请参见 Yang 等人。30.
      4. 使用旋转式切片机，在横断面上连续切取5 µm厚的切片。将切片贴附于载玻片上，用中性树胶封片。
        注意：其余样品必须与干燥剂一同在室温下保存。
      5. 在荧光显微镜下观察并拍摄切片，根据先前所述方法计算矿化沉积率（MAR）和骨形成率（BFR/BS）30.
    2. 免疫荧光
      1. 选择合适的石蜡切片，在65 °C下烘烤30分钟。
      2. 脱蜡：将切片浸入二甲苯中5分钟，每次更换新鲜二甲苯，重复两次。
      3. 复水：将切片依次浸入95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇和ddH₂O中。2O，每次5分钟。
      4. 用1 × PBS轻轻洗涤切片，每次5分钟，共洗2次。
      5. 抗原修复：将切片浸入含有 Tris-HCl（0.05 M，pH 8.0）、EDTA（0.01 M，pH 8.0）和蛋白酶K（10 µg/mL）的ddH₂O混合溶液中2O，并在37 °C下孵育15分钟。
      6. 用1 × PBS 轻柔洗涤切片，每次5分钟，共3次。
      7. 封闭：去除切片上的多余液体，使用疏水性标记笔在目标区域周围画圈。为阻断非特异性结合，加入含10%牛血清白蛋白的封闭缓冲液，室温孵育1小时。
        注意：切勿将切片干燥过久，以免影响实验结果。
      8. 一抗孵育：用抗体稀释液将抗骨桥蛋白（OPN）抗体稀释至推荐浓度，每份样本加入30–50 µL，于4 °C湿盒中过夜孵育。
        注意：确保腔室内留有一些水，并盖上盖子，以防止抗体溶液蒸发。
      9. 用1 × PBS轻轻洗涤切片，每次10分钟，共3次。
        注意：步骤 7.2.2.10–7.2.2.12 应在避光条件下进行。
      10. 荧光二抗孵育：选择与一抗相匹配的合适荧光标记二抗，按推荐浓度稀释后，向每个样本加入30–50 µL，室温孵育1小时。
      11. 用1 × PBS轻轻洗涤切片，每次10分钟，共洗2次。
      12. 使用含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂封片。将切片避光保存，并尽快拍照。
      13. 使用配备数字相机的荧光显微镜对切片进行观察和拍照，并在感兴趣区域（ROIs）内计数阳性细胞。
  3. 破骨细胞生成分析
    1. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
      1. 选择合适的石蜡切片。按照步骤 7.2.2.1–7.2.2.3 进行脱蜡和水化。
      2. 根据制造商说明书，使用TRAP染色试剂盒配制新鲜染色液，并预热至37°C。
      3. 向每个样本中加入30–50 µL染色液，在37 °C湿润孵育盒中孵育20–30分钟。每5分钟检查一次，直至在光学显微镜下观察到红色多核破骨细胞。用ddH2O终止反应。
      4. 用苏木精溶液复染30秒，随后浸入1%氨水溶液中1分钟以获得稳定的蓝色。在缓流自来水下冲洗。
      5. 使用中性树胶封片，室温过夜干燥。
      6. 在显微镜下拍照，并根据我们之前的方案，计数含有三个以上细胞核的TRAP阳性细胞数量30.
    2. 免疫荧光：使用组织蛋白酶K（CTSK）抗体，按推荐浓度进行免疫荧光实验，并遵循上述第7节中描述的实验步骤。

结果

利用本方案，我们建立了一种可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠模型（Stat3Col1α2ERT2），用于研究STAT3缺失对正畸力诱导的牙槽骨重塑的影响（图1A，B）。通过牙槽骨免疫荧光染色证实了成骨细胞中STAT3的缺失（图1C）。

立体显微镜显示，野生型小鼠在第4天、第7天和第10天的正畸牙齿移动（OTM）距离增加。然而，在Stat3Col1α2ERT2 小鼠中，OTM距离减小（图2B）。Micro-CT分析在第10天也证实了这一现象，表明成骨细胞中Stat3基因的缺失减缓了OTM（图2C）。

在组织学分析中，将上颌骨横断面中M1三个牙根范围内的区域定义为感兴趣区域（ROI），该区域可反映牙槽骨重塑的整体情况（图3A）。苏木精-伊红染色和骨桥蛋白（OPN）免疫荧光染色显示了ROI中完整的牙槽骨结构（图3B、C）。

在成骨分析中，茜素红和钙黄绿素标记显示，正畸力可提高野生型小鼠牙槽骨的矿化沉积速率（MAR），但Stat3Col1α2ERT2小鼠OTM组的MAR较野生型小鼠降低（图4A）。此外，免疫荧光染色表明，在正畸力作用下，OPN+成骨细胞数量增加，但Stat3Col1α2ERT2小鼠OTM组中的OPN+成骨细胞数量少于野生型小鼠（图4B）。在破骨细胞生成分析中，TRAP染色显示，在正畸力作用下，野生型小鼠破骨细胞数量增加，而Stat3Col1α2ERT2小鼠OTM组中的破骨细胞数量少于野生型小鼠（图4C）。该现象也通过CTSK的免疫荧光染色得到证实（图4D）。这些结果表明，成骨细胞中Stat3的缺失降低了成骨细胞和破骨细胞对正畸力的反应活性，并损害了牙齿移动过程中的骨重塑。

STAT3基因编辑、小鼠模型构建示意图；TA给药时间表、育种策略、OTM结果
图1：可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠模型构建示意图。（A）他莫昔芬（tamoxifen）诱导Col1α2表达的成骨细胞中Stat3基因敲除的示意图（左）。实验方案：6周龄雄性野生型小鼠和Stat3Col1ERT2小鼠在构建正畸牙齿移动（OTM）模型前一周开始，每2天注射一次TA（100 mg·kg-1·bw），分别在OTM后第4、7、10天处死并进行分析（右）。（B）可诱导的成骨细胞谱系特异性Stat3基因敲除小鼠的杂交流程。（C）OTM后第10天，野生型（WT）和Stat3Col1ERT2小鼠牙槽骨中STAT3与OPN的双免疫荧光染色，以及非OTM侧与OTM侧双阳性细胞的定量分析。n = 5；比例尺 = 50 µm。本图引自Gong等26。缩写：STAT3 = 信号转导及转录激活因子3；Col1α = 胶原蛋白1-α；TA = 他莫昔芬；WT = 野生型；OTM = 正畸牙齿移动；OPN = 骨桥蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的高清版本。

上颌正畸力示意图、组织学时间线及牙齿移动分析图
图2Stat3 的成骨细胞缺乏减缓了正畸牙齿移动 (A) 正畸牙移动模型的示意图 体内将弹簧结扎于切牙与第一磨牙（M1）之间，施加正畸力以使 M1 向近中嵴移动。B) 野生型小鼠正畸牙移动（OTM）后 d0、d4、d7 和 d10 的 OTM 距离 Stat3Col1α2ERT2 小鼠。C野生型小鼠非正畸牙移动侧与正畸牙移动侧的代表性图像 Stat3Col1α2ERT2 小鼠在OTM后第10天的micro-CT图像。n = 5。比例尺 = 1 mm（B), 500 µm (C）。该图来自 Gong 等人。26缩写：STAT3 = 信号转导及转录激活因子3；Col1α = 胶原蛋白1-α；WT = 野生型；OTM = 正畸牙齿移动；SAG = 矢状面。虚线曲线表示OTM距离。 请点击此处以查看此图的放大版本。

上颌骨横切面图解，组织学，免疫荧光；受力影响分析，ROI。
图3：感兴趣区域示意图。 （A）感兴趣区域（ROIs）的示意图。在上颌骨横截面中，位于M1三个牙根之间的虚线区域被选为感兴趣区域。M1的三个牙根包括近中颊根、远中颊根和腭根。（B）小鼠M1整个牙槽骨的HE染色。（C）小鼠M1整个牙槽骨中OPN的免疫荧光染色。比例尺 = 200 µm（B），100 µm（C）。本图来自Gong等26。缩写：ROIs = 感兴趣区域；MB = 近中颊根；DB = 远中颊根；P = 腭根；HE = 苏木精-伊红；OPN = 骨桥蛋白；PDL = 牙周膜。 请点击此处查看此图的放大版本。

茜素红-钙黄绿素、DAPI/骨桥蛋白染色的骨重塑实验；TRAP、CTSK分析结果。
图4：Stat3 成骨细胞特异性缺失损害正畸力诱导的骨形成与骨吸收。（A）在正畸牙移动（OTM）期间，野生型（WT）和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠通过钙黄绿素和茜素红S进行连续荧光标记，并对矿化沉积率进行定量分析。n = 5。（B）OTM后第10天，WT和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠牙槽骨中OPN+细胞的免疫荧光染色及定量分析。n = 5。（C）OTM后第4天，WT和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠牙槽骨中TRAP染色及TRAP阳性细胞的定量分析。n = 5。（D）OTM后第4天，WT和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠牙槽骨中CTSK+细胞的免疫荧光染色及定量分析。n = 5。比例尺 = 10 µm（A），50 µm（B-D）。该图来自Gong等人的研究26。缩写：STAT3 = 信号转导及转录激活因子3；Col1α = 胶原1-α；WT = 野生型；OTM = 正畸牙移动；OPN = 骨桥蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；TRAP = 抗酒石酸酸性磷酸酶；MAR = 矿化沉积率；CTSK = 组织蛋白酶K。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

错颌畸形是最常见的口腔疾病之一，会影响呼吸、咀嚼、言语甚至外观。根据既往流行病学调查，其发病率从70%上升至93%，因此人们对正畸治疗的需求与日俱增。31,32如何安全地加速牙槽骨重塑以提高正畸治疗效率已成为该领域的热点问题；因此，有必要阐明正畸牙齿移动（OTM）驱动的牙槽骨重塑机制。在以往的研究中，研究人员使用了 体内 通过药物注射研究动物模型中OTM的机制21,33，方法简单易行，但难以排除药物对其他系统细胞的影响。因此，深入研究正畸力作用下骨重建的机制具有重要意义 体内.

近年来，基因敲除小鼠被广泛应用，为基因功能研究和治疗靶点的探索提供了坚实的基础34。在这些技术中，全基因敲除技术是最早采用的方法。Adrb2-/- 肾上腺素受体（Adrb2）基因敲除小鼠模型被用于探讨交感神经系统在正畸牙移动（OTM）过程中牙槽骨重建中的作用35。然而，全基因敲除小鼠在某些情况下可能导致胚胎致死，从而阻碍对基因功能的研究。因此，人们开发了条件性基因敲除小鼠，可在特定细胞类型中靶向敲除目标基因。但由于与牙槽骨重建相关的研究通常具有时间敏感性，因此有必要在建模后的特定时间点观察牙槽骨的变化。

可诱导的条件性基因敲除小鼠具有对DNA重组的时间和空间控制以及组织特异性的双重优势，通过给予药物或激素可在特定时间点和特定组织中实现基因敲除，从而更好地满足研究需求。此外，STAT3是一种在骨组织及其他组织中广泛表达的转录因子，具有调控细胞增殖、分化、凋亡以及免疫等多种重要功能25。我们先前报道过，未诱导的成骨细胞特异性Stat3基因敲除小鼠的骨矿物质密度降低28，提示未诱导的条件性Stat3基因敲除小鼠不适合用于需要排除发育影响的牙槽骨重塑机制研究。

因此，在本研究中，我们利用基于Cre/loxP系统的可诱导条件性基因敲除技术，构建了他莫昔芬诱导的成骨细胞特异性Stat3基因敲除小鼠Stat3Col1α2ERT2。该技术具有时空可控性，更适用于牙槽骨重建机制的研究，同时可结合谱系示踪技术进一步探究特定细胞与基因的功能。在给予他莫昔芬诱导前，Stat3Col1α2ERT2小鼠与野生型小鼠无明显差异，繁殖过程中亦无特殊异常。我们前期研究已发现，在成年小鼠中诱导Col1α2+成骨细胞内Stat3基因的删除会损害骨形成并降低骨量28。本研究中，非正畸牙移动（OTM）组的Stat3Col1α2ERT2小鼠骨代谢水平下降，与既往结果一致。此外，正畸力作用下OTM组小鼠骨代谢水平下降更为显著，提示Stat3在力学刺激下调控骨代谢过程中发挥重要作用。我们进一步探讨了Stat3调控骨重建的机制。结果表明，Stat3可直接促进成骨细胞分化28,29，并通过调控Mmp3的转录影响成骨细胞与破骨细胞之间的相互作用，进而影响破骨细胞的分化29。

在本实验方案中，我们选择小鼠上颌骨横截面上第一磨牙（M1）三个牙根所围区域作为感兴趣区（ROI），以评估牙槽骨的改建情况。采用该区域后，牙槽骨的分析方式更接近于长骨的分析方法，即在同一区域内分析成骨与破骨细胞生成的活性，而非传统上分别分析不同侧边特征的方法。此外，根据经典假设，应在压力侧和张力侧分别施加两种作用相反的药物，以加速牙齿移动速率。该方法为克服这些瓶颈提供了理论依据。在本正畸牙齿移动（OTM）模型中，正畸力的大小通过测力计进行测量。然而，随着第一磨牙与门牙之间距离的减小，施加的力会略有衰减。因此，有必要建立一个标准化的力学系统，以产生更恒定且稳定的正畸力。

在实验方案中，有一些关键步骤需要特别注意。首先，在构建OTM模型的过程中，应牢固结扎第一磨牙和切牙，以防止因结扎松脱导致加力失败。其次，必须注意施力方向，应对第一磨牙施加水平方向的力，避免因施加垂直力而导致牙齿被拔除。最后，在包埋过程中，应根据目标横切面确定样本的方位，并及时观察切片情况，以调整方位获得理想的切片。

总之，我们提供了可诱导、特异性的OTM基因敲除小鼠模型的实验方案，该模型能够揭示不同时间点的牙槽骨重塑过程。我们将进一步结合谱系示踪技术，利用该模型研究特定细胞和基因的功能。随后建立动态且细胞特异性的调控模式 体内 在OTM机制研究领域，为临床正畸学提供了证据。此外，本研究提供了构建OTM模型的详细方案，该模型通过刺激成骨细胞和破骨细胞实现快速骨重建，为研究机械力作用下的骨重建提供了理想模型。不仅如此，我们还描述了OTM过程中牙槽骨重建的分析方法，为骨骼力学生物学研究提供了新策略。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分得到了中国国家自然科学基金（81870740、82071083、82271006、82101048、81800949）；上海市自然科学基金（21ZR1436900、22ZR1436700）；上海市学术/技术带头人计划（20XD1422300）；上海市申康医院发展中心临床研究计划（SHDC2020CR4084）；上海交通大学医学院附属第九人民医院跨学科研究基金（JYJC201902、JYJC202116）；上海市高水平地方高校创新团队项目（SSMUZLCX20180501）；上海交通大学医学院附属第九人民医院、上海交通大学医学院口腔学院研究学科基金（KQYJXK2020）；上海交通大学医学院附属第九人民医院原创探索项目（JYYC003）；上海交通大学医学院“双百人”计划项目；上海交通大学医学院生物材料与再生医学研究所合作研究项目（2022LHB02）；上海交通大学医学院附属第九人民医院生物样本库建设项目（YBKB201909、YBKB202216）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× PBS北京索莱宝科技有限公司 & Technology Co.,Ltd. P1020
4% 多聚甲醛武汉赛维尔生物科技有限公司G1101
茜素红Sigma-AldrichA5533
抗CTSK抗体Santa Cruzsc-48353
抗OPN抗体R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国AF808
钙黄绿素Sigma-AldrichC0875
闭合线圈弹簧中国上海，创新材料与器件CS1006B
Col1α2CreERT2 小鼠中国科学院上海生命科学研究院周斌惠赠
盐酸右美托咪定Orionintie Corporation，Orion Pharma Espoo园区
EDTA碧云天生物技术ST069
包埋盒Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
乙醇国药集团化学试剂有限公司100092183
ImageJ 软件美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国
含DAPI的封片剂碧云天生物技术P0131
小鼠解剖平台上海华科实验设备与材料有限公司HK105
石蜡Sangon Biotech Co., Ltd.A601889
基因分型引物Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA；Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA；Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG；Cre R-CGCATAACCAGTGAAACAGC
蛋白酶KSigma-Aldrich539480
自凝修复树脂3M ESPE，美国明尼苏达州圣保罗712-035
Stat3fl/fl 小鼠GemPharmatech Co., LtdD000527
他莫昔芬Sigma-AldrichT5648
TRAP 染色试剂盒Sigma-Aldrich387A
Tris-HCl碧云天生物技术ST780
通用组织固定液武汉赛维尔生物科技有限公司G1105
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418
ZoletilVIRBAC 

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使用可诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑
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