角膜缘微环境细胞的分离与鉴定

摘要

本文介绍了一种分离和鉴定人角膜缘微环境细胞的实验方案。

摘要

本文报道了一种角膜缘微环境细胞（LNCs）分离与鉴定的标准操作流程。实验所用角膜缘组织来源于眼库。在无菌条件下将组织分割为12份，加入胶原酶A，在37 °C细胞培养孵箱中消化18小时，以获得含有LNCs及角膜缘上皮细胞的细胞簇。 上皮祖细胞。将细胞簇在37 °C下用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化15分钟，以获得单细胞，随后接种于涂有5% Matrigel的塑料表面，并在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中培养。当细胞融合度达到70%时进行传代，利用免疫荧光、实时定量PCR（qPCR）和流式细胞术鉴定朗格汉斯细胞样细胞（LNCs）。原代LNCs被分离并传代超过12次。P4至P6代LNCs的增殖活性最高。LNCs表达的干细胞标志物水平高于骨髓间充质干细胞（BMMSCs），包括SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR和PDGFRβ。此外，结果表明P4代LNCs均一表达VIM、CD90、CD105和PDGFRβ，但不表达Pan-CK，因此后者可作为LNCs鉴定的排除性标志物。流式细胞术分析显示，约95%、97%、92%和11%的LNCs分别表达CD73、CD90、CD105和SCF，而它们不表达 68%、99%、20% 和 3% BMMSCs。LNC 的标准流程 分离与鉴定可提供 LNCs 广泛应用的可靠实验室基础。

引言

角膜上皮干细胞缺乏症（corneal epithelial stem cell deficiency, CESD）的发病率，也称为角膜缘干细胞缺乏症（limbal stem cell deficiency, LSCD）¹，以及 角膜上皮再生（CES）是 由于角膜感染日益严重，情况变得越来越紧迫 和损伤。若未得到妥善治疗，CESD 可导致失明，需要进行角膜移植。因此，CES 的再生是 其重要性日益凸显。有一类称为角膜缘微环境细胞（limbal niche cells, LNCs）的辅助细胞，为角膜缘干细胞（CES）的功能提供必要的支持。角膜缘间充质干细胞最初由 Polisetty 等人分离获得。² 由 Xie 等人鉴定³ 位于角膜缘上皮下及角膜缘基质中的LNCs是角膜缘的关键支持性干细胞 以及骨髓来源的间充质干细胞（BMMSCs）的功能，并且能够 可被诱导分化为角膜上皮细胞和角膜基质细胞等。^3,4,5,6,7

方案

从年龄在50至60岁之间的供体获取的角膜缘组织来自中国武汉同济医院红十字会眼库。该方案经同济伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。

1. 分离

1. 从中期角膜保存液中获取角膜缘组织，并在超净工作台内无菌条件下操作。
2. 使用无菌外科圆刃刀刮除并移除角膜周围的虹膜和内皮。
3. 用手术刀将角膜缘组织切成大小相等的十二块，每块保留角膜两侧各1 mm。 和巩膜。
4. 将角膜缘组织转移至3.5 cm培养皿中，加入1 mL胶原酶A（2 mg/mL，溶于DF-12培养基），浸没所有组织以进行消化。
5. 将培养皿放入37 °C细胞培养箱中，消化角膜缘组织18 h。
   注意：随访程序通常在第二天进行。
6. 制备6孔培养板，用5%基底膜基质（Matrigel）包被。
   1. 包被5%基底膜基质（溶于MESCM中）[表1孔底部的])。
   2. 准备 200 μL 和 1 mL 吸头各一个 15 mL 离心管，以及一个 6 孔板，置于无菌袋中。
   3. 将已灭菌的袋子（包括枪头和离心管）以及一个新的6孔板置于-20 °C或-80 °C环境中20分钟。在 4 °C 冰箱
   4. 从-20 °C或-80 °C环境中取出预冷的枪头....

结果

LNC 的生长
LNCs 的分离成功采用上述方法，即使用胶原酶 A（2 mg/mL）消化角巩膜缘组织。图1）。与先前报道的一项研究结果一致³，经胶原酶A消化后，在显微镜下可观察到类毛虫样细胞簇（图2）。随着细胞传代次数的增加，梭形细胞的比例逐渐升高。与未包被基底膜基质的塑料培养板相比，梭形细胞能够在包被了5%基底膜基质的培养板上生长。³P1至P12代细胞表现出一致的增殖速率，细胞倍增时间介于2至7天之间（表2）。在本研究中，LNCs 培养至第 13 代，共扩增 34 次图3)³LNCs 由原代细胞（LNC P0）培养获得；LNC P0 生长缓慢，约需 12 天。LNCs 在 P1-P8 代时传代仅需约 3 天，而 P9 代以后 LNCs 的生长.......

讨论

角膜透明度通常由角膜基质中规则排列和分布的细小纤维（直径25-30 nm）维持，这对正常视力至关重要¹⁶全球有2.53亿视力障碍者，其中3600万人失明¹⁷世界卫生组织（WHO）将角膜盲视为对人类视力最严重的威胁之一，占全球所有盲症病例的5.1%¹⁶角膜上皮缺损，伴有正常 CES 可快速愈合且不留疤痕¹⁸据估计，全球有超过1270万患者因中重度视力丧失而需要角膜移植¹⁹；30%的角膜移植失败由角膜内皮失代偿（CESD）引起²⁰. 然而，由于全球大多数国家角膜捐献短缺，每七十名角膜盲患者中仅有一人最终能接受角膜移植手术²¹目前，角膜上皮干细胞移植（CEST）可用于治疗角膜上皮干细胞缺乏症（CESD）²²单眼患有角膜内皮干细胞缺乏症（CESD）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
两性霉素B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
抗CD73抗体	Abcam	ab202122	1:50
牛血清白蛋白	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
细胞培养箱	上海力申	K1119K4644	HF90(HT)
离心系统	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
胶原酶A	Roche	10103578001	2 mg/mL
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM700	-
培养皿	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
驴抗小鼠IgG (H+L) 二抗	ThermoFisher	A16016	1:1000
驴抗兔IgG (H+L) 二抗	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva 软件	BD Biosciences	Tree Star	-
流式细胞仪	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
荧光显微镜	olympus	cx31
庆大霉素	Sigma	G1914	50 μg/mL
血细胞计数板	MERCK	Z359629	Bright-Line
高容量cDNA转录试剂盒	ThermoFisher	4374966
倒置相差显微镜	UOP	DSZ2000X
ITS（胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠）	Sigma	I3146	5 μg/mL 胰岛素，5 μg/mL 转铁蛋白，5 ng/mL 亚硒酸钠
ESC/iPSC用KnockOut SR血清替代物	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
广谱细胞角蛋白（Pan-CK）	Abcam	ab7753	1:1000
多聚甲醛	NoninBio	NBS0135	4.00%
多聚甲醛	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
实时荧光定量PCR仪	Applied Biosystems	Step One Plus	-
重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
重组人白血病抑制因子（Lif）	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA提取试剂盒	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
体视显微镜	ZEISS	SteREO Discovery. V8
无菌外科圆刃刀片	Careforde	29500	10号
TaqMan基因表达检测预混液	Applied Biosystems	4448489
吐温X-100	MERCK	X100	0.20%
台盼蓝	ThermoFisher	15250061	0.40%
胰蛋白酶-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
吐温20	MERCK	P9416	-
超净工作台	莱特	LT20200705	SW-CJ-IFDG
通用PCR预混液	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100