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方法文章

角膜缘微环境细胞的分离与鉴定

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DOI：

10.3791/65618

⸱

2023年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离和鉴定人角膜缘微环境细胞的实验方案。

摘要

本文报道了一种角膜缘微环境细胞（LNCs）分离与鉴定的标准操作流程。实验所用角膜缘组织来源于眼库。在无菌条件下将组织分割为12份，加入胶原酶A，在37 °C细胞培养孵箱中消化18小时，以获得含有LNCs及角膜缘上皮细胞的细胞簇。 上皮祖细胞。将细胞簇在37 °C下用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化15分钟，以获得单细胞，随后接种于涂有5% Matrigel的塑料表面，并在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中培养。当细胞融合度达到70%时进行传代，利用免疫荧光、实时定量PCR（qPCR）和流式细胞术鉴定朗格汉斯细胞样细胞（LNCs）。原代LNCs被分离并传代超过12次。P4至P6代LNCs的增殖活性最高。LNCs表达的干细胞标志物水平高于骨髓间充质干细胞（BMMSCs），包括SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR和PDGFRβ。此外，结果表明P4代LNCs均一表达VIM、CD90、CD105和PDGFRβ，但不表达Pan-CK，因此后者可作为LNCs鉴定的排除性标志物。流式细胞术分析显示，约95%、97%、92%和11%的LNCs分别表达CD73、CD90、CD105和SCF，而它们不表达 68%、99%、20% 和 3% BMMSCs。LNC 的标准流程 分离与鉴定可提供 LNCs 广泛应用的可靠实验室基础。

引言

角膜上皮干细胞缺乏症（corneal epithelial stem cell deficiency, CESD）的发病率，也称为角膜缘干细胞缺乏症（limbal stem cell deficiency, LSCD）1，以及 角膜上皮再生（CES）是 由于角膜感染日益严重，情况变得越来越紧迫 和损伤。若未得到妥善治疗，CESD 可导致失明，需要进行角膜移植。因此，CES 的再生是 其重要性日益凸显。有一类称为角膜缘微环境细胞（limbal niche cells, LNCs）的辅助细胞，为角膜缘干细胞（CES）的功能提供必要的支持。角膜缘间充质干细胞最初由 Polisetty 等人分离获得。2 由 Xie 等人鉴定3 位于角膜缘上皮下及角膜缘基质中的LNCs是角膜缘的关键支持性干细胞 以及骨髓来源的间充质干细胞（BMMSCs）的功能，并且能够 可被诱导分化为角膜上皮细胞和角膜基质细胞等。3,4,5,6,7先前的研究表明，LNCs 的干细胞特性比 BMMSCs 更为原始。8，已在临床广泛应用。LNCs甚至可能成为继MSC之后治疗CESD的下一个可行选择。作为CES的重要支持细胞，LNCs也是来源于 "生态位" 角膜缘的结构。淋巴管内皮细胞（LNCs）可能在成熟角膜上皮细胞（MCEC）向角膜上皮干细胞（CES）去分化过程中发挥关键作用9然而，目前关于角膜缘基质细胞（LNCs）的研究仍然相对不足，对于其术语命名、分离、纯化、鉴定及特性等方面尚未达成共识。一些研究人员将LNCs称为角膜缘活检来源的基质干细胞10，角膜缘间充质干细胞11，角膜缘成纤维细胞干细胞12和角膜缘间充质基质细胞13由于肝脏自然杀伤细胞（LNCs）的生长特性尚未被详细描述，且鉴于其在科学研究和临床应用方面具有广阔前景，可能成为未来最重要的临床工具之一，因此有必要对LNCs的分离、纯化、鉴定及其特性进行系统总结。

根据先前的一项研究14，角膜缘神经嵴细胞（LNCs）主要存在于角膜缘上皮下层及角膜缘基质中。本方案包括使用胶原酶A处理角膜缘组织，获得由角膜缘上皮干细胞（LEPC）和LNCs组成的细胞簇，并用0.25%胰蛋白酶-EDTA（TE）将其消化为单细胞。随后将LNCs在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中进行选择性培养以实现纯化。本文报道的方案操作简便，可高效大量获取人源LNCs。

的 LNC 分离、培养与鉴定的详细步骤已在视频中记录，供对 LNC 感兴趣的科研人员参考 研究，且可根据需要方便地重复进行。

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方案

从年龄在50至60岁之间的供体获取的角膜缘组织来自中国武汉同济医院红十字会眼库。该方案经同济伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。

1. 分离

  1. 从中期角膜保存液中获取角膜缘组织，并在超净工作台内无菌条件下操作。
  2. 使用无菌外科圆刃刀刮除并移除角膜周围的虹膜和内皮。
  3. 用手术刀将角膜缘组织切成大小相等的十二块，每块保留角膜两侧各1 mm。 和巩膜。
  4. 将角膜缘组织转移至3.5 cm培养皿中，加入1 mL胶原酶A（2 mg/mL，溶于DF-12培养基），浸没所有组织以进行消化。
  5. 将培养皿放入37 °C细胞培养箱中，消化角膜缘组织18 h。
    注意：随访程序通常在第二天进行。
  6. 制备6孔培养板，用5%基底膜基质（Matrigel）包被。
    1. 包被5%基底膜基质（溶于MESCM中）[表1孔底部的])。
    2. 准备 200 μL 和 1 mL 吸头各一个 15 mL 离心管，以及一个 6 孔板，置于无菌袋中。
    3. 将已灭菌的袋子（包括枪头和离心管）以及一个新的6孔板置于-20 °C或-80 °C环境中20分钟。在 4 °C 冰箱
    4. 从-20 °C或-80 °C环境中取出预冷的枪头、离心管和6孔板，然后在超净工作台中进行以下操作。
    5. 将50 µL 5%基底膜基质使用200 μL枪头转移至1 mL MESCM中，并轻轻且均匀地混匀。
    6. 使用预冷的1 mL枪头，将5%基底膜基质（溶于MESCM中）转移至6孔培养板的一个孔中。
    7. 轻轻水平摇动6孔板，将6孔培养板放入37 °C细胞培养箱中孵育约1小时，然后进行下一步操作。
  7. 消化18小时后，取出经胶原酶A消化的角膜缘组织， 仅剩一些可见的小细胞簇和未消化的巩膜组织。
    注意：高倍显微镜观察显示，该簇由许多紧密排列的细胞（包括淋巴结细胞）组成。
  8. 使用200 µL移液器吸头在体视显微镜下将细胞簇从未消化的巩膜组织上分离。
  9. 将细胞团转移至3.5 cm培养皿中，浸入0.25% TE，然后将培养皿放入细胞培养箱中孵育15分钟。
  10. 加入1 mL含10%敲除血清的MESCM以终止细胞消化，然后使用1 mL枪头轻轻吹打数次，将细胞团块重悬为单个细胞。
  11. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，以200 x g离心 g 5 分钟。
  12. 小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后加入1 mL MESCM重悬细胞。
  13. 用1 mL移液枪头上下吹打2-3次，直至底部细胞沉淀均匀悬浮于MESCM中，取20 µL细胞悬液进行细胞计数。
  14. 将细胞悬液用1 mL移液器枪头转移至经5%基底膜基质包被的6孔板中，并将MESCM体积补至2.5 mL。
  15. 轻轻水平摇动6孔板，使细胞均匀分布。
  16. 将细胞成像并记录后，转移至培养箱中继续培养。每天观察并拍摄细胞，每3-4天更换一次培养基。

2. LNC 的鉴定

  1. 免疫荧光染色
    1. 使用1 mL 0.25% TE在培养板底部消化LNCs，持续5 min 37°C 细胞培养箱
    2. 通过加入1 mL含knockout血清的MESCM终止消化，将细胞悬液在200 x g条件下离心 g 5 分钟后，小心吸除上清液。
    3. 加入1 mL MESCM重悬细胞。制备80 µL细胞悬液（4 × 103 每张载玻片20 µL，共4张载玻片（每张载玻片细胞数相同），使用离心系统 按照制造商的说明将细胞接种到显微镜载玻片上。
    4. 使用4%多聚甲醛固定细胞（步骤3中贴附于载玻片上的细胞）约10分钟，然后用含0.2% Triton X-100的PBS溶液对载玻片上的细胞进行透膜处理15分钟。
    5. 用 2% 牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞 1 小时，随后在 4 °C 条件下于摇床上与一抗（Pan-CK [1:1000]、Vim [1:100]、CD90 [1:100]、CD105 [1:200]、SCF [1:100]、PDGFRβ [1:100]）孵育过夜。孵育结束后，用 PBST（PBS + 0.1% Tween 20）洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次），以去除未结合的一抗。
    6. 将相应的二抗（驴抗小鼠IgG TRITC标记二抗 [1:1000]、驴抗兔IgG FITC标记二抗 [1:500]、驴抗小鼠IgG 488标记二抗 [1:300]、驴抗兔IgG 594标记二抗 [1:400]）与合适的非特异性IgG抗体在室温下孵育1小时。使用PBST洗涤液去除未结合的二抗（每次5分钟，共洗3次）。
    7. 用 5 µg/mL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）对细胞核进行复染，并封片。
    8. 使用荧光显微镜进行荧光成像（放大倍数：400倍；曝光时间：50 ms）。
  2. 定量实时聚合酶链式反应（qPCR）
    1. 使用RNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取总RNA。
    2. 使用高容量cDNA反转录试剂盒将1-2 µg总RNA反转录为cDNA。
    3. 在含有 cDNA（100 ng）、TaqMan 基因表达检测混合液（1 μL）、通用 PCR Master Mix（10 μL）和 ddH₂O 的 20 μL 溶液中进行逆转录（42 °C，2 min；50 °C，85 min）和 qPCR 扩增（95 °C，5 min；95 °C，10 s，40 个循环）2O（至20 µL）。
    4. 使用比较CT法（ΔΔCT）4,9 以检测相对基因表达水平。

3. LNC 的表征

  1. 细胞计数（血细胞计数板法）
    1. 使用 0.25% TE 在 37 °C 细胞培养箱中消化培养板底部的 LNCs，持续 5 分钟。
    2. 加入 1 mL MESCM（含敲除血清）终止消化，将细胞悬液在 200 ×g 条件下离心 5 分钟，并小心吸除上清液。
    3. 加入 1 mL MESCM 重悬细胞，取 10 μL 细胞悬液置于 0.5 mL 离心管中，加入等体积的 0.4% 台盼蓝染色液。
    4. 取 10 μL 染色后的细胞悬液滴加至血细胞计数板的计数区域，盖上盖玻片后进行计数。
      注：五个中央方格内的细胞总数记为 "A"；每毫升细胞数的计算公式为 5A × 104 × 2。
  2. 采用流式细胞术检测 LNC 和 BMMSC 标志物15
    1. 使用流式细胞术15检测 LNCs 和 BMMSCs 中 SCF、CD73、CD90 和 CD105 的表达水平（每样本采集 2–4 × 106 个事件，从每个样本中获得 2,000 个细胞，共 550,000 个细胞同时设门分析）。
    2. 在封闭缓冲液（含 3% BSA 和 0.05% Tween-20 的 PBS）中，于 20–30 °C 条件下孵育并染色 15 分钟，使用预标记抗体（SCF [1:50]、CD70 [1:50]、CD90 [1:50] 和 CD105 [1:50]），操作按试剂盒说明书进行。
    3. 使用流式细胞仪进行荧光激活细胞分选（FACS）分析。本研究中使用 FACS Diva 软件和 FlowJo 软件。对每个样本记录 10,000 个事件，并设门分析活细胞。

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结果

LNC 的生长
LNCs 的分离成功采用上述方法，即使用胶原酶 A（2 mg/mL）消化角巩膜缘组织。图1）。与先前报道的一项研究结果一致3，经胶原酶A消化后，在显微镜下可观察到类毛虫样细胞簇（图2）。随着细胞传代次数的增加，梭形细胞的比例逐渐升高。与未包被基底膜基质的塑料培养板相比，梭形细胞能够在包被了5%基底膜基质的培养板上生长。3P1至P12代细胞表现出一致的增殖速率，细胞倍增时间介于2至7天之间（表2）。在本研究中，LNCs 培养至第 13 代，共扩增 34 次图3)3LNCs 由原代细胞（LNC P0）培养获得；LNC P0 生长缓慢，约需 12 天。LNCs 在 P1-P8 代时传代仅需约 3 天，而 P9 代以后 LNCs 的生长...

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讨论

角膜透明度通常由角膜基质中规则排列和分布的细小纤维（直径25-30 nm）维持，这对正常视力至关重要16全球有2.53亿视力障碍者，其中3600万人失明17世界卫生组织（WHO）将角膜盲视为对人类视力最严重的威胁之一，占全球所有盲症病例的5.1%16角膜上皮缺损，伴有正常 CES 可快速愈合且不留疤痕18据估计，全球有超过1270万患者因中重度视力丧失而需要角膜移植19；30%的角膜移植失败由角膜内皮失代偿（CESD）引起20. 然而，由于全球大多数国家角膜捐献短缺，每七十名角膜盲患者中仅有一人最终能接受角膜移植手术21目前，角膜上皮干细胞移植（CEST）可用于治疗角膜上皮干细胞缺乏症（CESD）22单眼患有角膜内皮干细胞缺乏症（CESD）...

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披露

所有作者均无相关财务披露。

致谢

感谢王伟、徐玲娟和刘蓉对本工作的指导，感谢谭永耀、金碧辉、游春秀和李贵刚提供部分材料，感谢苏冠宇撰写手稿，感谢周晓、熊一鸿和谢华涛对手稿的修改，以及感谢李贵刚给予的全面指导。本研究得到以下项目资助：国家自然科学基金（编号：82070936、81470606、81570819）、湖北省卫生和计划生育科研项目（编号：WJ2017M073）、同济医院十大转化医学研究项目（编号：2016ZHYX20）、武汉市青年医学骨干人才培养项目（编号：2015whzqnyxggrc10）、全球人才引进计划（编号：G2022154028L）、湖北省卫生健康委员会2022年项目（编号：WJ2021ZH0005）以及湖北省财政厅2022年学科建设基金（编号：42000022815T000000102）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚ThermoFisherD13065μg/mL
两性霉素BSigmaV9009191.25 μg/mL
抗CD73抗体Abcamab2021221:50
牛血清白蛋白MERCKA1933-
CD105Proteintech67075-1-Ig1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-Ig1:100
CD90Abcamab3077361:50
细胞培养箱上海力申K1119K4644HF90(HT)
离心系统StatSpin StatSpin CytoFuge 12-
胶原酶ARoche101035780012 mg/mL
共聚焦显微镜Zeiss LSM700-
培养皿virya350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
驴抗小鼠IgG (H+L) 二抗ThermoFisherA160161:1000
驴抗兔IgG (H+L) 二抗ThermoFisher315681:1000
FACS Diva 软件BD BiosciencesTree Star-
流式细胞仪BD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
荧光显微镜olympuscx31 
庆大霉素SigmaG191450 μg/mL
血细胞计数板MERCKZ359629Bright-Line
高容量cDNA转录试剂盒ThermoFisher4374966
倒置相差显微镜 UOPDSZ2000X
ITS（胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠）SigmaI31465 μg/mL 胰岛素，5 μg/mL 转铁蛋白，5 ng/mL 亚硒酸钠
ESC/iPSC用KnockOut SR血清替代物gibco10828-02810%
MatrigelBioCoat356234-
广谱细胞角蛋白（Pan-CK）Abcamab77531:1000
多聚甲醛NoninBioNBS01354.00%
多聚甲醛MKBioMM-15054%
PDGFRβAbclonalA14441:100
实时荧光定量PCR仪Applied BiosystemsStep One Plus-
重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）Peprotech100-18B4 ng/mL
重组人白血病抑制因子（Lif）Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA提取试剂盒Qiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
体视显微镜ZEISSSteREO Discovery. V8
无菌外科圆刃刀片Careforde2950010号
TaqMan基因表达检测预混液Applied Biosystems4448489
吐温X-100MERCKX1000.20%
台盼蓝ThermoFisher152500610.40%
胰蛋白酶-EDTAGenviewGP31080.25%
吐温20MERCKP9416-
超净工作台莱特LT20200705SW-CJ-IFDG
通用PCR预混液Applied Biosystems4304437
Vim Abcamab925471:100

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