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方法文章

在大鼠脑电图记录期间通过尾侧静脉采集脑脊液和血液

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DOI：

10.3791/65636

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2023年9月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

本文内容

摘要

该方案展示了对癫痫大鼠进行重复的脑脊液和血液采集，同时并行持续视频脑电图（EEG）监测。这些操作对于探索多种体液分子变化与癫痫发作活动之间的可能关联至关重要。

摘要

由于体液成分反映了多种生理和病理动态，因此在许多实验背景下常采集生物液体样本，以检测感兴趣的分子，如激素、生长因子、蛋白质或小非编码RNA。一个具体实例是在癫痫生物标志物研究中采集生物液体。在这些研究中，理想的做法是通过平行采集脑脊液（CSF）和血浆，并考虑采样与癫痫发作之间的时间间隔，来比较分子在脑脊液和血浆中的水平。结合脑脊液和血浆采样，并在癫痫动物中进行视频脑电图（EEG）监测，是一种有前景的潜在诊断和预后生物标志物验证方法。本文描述了一种在持续视频脑电图监测的癫痫大鼠中，从枕大池采集脑脊液并同时从尾侧尾静脉采血的技术。该方法相较于其他常用技术具有显著优势：采样快速，疼痛和侵入性最小，且麻醉时间更短。此外，该方法可用于固定式或遥测脑电图记录的大鼠，并可在多个实验日中重复使用。通过缩短异氟烷麻醉时间以减少采样带来的应激，所测得的生物分子水平能更真实地反映其在体液中的实际浓度。根据所用分析检测方法的可行性，该技术可在进行脑电图记录的同时，用于测定多种不同分子的水平。

引言

脑脊液（CSF）和血液采样对于在临床前和临床研究中识别和验证癫痫生物标志物具有重要意义1,2。目前，癫痫的诊断以及大多数关于癫痫生物标志物的研究主要依赖脑电图（EEG）和神经影像学技术3,4,5。然而，这些方法存在若干局限性。除常规头皮记录外，在许多情况下，脑电图需要采用深度电极等侵入性技术6。脑成像方法的时间和空间分辨率较低，且相对昂贵、耗时较长7,8。因此，识别非侵入性、低成本且基于体液的生物标志物将提供一种极具吸引力的替代方案。此外，这些体液生物标志物还可与现有的诊断方法相结合，以提高其预测能力。

癫痫患者通常需要接受脑电图（EEG）9,10 和血液采样11,12,13,14，许多患者还需进行脑脊液（CSF）采集，以排除危及生命的病因（如急性感染、自身免疫性脑炎）15。这些血液和脑脊液样本可用于旨在识别癫痫生物标志物的临床研究。例如，Hogg 及其同事发现，人类癫痫患者血浆中三种tRNA片段的升高早于癫痫发作的发生14。类似地，人脑脊液和血清中白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，以脑脊液与血清中IL-1β水平的比值表示，可预测创伤性脑损伤后创伤后癫痫的发生16。这些研究凸显了体液样本在癫痫生物标志物研究中的重要性，但也面临临床试验固有的多种局限性，例如抗癫痫药物（AEDs）在血液中的混杂因素、病因信息常缺失、对照组不足、患者数量有限等17,18。

临床前研究为探索生物液体中的分子作为癫痫潜在生物标志物提供了其他机会。事实上，在进行脑电图（EEG）记录的同时，可以从动物体内采集血浆和/或脑脊液（CSF）。此外，可在实验的多个不同日期重复采样，并可使用大量在年龄、性别和癫痫损伤程度上相匹配的对照动物，以提高研究的可靠性。本文详细描述了一种在脑电图监测的大鼠中，通过枕大池采集脑脊液并同时经尾静脉采集血浆的灵活技术。该技术相较于其他方法具有多项优势。通过使用蝶形针方法，可在不损害脑电图电极或其他头部植入装置功能的前提下，多次采集脑脊液。这相对于鞘内导管采集方法是一种改进，后者具有相对较高的感染风险。此外，本文所述用于血液采集的自由滴落法优于其他尾静脉采血方法，因其显著降低了溶血风险——血液不经过导管，且未施加负压真空。若在严格的无菌条件下操作，动物感染风险极低。另外，通过从动物尾部末端开始采血，可实现多次重复取样。此类技术易于掌握，可广泛应用于多种中枢神经系统疾病的临床前研究中。

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方案

所有实验程序均已获得费拉拉大学机构动物护理和使用委员会以及意大利卫生部（批准号：D.M. 603/2022-PR）的批准，符合1986年11月24日欧洲共同体理事会关于实验和其他科学用途动物保护的指令（86/609/EEC）中规定的指南。本方案专门针对在脑电图（EEG）监测下从癫痫动物模型中获取的大鼠脑脊液（CSF）和血浆中的小非编码核糖核酸（sncRNAs）进行进一步的定量聚合酶链式反应（qPCR）分析而优化。如需更深入理解并改进手术操作，可选择参考相关的JoVE视频19,20,21。

1. 手术植入电极或遥测仪前的动物准备

注意：立体定位手术技术根据所使用的 EEG 系统而有所不同。以下方法部分描述了两种手术共有的操作步骤。

  1. 使用雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠（7–8 周龄，体重 250–290 g），饲养条件应符合当地关于实验动物护理和使用的法律法规。将动物饲养在标准环境中，自由摄取食物和饮用水。
  2. 在手术和实验方案开始前，对大鼠进行数天的适应性操作处理。
  3. 使用立体定位仪进行电极或遥测仪的植入。遵循现行的无菌手术标准。使用无菌且性能良好的电极和发射器。
  4. 用电剃刀剃除动物头部的毛发。通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（45 mg/kg）和赛拉嗪（7.5 mg/kg）混合物诱导麻醉，随后通过面罩给予异氟烷麻醉（空气中浓度 1.4%；流速 1.2 mL/min），并将动物头部固定于立体定位仪中。
  5. 通过夹捏双侧后肢足垫以检测足底回缩反射，确认麻醉深度充分，并持续维持异氟烷麻醉至手术结束。在整个操作过程中定期检查麻醉深度。
  6. 在两只动物的眼睛上涂抹足量的眼膏，以防止因麻醉导致眨眼反射消失而引起角膜损伤。
  7. 用液体消毒剂彻底清洁动物头皮，使用灭菌手术刀做一条长约 2 cm 的纵向切口。分开头皮，并在皮瓣上使用外科夹固定以保持切口开放。
  8. 轻柔地剥离骨膜，暴露前囟以及记录电极将要插入的颅骨区域。

2. 植入式拴系电极的手术植入

注意：在建立本方案的穿刺脑脊液采集程序之前（详见步骤9），已在几只自由活动的非麻醉大鼠中通过导向套管重复采集脑脊液。使用植入导向套管并连接系留电极的动物，以评估双头植入物对长期脑电图记录结合多次脑脊液采样的影响。在这些特定实验中，大鼠被植入假导向套管，套管尖端根据先前发表的方案立体定位插入枕大池7 mm22。双植入手术方法与过去一些研究人员用于微透析导向套管和系留电极植入的方法类似23,24。

  1. 使用立体定位仪的一个臂，将电极架安装在该臂上，并将电极垂直插入电极架中。移动电极尖端，使其精确地位于前囟上方。记录前囟的前后和内外侧坐标，并将其转换为所需的目标坐标。
  2. 缓慢降低电极，直至其尖端接近颅骨表面。标记钻孔位置，并在标记处钻开颅骨。操作时需小心，避免损伤脑组织和脑膜。
  3. 钻出四个或更多用于固定螺钉的孔，并将螺钉旋入颅骨。钻孔时应注意电极的尺寸，确保电极不会与已安装的固定螺钉发生干涉。
  4. 沿背腹轴方向缓慢下降携带电极的立体定位臂，使电极进入脑组织，并在目标位置停止。将电极的地线固定在其中一个已旋入颅骨的螺钉上。
  5. 将甲基丙烯酸甲酯水泥涂抹在电极及螺钉上，覆盖电极基座约一半的高度。保留电极上半部分裸露，以便后续连接固定导线的末端。
  6. 从电极架上松开电极，并升起立体定位臂。将动物从立体定位仪中取出，并给予术后护理。
  7. 将动物置于独立的恢复笼中，每10分钟观察一次，直至其清醒并能自主活动。只有在动物完全恢复后，方可将其送回标准饲养笼，并与未麻醉的动物合笼饲养。

3. 遥测仪的手术植入

注意：仅使用无菌遥测仪。如果重复使用遥测仪，须根据制造商说明在手术前对其进行清洁和灭菌。本方案中使用了数据科学国际公司（Data Sciences International, DSI）的遥测仪进行脑电图（EEG）记录。

  1. 使用磁铁打开遥测发射器，并用调幅（AM）频率收音机测试信号。手术前检查信号是否强而清晰。如有必要，丢弃工作不良的遥测装置。
  2. 通过将遥测导线剪至适合成年大鼠的长度来准备导线。剥离两根导线（阴极和阳极）上的硅胶涂层，露出约 5 mm 的螺旋钢导线。在导线末端制作一个长约 2 mm、宽约 1 mm 的环形手柄。
  3. 剃除动物左肩下方及后方 flank 区域的毛发。使用基于稳定过氧化物和季铵盐活性成分的消毒剂对术区进行消毒。让消毒剂作用 15 分钟。
  4. 在动物肩部后方做一条长约 2 cm 的侧向切口，并制作一个约 5 cm3 容积的皮下囊腔用于放置发射器。将发射器平行于动物体长轴放置，导线朝向前脑方向。
  5. 用 3-0 棉线缝合将发射器固定在皮下囊腔的内壁上。使用钝头剪刀在动物 flank 和颈部皮下创建一条长约 2.5 cm 的隧道，将发射器囊腔与步骤 1.6 中在动物头皮上所做的中线切口连接起来。
  6. 用镊子夹住两根遥测导线，通过隧道将其拉出，使其从头皮切口处露出。用伤口夹将导线固定在头皮切口外侧。
  7. 使用立体定位仪确定阳极（红色）导线的目标坐标，并在颅骨上钻孔以放置阳极导线尖端（方法同步骤 2.1）。再钻一个孔用于将固定螺钉向上旋入前脑方向，并将螺钉拧入颅骨。
  8. 将阳极导线尖端插入颅骨与硬脑膜之间，并平置于脑表面。将阴极（白色）导线的环形末端钩在固定螺钉上。在阳极导线出口处及阴极导线周围涂抹少量甲基丙烯酸甲酯水泥，以固定导线于颅骨上。
  9. 用 3-0 棉线缝合将导线固定在颅骨骨膜内壁上。确保固定的导线和缝合线不会干扰脑脊液（CSF）采集部位（即枕骨隆突与寰椎棘突之间可见的菱形凹陷区域）。
  10. 使用 3-0 棉线缝合关闭头皮切口和 flank 切口。在伤口上涂抹消毒剂。待消毒剂完全干燥后，再在缝合伤口上涂抹抗生素软膏。

4. 术后护理

  1. 手术后密切观察动物约1小时，直至其能够直立并在笼内活动。将动物置于加热垫上，以防止低体温。术后2-3天内给予全身性抗生素以预防感染，并给予全身性镇痛剂以预防术后疼痛。
  2. 手术后让大鼠至少恢复7天。在术后3天内每天至少监测一次动物是否出现疼痛或痛苦的迹象。

5. 大鼠癫痫持续状态的诱导

注意：如需详细的状态癫痫（SE）诱导方案以在大鼠中复制内侧颞叶癫痫（mTLE），请参见 Guarino 等人25。

  1. 术后恢复一周后，将动物随机分组：(i) 接受溶剂的对照组动物，以及 (ii) 接受匹罗卡品的癫痫动物。癫痫组应使用较多数量的动物，因为并非所有接受匹罗卡品的动物均能存活或成功诱导出癫痫持续状态（SE）。
  2. 在诱导癫痫持续状态的前一天，通过灌胃给予动物单次剂量的氯化锂（127 mg/kg），溶于0.9%生理盐水（3M）中，给药体积为1 mL/kg。给予动物氯化锂可增强匹罗卡品的效应26，应在诱导SE前约14小时给药，以减少SE发作时间的个体差异。
  3. 在给予氯化锂约14小时后，对大鼠进行单次甲基东莨菪碱注射（1 mg/kg，皮下注射）。
  4. 在甲基东莨菪碱给药后准确30分钟，对大鼠进行单次匹罗卡品注射（50 mg/kg，腹腔注射）以诱导SE。对照组大鼠则给予甲基东莨菪碱和溶剂（0.9% NaCl溶液）。
    1. 匹罗卡品注射会引发典型的动物行为：早期部分性发作（给药后5分钟内出现胡须抖动和点头动作），并在25–30分钟内发展为反复的全面性惊厥（SE）。对于在30分钟内未出现SE的大鼠，可追加一次匹罗卡品剂量（25 mg/kg，腹腔注射）；若仍无SE发生，则将其排除出研究（SE无反应者）。
  5. 从匹罗卡品注射后立即开始，每5分钟观察并记录一次大鼠的癫痫发作行为。采用Racine评分标准进行评分27。
  6. 在SE发作开始后2小时，通过腹腔注射药物混合物终止SE：地西泮（10 mg/kg）、苯巴比妥（25 mg/kg）和东莨菪碱（1 mg/kg）。
  7. 在4小时后再次给予该药物混合物。最后，在再过4小时后，腹腔注射最后一次药物组合（地西泮10 mg/kg 加东莨菪碱1 mg/kg），以彻底终止癫痫样活动。
  8. 在SE后2–3天内，对动物进行腹腔注射生理盐水（1 mL的0.9% NaCl溶液，pH调节至7.0），并喂食10%蔗糖溶液，以促进体重恢复，缓解SE后出现的体重下降。
  9. 根据具体实验方案的要求，将SE后存活的动物随机分配至不同的实验组。对癫痫大鼠后续实验采用以下纳入/排除标准：在匹罗卡品给药后1小时内出现惊厥性SE、SE后第一周体重增加、以及用于脑电图（EEG）记录的电极在目标脑区位置正确25。

6. 癫痫大鼠的拴线式视频脑电图及癫痫发作活动分析

注意：本部分描述了在标准条件下对单笼饲养、自由活动的大鼠记录脑电图（EEG）信号的实验步骤。笼具中不应放置可能导致动物或记录电缆缠绕的物体。根据所研究的科学问题，可分析多个参数。在癫痫研究中，需通过脑电图轨迹识别电发作和运动性发作。识别发作最常用的参数包括阵发性电活动的幅度、频率和持续时间。

  1. 将动物放入记录室内的清洁笼子中，使其适应环境并减少新环境引起的应激反应。将动物的笼子置于法拉第笼内，以避免环境电磁场对EGG信号的干扰。
  2. 将记录电缆的一端连接到记录设备。使用电压表测量电势，并区分接地电极和参考电极。
  3. 将记录电缆的另一端连接到固定在大鼠头部的电极上。操作时，在将电缆插头插入电极连接器时，用手扶住动物头部的水泥覆盖物，避免对大鼠头部施加任何压力。
  4. 对记录电缆的重量进行配重平衡，以允许动物自由活动，同时防止电缆缠绕的风险。为此，可使用配重臂或换向器。即使已对记录电缆进行配重平衡，仍应将食物放置在笼内，而不是放在饲喂架中，因为动物需要站立才能取食。
  5. 在开始记录之前，检查用于采集和处理EEG数据的所有设置。
    注意：本方案不介绍执行EEG记录所需的设备，但应应用适当的滤波和采样率，以避免EEG信号中出现伪迹和噪声。
    1. 对于常规实验，将采样率设置为500 Hz，放大增益设置为5000倍。使用0.005 Hz滤波器以及陷波滤波器对信号进行滤波，以消除50 Hz频段（适用于欧洲国家）周围的电活动干扰。
  6. 同时启动视频和EEG记录，并通过检查特定频段在时间上的功率，确认记录的波形符合预期的EEG信号。在对动物进行干预前，先记录一段基线期。
  7. 定期检查动物和EEG波形。记录电缆从大鼠头部的电极连接器上脱落的情况并不少见。一旦发生，应重新将电极与记录电缆连接，并检查是否获得清晰的EEG信号。
  8. 使用市售软件手动或自动分析EEG信号。若采用手动分析，需浏览EEG记录以识别类似癫痫发作的活动；若使用软件分析，则需设定癫痫事件的关键参数，如电活动的幅度、频率和持续时间。
    注意：单次癫痫发作可能表现为电活动幅度比基线高3倍以上、频率≥5 Hz、持续时间至少5秒22。
  9. 无论采用何种方法，均需通过同步采集的视频记录来确认可能的惊厥性癫痫发作。

7. 癫痫大鼠的遥测视频脑电图及癫痫发作活动分析

注意：本节描述了在标准条件下对单笼饲养、自由活动的大鼠记录遥测脑电图（EEG）信号的实验步骤。该方案基于一种 commercially available telemetry system（市售遥测系统）。然而，不同的遥测系统在功能和技术参数上略有差异。应根据实验室需求和研究目标选择合适的系统。

  1. 将动物的饲养笼放置在信号接收器上方。将信号接收器连接至数据采集系统，并将该系统连接至装有采集软件的计算机。
  2. 通过将磁铁靠近植入大鼠侧腹的遥测仪来开启射频遥测植入装置。使用无线电设备测试信号。使用通用无线电设备测试遥测仪，若听到清晰的“哔”声，表示遥测仪已激活；若听到嘶嘶声，则表示遥测仪未激活。
    注意：在确定记录时长之前，应考虑射频发射器电池的使用寿命。
  3. 设置采集软件，并同步遥测信号与视频系统，以同时采集脑电图（EEG）和视频数据。为每个植入式发射器分配一个信号接收器，并设置发射器的校准值。将采样率设为 1000 Hz，噪声检测范围设为 -500 mV 至 +500 mV，积分间隔设为 100 ms。不使用低通和高通滤波器。
  4. 开始遥测和视频记录。在采集癫痫样活动之前，先进行长期的基础状态记录。按照步骤 6.8 和 6.9 所述方法分析脑电图信号。

8. 尾静脉采血操作步骤

注意：真空采血系统包含一个蝶形针头（23 G x ¾ x 12（0.8 mm x 19 mm x 305 mm））。该采血技术可由一名操作者轻松完成，整个过程约需5分钟。

  1. 用1% K涂覆蝴蝶针及其管路2在采样前，用蒸馏水配制的 EDTA 快速冲洗，即吸取并排出 K2使用1 mL注射器从系统中吸取EDTA溶液。在针头后方剪断管路，以逐滴收集血液，无需抽吸（图1A).
  2. 将大鼠放入诱导室，用异氟烷（1.4% 混合空气，流速 1.2 mL/min）进行麻醉。随后转移至立体定位仪，通过面罩维持麻醉。将加热垫置于动物身下，使其尾部一部分与垫子直接接触。
  3. 轻轻将动物的身体侧向移动，使侧尾静脉保持在上方位置。
  4. 将尾巴浸入温水（42 °C）中 2 分钟以扩张侧静脉。用 70% 乙醇擦拭尾巴，使静脉更清晰可见。使用普通白炽灯对尾巴进行加温照射。
  5. 将21G蝶形针以20°角度刺入小鼠尾侧静脉，进针深度为5 mm。使用含有5 mg K的500 µL真空采血管采集血液。2EDTA 作为抗凝剂（图1B, C).
  6. 拔出针头，并通过按压穿刺部位止住血流。将大鼠放回其饲养笼中。
  7. 轻轻倒置试管10次，使抗凝剂与血液充分混匀。在冰上打孔，深度约1.5 cm，以放置采集管。将样本轻轻垂直插入冰孔中。
  8. 将血液样本在4 °C的冷藏离心机中以1300 x g离心 g 10分钟以分离血浆。该操作应在1小时内完成。
  9. 吸取约 200 µL 血浆，避免触及红细胞和白细胞层。将采集的血浆转移至 0.2 mL 无菌微量离心管中。如需保存，可在离心后 4 °C 下存放不超过 1 小时。
  10. 留取 5 µL 样品用于质量控制。将样品在 -80 °C 保存至分析。
    注意：即使某些研究人员建议使用，也不要使用真空装置28 或在步骤8.5所述操作过程中挤压尾部以获取更多血液，但需注意这会降低后续小非编码RNA定量分析的样本质量（详见代表性结果部分）。需注意，在大鼠中，单次采血的最大安全采血量为 <其总血容量的10%（即250-300克大鼠约1.6-1.9 mL）以及 <总血量的15%（约2.64 mL）在1个月内29在本方案中，单次最多采集500 µL血液，每只动物最多可采集五次。30,31.

9. 脑脊液采集步骤

注意：该技术可由单名操作者轻松完成，操作过程约需 2-4 分钟。用于采集脑脊液（CSF）的材料为低成本、一次性使用的真空蝶形针和提取管。在本方案中，使用连接无菌注射器的带翼蝶形输液装置以产生负压（图 2A）。

  1. 准备23G蝶形针，将其塑料护套剪裁，使裸露针尖端外露7 mm，以防止在回撤过程中针头深入枕大池超过7 mm（图2B）。
  2. 将带有聚合物导管的蝶形针连接至1 mL注射器。
  3. 将大鼠放入诱导室，使用异氟烷（空气中浓度1.4%；流速1.2 mL/min）进行麻醉。随后将异氟烷气流切换至立体定位仪，并通过面罩维持麻醉。用剃刀去除大鼠后脑及颈部的毛发。
  4. 用耳杆固定大鼠头部。将动物头部向下倾斜约45°，调节立体定位仪的鼻杆使其下降（图2C）。检查动物后脑部，寻找位于枕骨隆突与寰椎棘突之间、略呈凹陷的菱形区域。
  5. 用70%乙醇擦拭该区域，以增强其可见性并进行消毒。
  6. 将蝶形针垂直插入菱形凹陷区域的中心，进入枕大池以收集脑脊液，直至被裁剪合适的塑料护套阻挡，防止过度插入（图2D）。轻柔回拉1 mL注射器活塞，使脑脊液缓慢经针头流出。
  7. 收集约100 µL脑脊液至聚合物导管中（图2D）。避免血液或其他可见污染物进入。在靠近蝶形针处夹紧聚合物导管，并在此位置剪断导管。
  8. 将澄清（无污染）的样本吸入注射器中。若收集导管中出现可见污染，则弃去该污染样本。
  9. 将样本排入无菌的0.2 mL微量离心管中，置于冰上保存，最多可保存1小时。
  10. 对动物头部的脑脊液穿刺部位进行消毒。将大鼠从立体定位仪上取下，并放回笼中。
  11. 留取2 µL样本用于质量控制。其余样本储存于-80 °C，以备后续分析。
    ​注意：在大鼠中，若需重复多次采集脑脊液，建议每次采集量为100 µL32。本方案中，单次最多采集100 µL脑脊液，单只动物在15天内最多进行5次采集。

10. 样品质量的分光光度分析

注意：在正确采集脑脊液和血浆样本后，样本即可用于分光光度计分析，无需特殊处理。通过紫外分光光度法在414 nm处测定血红蛋白吸光度，以评估样本的溶血风险。大鼠样本的吸光度阈值设定为0.25。该阈值的选择可能取决于后续qPCR分析及其对小非编码RNA定量的具体要求。

  1. 打开紫外分光光度计。选择在 414 nm 单一波长下测定血浆或脑脊液吸光度的方法。点击 下一步。
  2. 用纯水冲洗 1 mm 比色皿。在比色皿的测量区域滴加 5 µL 70% 乙醇。用纸巾擦干，并用无絮擦拭纸擦拭。检查其是否完全透明。
  3. 在 1 mm 比色皿中加入 1.5 µL 纯水并盖上盖子。将比色皿插入分光光度计的测量室，点击 空白 按钮测定空白样品的吸光度。检查 414 nm 处的吸光度值是否为 0.000。
  4. 用纸巾擦干比色皿，并用无絮擦拭纸清洁。检查其是否完全透明。
  5. 在 1 mm 比色皿中加入 1.5 µL 样品并盖上盖子。将比色皿插入分光光度计的测量室。点击 样品 按钮测定样品，记录 414 nm 处的样品吸光度并进行标注。
  6. 继续对所有可用样品进行血红蛋白吸光度的定量测定。每次测定血浆或脑脊液样品前，交替点击 空白 和 样品 按钮，先测量空白样品。
  7. 将 A414 nm < 0.25 的样品保存于 -80 °C；若 A414 nm > 0.25，则弃置样品。
  8. 依次用纯水和 70% 乙醇冲洗 1 mm 比色皿，并将其干燥。
  9. 将空的比色皿盖好并放入测量室，以防落尘。关闭分光光度计。

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结果

报告了在9只对照组和18只慢性癫痫大鼠中进行的不同脑脊液（CSF）和血液采集操作的结果，所有大鼠均在癫痫持续状态（SE）后1个月植入电极，结果以成功率表示。植入电极后，所有大鼠均接受为期1个月的视频脑电图（video-EEG）监测，在实验最后两周内每3天进行一次脑脊液联合血液采集，共采集5次（即SE后第52、55、58、61和64天，dpSE）。通过不同动物多次采集的数据，比较了双头植入装置大鼠（带有用于脑脊液采集的导管）与仅植入系绳式或遥测电极动物（通过小脑延髓池穿刺采集脑脊液）在脑脊液采集成功率方面的差异（表1）。在不同动物中，评估了真空采血或尾部挤血对血浆样本质量的影响（表2）。为此，采用414 nm波长的紫外分光光度法检测游离血红蛋白。统计分析使用商业软件进行，采用Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行事后Tukey多重比较检验（p<0.05被认为具有统计学显著性）。数据以均值±标准误（SEM）表示。

在植入导管和穿刺的大鼠中多次采集脑脊...

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讨论

本研究介绍了一种易于掌握的大鼠脑脊液和血液采集技术，该技术不仅可用于癫痫模型的研究，也可用于阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化等其他神经系统疾病或病症的研究。在癫痫研究中，将这两种采样方法与视频脑电图（video-EEG）相结合，特别适用于探索不同可溶性分子水平与癫痫发作活动之间的相关性。正是出于这一特定目的，采用了持续的视频脑电图记录：i）以准确诊断癫痫，或 ii）监测疾病进展的不同阶段，和/或 iii）将采样时间与自发性癫痫发作的发生相关联。这些采样技术可在麻醉大鼠中进行，因而造成的应激最小。

关键步骤、故障排除与方法局限性
该实验方案包含若干关键技术步骤。首先，初次尝试时可能难以准确定位脑脊液采集位置。若操作者首次未能成功穿刺小脑延髓池，则后续任何尝试均会导致血液污染，因为动物会在针孔处出血。从这一角度来看，采集成功与否在很大程度上依赖于操作者的技能。其次，采血过程中的某些步骤需要特别注意。特别是，若操作者用乙醇过度摩擦尾部、用于尾静脉扩张的水温超过42 °C，或采集管中的血液与抗凝剂混合过于剧烈，均存在较高的溶血风险。在慢性癫痫...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由欧盟“地平线2020”计划（项目征集编号：H2020-FETOPEN-2018-2020）资助，资助协议号为964712（PRIME项目；资助对象：M. Simonato）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Vacutainer Safety-Lok 血液采集套装BD Italy SpA, Milan, Italy367246材料
血液采集管（Microtainer K2E）BD Italy SpA, Milan, Italy365975材料
蝶形带翼输液套件 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mmNipro, Osaka, Japan PSY-23-ET-ICU材料
ALC PK 130R 冷冻离心机DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England112000033材料
3-0 棉质缝合线Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA7343H材料
地西泮 5 mg/2ml，SolupamDechra Veterinary Products, Torino, Italy105183014 (AIC)溶液
遥测脑电图设置用数字视频 8 通道媒体记录系统Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USAPNM-VIDEO-008设备
有线脑电图设置用数字视频监控系统EZVIZ Network, Hangzhou, 中国台湾EZVIZ (V5.3.2)设备
基于稳定过氧化物和季铵盐活性的消毒剂Laboratoire Garcin-Bactinyl, FranceLB 920111溶液
假引导套管 8 mmAgn Tho's, Lindigö, SwedenCXD-8材料
三通道双绞电极Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPC材料
立体定位手术用电极固定器Agn Tho's, Lindigö, Sweden1776-P1设备
Eppendorf BioSpectrometer basicEppendorf AG, Hamburg, Germany6137设备

Eppendorf PCR 管 0.2 mL		Eppendorf Srl, Milan, Italy30124332材料
Eppendorf μ比色皿 G1.0Eppendorf AG, Hamburg, Germany6138设备
大鼠用柔性饲喂针头 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206材料
Grass Technology 装置Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40）
异氟烷 100%，IsoFloZoetis, Rome, Italy103287025 (AIC)溶液
氯胺酮（Imalgene）Merial, Toulouse, France221300288 (AIC)溶液
氯化锂 Sigma-Aldrich, Milan, ItalyL9650材料
微注射套管 31G 9 mmAgn Tho's, Lindigö SwedenCXMI-9材料
MP150 模块化数据采集与 分析系统 Biopac, Goleta, California, USAMP150WSW设备
眼科兽用软膏，Hylo nightUrsapharm, Milan, Italy941791927 (AIC)材料
盐酸匹鲁卡品Sigma-Aldrich, Milan, ItalyP6503材料
带接头的聚四氟乙烯管Agn Tho's, Lindigö, SwedenJT-10材料
生理盐水0.9% NaCl，pH 调至 7.0溶液
氢溴酸东莨菪碱三水合物Sigma-Aldrich, Milan, ItalyS2250材料
硝酸甲基东莨菪碱Sigma-Aldrich, Milan, ItalyS1876材料
1% 磺胺嘧啶银乳膏  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy025561010 (AIC)材料
Simplex 快速牙科甲基丙烯酸酯水泥  Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811材料
立体定位仪David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USAModel 963设备
蔗糖溶液10% 蔗糖溶于蒸馏水中自制溶液
1 mL 注射器 Biosigma, Cona, Venezia, Italy20,71,26,03,00,350材料
遥测仪Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USACTA-F40材料
遥测脑电图波形分析仪Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USANeuroScore v3-0设备
遥测系统Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA硬件加软件 Ponemah core 6.51设备
盐酸赛拉嗪Sigma-Aldrich, Milan, ItalyX1251材料

参考文献

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