该方案展示了对癫痫大鼠进行重复的脑脊液和血液采集，同时并行持续视频脑电图（EEG）监测。这些操作对于探索多种体液分子变化与癫痫发作活动之间的可能关联至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
由于体液成分反映了多种生理和病理动态，因此在许多实验背景下常采集生物液体样本，以检测感兴趣的分子，如激素、生长因子、蛋白质或小非编码RNA。一个具体实例是在癫痫生物标志物研究中采集生物液体。在这些研究中，理想的做法是通过平行采集脑脊液（CSF）和血浆，并考虑采样与癫痫发作之间的时间间隔，来比较分子在脑脊液和血浆中的水平。结合脑脊液和血浆采样，并在癫痫动物中进行视频脑电图（EEG）监测，是一种有前景的潜在诊断和预后生物标志物验证方法。本文描述了一种在持续视频脑电图监测的癫痫大鼠中，从枕大池采集脑脊液并同时从尾侧尾静脉采血的技术。该方法相较于其他常用技术具有显著优势：采样快速，疼痛和侵入性最小，且麻醉时间更短。此外，该方法可用于固定式或遥测脑电图记录的大鼠，并可在多个实验日中重复使用。通过缩短异氟烷麻醉时间以减少采样带来的应激，所测得的生物分子水平能更真实地反映其在体液中的实际浓度。根据所用分析检测方法的可行性，该技术可在进行脑电图记录的同时，用于测定多种不同分子的水平。
引言
脑脊液（CSF）和血液采样对于在临床前和临床研究中识别和验证癫痫生物标志物具有重要意义1,2。目前，癫痫的诊断以及大多数关于癫痫生物标志物的研究主要依赖脑电图（EEG）和神经影像学技术3,4,5。然而，这些方法存在若干局限性。除常规头皮记录外，在许多情况下，脑电图需要采用深度电极等侵入性技术6。脑成像方法的时间和空间分辨率较低，且相对昂贵、耗时较长7,8。因此，识别非侵入性、低成本且基于体液的生物标志物将提供一种极具吸引力的替代方案。此外，这些体液生物标志物还可与现有的诊断方法相结合，以提高其预测能力。
癫痫患者通常需要接受脑电图（EEG）9,10 和血液采样11,12,....
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方案
所有实验程序均已获得费拉拉大学机构动物护理和使用委员会以及意大利卫生部（批准号：D.M. 603/2022-PR）的批准，符合1986年11月24日欧洲共同体理事会关于实验和其他科学用途动物保护的指令（86/609/EEC）中规定的指南。本方案专门针对在脑电图（EEG）监测下从癫痫动物模型中获取的大鼠脑脊液（CSF）和血浆中的小非编码核糖核酸（sncRNAs）进行进一步的定量聚合酶链式反应（qPCR）分析而优化。如需更深入理解并改进手术操作，可选择参考相关的JoVE视频19,20,21。
1. 手术植入电极或遥测仪前的动物准备
注意：立体定位手术技术根据所使用的 EEG 系统而有所不同。以下方法部分描述了两种手术共有的操作步骤。
- 使用雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠（7–8 周龄，体重 250–290 g），饲养条件应符合当地关于实验动物护理和使用的法律法规。将动物饲养在标准环境中，自由摄取食物和饮用水。
- 在手术和实验方案开始前，对大鼠进行数天的适应性操作处理。
- 使用立体定位仪进行电极或遥测仪的植入。遵循现行的无菌手术标准....
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结果
报告了在9只对照组和18只慢性癫痫大鼠中进行的不同脑脊液（CSF）和血液采集操作的结果，所有大鼠均在癫痫持续状态（SE）后1个月植入电极，结果以成功率表示。植入电极后，所有大鼠均接受为期1个月的视频脑电图（video-EEG）监测，在实验最后两周内每3天进行一次脑脊液联合血液采集，共采集5次（即SE后第52、55、58、61和64天，dpSE）。通过不同动物多次采集的数据，比较了双头植入装置大鼠（带有用于脑脊液采集的导管）与仅植入系绳式或遥测电极动物（通过小脑延髓池穿刺采集脑脊液）在脑脊液采集成功率方面的差异（表1）。在不同动物中，评估了真空采血或尾部挤血对血浆样本质量的影响（表2）。为此，采用414 nm波长的紫外分光光度法检测游离血红蛋白。统计分析使用商业软件进行，采用Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行事后Tukey多重比较检验（p<0.05被认为具有统计学显著性）。数据以均值±标准误（SEM）表示。
在植入导管和穿刺的大鼠中多次采集脑脊.......
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讨论
本研究介绍了一种易于掌握的大鼠脑脊液和血液采集技术，该技术不仅可用于癫痫模型的研究，也可用于阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化等其他神经系统疾病或病症的研究。在癫痫研究中，将这两种采样方法与视频脑电图（video-EEG）相结合，特别适用于探索不同可溶性分子水平与癫痫发作活动之间的相关性。正是出于这一特定目的，采用了持续的视频脑电图记录：i）以准确诊断癫痫，或 ii）监测疾病进展的不同阶段，和/或 iii）将采样时间与自发性癫痫发作的发生相关联。这些采样技术可在麻醉大鼠中进行，因而造成的应激最小。
关键步骤、故障排除与方法局限性
该实验方案包含若干关键技术步骤。首先，初次尝试时可能难以准确定位脑脊液采集位置。若操作者首次未能成功穿刺小脑延髓池，则后续任何尝试均会导致血液污染，因为动物会在针孔处出血。从这一角度来看，采集成功与否在很大程度上依赖于操作者的技能。其次，采血过程中的某些步骤需要特别注意。特别是，若操作者用乙醇过度摩擦尾部、用于尾静脉扩张的水温超过42 °C，或采集管中的血液与抗凝剂混合过于剧烈，均存在较高的溶血风险。在慢性癫痫.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由欧盟“地平线2020”计划（项目征集编号：H2020-FETOPEN-2018-2020）资助，资助协议号为964712（PRIME项目；资助对象：M. Simonato）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer Safety-Lok 血液采集套装 | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | 材料 |
| 血液采集管（Microtainer K2E） | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | 材料 |
| 蝶形带翼输液套件 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | 材料 |
| ALC PK 130R 冷冻离心机 | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | 材料 |
| 3-0 棉质缝合线 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | 材料 |
| 地西泮 5 mg/2ml，Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | 溶液 |
| 遥测脑电图设置用数字视频 8 通道媒体记录系统 | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | 设备 |
| 有线脑电图设置用数字视频监控系统 | EZVIZ Network, Hangzhou, 中国台湾 | EZVIZ (V5.3.2) | 设备 |
| 基于稳定过氧化物和季铵盐活性的消毒剂 | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | 溶液 |
| 假引导套管 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | 材料 |
| 三通道双绞电极 | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | 材料 |
| 立体定位手术用电极固定器 | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | 设备 |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | 设备 |
Eppendorf PCR 管 0.2 mL | Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | 材料 |
| Eppendorf μ比色皿 G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | 设备 |
| 大鼠用柔性饲喂针头 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | 材料 |
| Grass Technology 装置 | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | 设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40） |
| 异氟烷 100%，IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | 溶液 |
| 氯胺酮（Imalgene） | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | 溶液 |
| 氯化锂 | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | 材料 |
| 微注射套管 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | 材料 |
| MP150 模块化数据采集与 分析系统 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | 设备 |
| 眼科兽用软膏，Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | 材料 |
| 盐酸匹鲁卡品 | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | 材料 |
| 带接头的聚四氟乙烯管 | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | 材料 |
| 生理盐水 | 0.9% NaCl，pH 调至 7.0 | 溶液 | |
| 氢溴酸东莨菪碱三水合物 | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | 材料 |
| 硝酸甲基东莨菪碱 | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | 材料 |
| 1% 磺胺嘧啶银乳膏 | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | 材料 |
| Simplex 快速牙科甲基丙烯酸酯水泥 | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | 材料 |
| 立体定位仪 | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | 设备 |
| 蔗糖溶液 | 10% 蔗糖溶于蒸馏水中 | 自制 | 溶液 |
| 1 mL 注射器 | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | 材料 |
| 遥测仪 | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | 材料 |
| 遥测脑电图波形分析仪 | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | 设备 |
| 遥测系统 | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | 硬件加软件 Ponemah core 6.51 | 设备 |
| 盐酸赛拉嗪 | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | 材料 |
参考文献
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
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