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方法文章

肿瘤发生过程中抗原特异性CD8+ T细胞动态变化评估的引流淋巴结转移模型

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DOI：

10.3791/65646

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2024年1月26日

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1College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute of Cancer, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, 5Institute of life science, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所提出的实验设计为研究淋巴结（LN）转移过程中抗原特异性CD8+ T细胞提供了一个有效的生殖模型，该模型排除了旁观者CD8+ T细胞的干扰。

摘要

引流淋巴结中的肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞在肿瘤发生过程中对启动抗肿瘤免疫应答的重要性日益凸显。然而，在许多情况下，癌细胞会在进一步转移至远端器官之前，先在淋巴结中形成转移灶。淋巴结转移在多大程度上影响局部和系统性的CD8+ T细胞应答，目前仍不明确。为此，我们建立了一种小鼠淋巴结转移模型，结合表达来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）糖蛋白（GP）的替代新抗原的B16F10-GP黑色素瘤细胞系，以及携带针对由主要组织相容性复合体I类分子H-2Db呈递的GP33-41肽段特异性T细胞受体（TCR）的P14转基因小鼠。该方案可用于研究淋巴结转移过程中抗原特异性CD8+ T细胞的应答情况。在本方案中，将B16F10-GP细胞皮下植入C57BL/6J小鼠体内，随后进行初始P14细胞的过继转移。当皮下肿瘤生长至直径约5 mm时，切除原发肿瘤，并将B16F10-GP细胞直接注射至肿瘤引流淋巴结（TdLN）中。随后，在淋巴结转移过程中动态监测CD8+ T细胞的变化。总体而言，该模型为精确研究淋巴结转移期间抗原特异性CD8+ T细胞免疫应答提供了一种有效方法。

引言

癌症免疫治疗，尤其是免疫检查点阻断（ICB），已彻底改变了癌症治疗方式1。ICB通过阻断共抑制性免疫受体（如PD-1、Tim-3、LAG-3和TIGIT），这些受体在肿瘤微环境（TME）中耗竭的CD8+ T细胞上高表达，从而重新激活耗竭的CD8+ T细胞2。鉴于耗竭型CD8+ T细胞的异质性，越来越多的证据表明，肿瘤特异性CD8+ T细胞来源于外周，包括引流淋巴结（dLN），而非TME，介导了ICB的疗效3,4,5,6,7,8。最近研究证实，来源于TdLN的TCF-1+TOX-肿瘤特异性记忆CD8+ T细胞（TdLN-TTSM）是ICB真正的响应细胞，这类细胞具有传统记忆T细胞的多种功能特性，并可在ICB治疗后进一步扩增并分化为子代耗竭细胞9。综上所述，这些发现进一步证实了淋巴结在启动抗肿瘤免疫反应中的重要性。

淋巴结通过提供结构基础和生物学信号，在促进肿瘤特异性CD8+ T细胞的启动和活化过程中发挥关键作用10。在系统性扩散之前，多种类型的癌细胞常会定植于前哨淋巴结（SLN，即引流原发肿瘤的第一个淋巴结）11。SLN转移的存在与人类癌症的不良预后相关，临床前模型表明，转移性淋巴结（TdLN）中的肿瘤细胞可通过淋巴管和血管扩散至远端器官12,13,14,15。目前，SLN活检已成为许多实体瘤类型中指导后续治疗决策的标准操作，可避免对未受累淋巴结进行不必要的切除16,17。即使对于已受累的淋巴结，是否以及何时需要手术切除仍存在争议，因为多项研究显示，与接受放疗或全身治疗但未行区域淋巴结切除的患者相比，切除区域淋巴结并未表现出总体生存率的改善18,19。一种解释是，存在微小病灶的转移性淋巴结（mLN）可能仍保留部分教育免疫细胞的能力，并提供一定的治疗益处。因此，阐明淋巴结转移如何影响抗肿瘤免疫应答，特别是TdLN-TTSM的特性与功能，具有重要意义。

迄今为止，临床前和临床数据均揭示了mLN中存在一些结构和细胞层面的改变20。然而，肿瘤特异性CD8+ T细胞在LN转移过程中的动态变化尚未被明确阐明。因此，建立一个具有说服力的LN转移模型对于进一步研究十分必要。事实上，已有若干研究通过不同方法报道了mLN小鼠模型14,21,22。例如，通过将4T1乳腺癌细胞植入乳腺脂肪垫，可诱导腋窝LN的自发性转移22。在另一项研究中，Reticker-Flynn等人通过对分离自mLN组织的肿瘤细胞进行连续传代接种（共九轮），建立了从皮下原发肿瘤向LN高转移的黑色素瘤细胞系14。另一种常用的模型是将肿瘤细胞注射至足垫，随后在腘窝LN形成转移灶22。值得注意的是，由于这些模型中的LN转移过程并不总是稳定可靠，因此难以准确评估干预措施的具体时间点。

在本研究中，通过向小鼠淋巴结内注射B16F10-GP细胞建立了小鼠淋巴结转移模型23,24，该细胞系是通过CRISPR/Cas9技术将LCMV病毒糖蛋白（GP）基因序列插入B16F10细胞基因组而获得的9。随后，将携带转基因T细胞受体（TCR）的P14细胞转移至这些小鼠体内，该受体可特异性识别H-2Db GP33-41 表位25,26，从而可研究淋巴结转移过程中抗原特异性CD8+ T细胞的全身性与局部动态变化。我们的实验设计提供了一个有效的模型，用于研究免疫应答，特别是排除了旁观者CD8+ T细胞干扰情况下的淋巴结转移过程中抗原特异性CD8+ T细胞的行为。这些结果将影响临床治疗中关于是否切除或保留转移性淋巴结（mLN）的决策，并为调控mLN以实现最佳治疗效果提供新的思路。

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方案

实验所用C57BL/6J小鼠（简称B6小鼠）和 naive P14 转基因小鼠9,27均为6-10周龄，体重18-22 g。实验包含雄性和雌性小鼠，未进行随机分组或盲法处理。所有动物实验均依照青岛农业大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。

1. 培养基与试剂的准备

  1. 通过在DMEM中加入10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺以及额外添加100 U/mL嘌呤霉素，配制B16F10-GP黑色素瘤细胞培养基（称为D10，即完全DMEM培养基）。保持D10无菌，并在2–4 °C下保存，最多可保存2周。
  2. 通过在RPMI-1640培养基中加入2% FBS、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺，配制R2培养基（用于终止红细胞裂解）。
  3. 通过在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2% FBS和0.01%叠氮化钠，配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。添加叠氮化钠可延长FACS缓冲液的保存时间，可在2–4 °C下保存数月。
  4. 通过将155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3和0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶于双蒸水中，并调节pH至7.3，配制红细胞裂解（RBL）缓冲液。将RBL缓冲液在室温（RT）下保存，可稳定长达3个月。
  5. 按以下方法配制麻醉剂2,2,2-三溴乙醇。
    1. 在用铝箔包裹的50 mL无菌锥形管中称取适量的2,2,2-三溴乙醇晶体，加入适量2-甲基-2-丁醇溶解，配制成浓度为500 mg/mL的储存液。
    2. 轻轻旋转混匀，并将管子置于37 °C水浴中加热，直至晶体完全溶解。确保所有晶体均完全溶解。
    3. 充分混匀溶液，使用0.22 µm滤器将储存液过滤至无菌容器中。储存液应冷冻避光保存于-20 °C；或用PBS稀释成12.5 mg/mL的工作液，保存于4 °C。
      ​注意：建议使用规定浓度，因较高浓度的液体具有刺激性。

2. B16F10-GP 细胞悬液的制备

  1. 在细胞培养箱中，将一管 1 × 106 个 B16F10-GP 细胞用 5 mL D10 培养基解冻并进行培养，条件为 37 °C、5% CO2。当细胞密度达到 80% 至 90% 时，按以下步骤进行传代培养。
    1. 使用移液枪抽吸弃去原始培养基，并用 PBS 洗涤细胞 2 次。清洗贴壁细胞时，应将 PBS 沿培养皿侧壁加入或滴入培养皿中。
    2. 抽吸弃去 PBS 后，向细胞培养皿或培养瓶中加入 0.5–1 mL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，轻轻晃动使溶液均匀覆盖整个细胞表面。将培养皿或培养瓶置于 37 °C 培养箱中约 1 分钟，或在室温下孵育，直至细胞变圆并脱落。借助倒置显微镜观察细胞脱落情况。
    3. 加入等体积新配制的 D10 培养基以终止胰蛋白酶消化。用移液枪吹打培养瓶底部表面，确保所有细胞均被充分解离。
    4. 将 B16F10-GP 细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 163 × g 离心 4 分钟。
    5. 抽吸弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1–2 mL D10 培养基中。将 B16F10-GP 细胞悬液转移至含有 8–10 mL D10 培养基的新细胞培养皿或培养瓶中，于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中继续培养。
  2. 在肿瘤接种当天，按照步骤 2.1.1 至 2.1.4 收集约 90% 密度的 B16F10-GP 细胞。离心后，抽吸弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
  3. 使用 0.4% 台盼蓝染色法进行活细胞计数。加入 PBS 将细胞稀释至每 100 µL 含 5 × 105 个细胞。将细胞置于冰上保存，待用。

3. B16F10-GP细胞的异位接种 双侧 小鼠腹股沟区域

  1. 使用1 mL注射器吸取100 µL制备好的B16F10-GP细胞悬液。轻弹管壁使气泡移至顶部，推动活塞排出顶部气泡。
  2. 将小鼠固定于仰卧位，暴露其腹部。用手指按压处于仰卧位小鼠的右侧后肢，使右侧腹股沟区域皮肤充分暴露（左侧腹股沟区域操作相同）。
  3. 使用脱毛膏去除腹部毛发，然后用含75%乙醇的棉球清洁双侧腹部区域。
  4. 在插入针头前，确保腹股沟区域皮肤绷紧。以45°角将针头插入大腿上部腹股沟区域的皮下间隙，确保针尖斜面 朝上，进针深度为0.5–1 cm。
  5. 注射前轻轻回抽，若无血液回流，缓慢将细胞注入皮下组织。同时观察皮下区域是否形成一个小的液囊（液体积聚）。
  6. 注射完成后拔出针头，将其放入锐器盒，并将小鼠放回笼中。

4. 将P14 T细胞过继转移至荷瘤小鼠

  1. 在肿瘤接种后6-8天，当肿瘤可触及（直径约3-5 mm）时，对荷瘤小鼠进行过继性细胞转移。转移前一天腹腔注射4 mg环磷酰胺28,29,30。
    注意：CTX注射的目的是通过暂时清除增殖的淋巴细胞，在淋巴系统中为过继转移的T细胞腾出空间。
  2. 按照以下方法31,32，从未经处理的P14转基因小鼠（6-10周龄，性别与荷瘤小鼠一致，以避免排斥反应）的脾脏和淋巴结中分离淋巴细胞。
    注意：以下所有操作均应在生物安全柜中进行，以确保严格的无菌条件。
    1. 准备两个6 cm培养皿，其中一个加入3 mL R2培养基，另一个加入3 mL RBL缓冲液。在盛有RBL缓冲液的培养皿中放置一个70 µm细胞滤器。
    2. 将P14小鼠置于含有异氟烷的密闭容器中实施安乐死，随后进行颈椎脱位。根据受体小鼠的数量调整P14小鼠的数量。
    3. 取出安乐死后小鼠的脾脏、腹股沟淋巴结和腋下淋巴结，并转移至盛有4 mL R2培养基并置于冰上的6 cm培养皿中。
    4. 将脾脏置于已浸润3 mL RBL缓冲液的滤筛中，用1 mL注射器的推杆研磨脾脏。室温孵育1-2分钟，然后加入3 mL冷R2培养基终止反应。
    5. 用1 mL注射器的推杆研磨淋巴结，直至滤筛（70 µm细胞滤器）中仅剩结缔组织。用冷R2培养基冲洗滤器，并将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。在4 °C下以500 × g离心6分钟。
    6. 弃去上清液，用3 mL PBS重悬细胞。使用70 µm细胞滤器去除细胞悬液中的絮状物。
    7. 在4 °C下以500 × g离心6分钟。用3 mL PBS重悬细胞，并将离心管置于冰上。取少量细胞样本，与台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。
  3. 通过流式细胞术测定P14（活/死-CD45.1+CD8+Vα2+）细胞的比例。确保所转移的供体细胞与受体小鼠具有不同的同源标记（荷瘤B6小鼠为CD45.2+）。在转移前进行染色，以验证所转移细胞的正确表型。
    1. 将5 × 104–1 × 105个细胞加入含有1 mL FACS缓冲液的1.5 mL离心管中。在4 °C下以500 × g离心3分钟。
    2. 弃去上清液，轻弹管底使细胞分散，并将离心管置于冰上。
    3. 在100 µL FACS缓冲液中配制以下偶联抗体混合物9,32：抗CD8抗体（1:200）、抗TCR Vα2抗体（1:100）、抗CD45.1抗体（1:200）、活/死染料（1:400）。（材料表）。
    4. 将抗体混合物在15,000 × g下离心3分钟，以聚集颗粒。将混合物置于冰上，并用铝箔包裹避光。仅取上清液使用，避免吸入颗粒。
    5. 用100 µL抗体混合物重悬细胞，并通过轻弹管壁充分混匀。用锡箔纸包裹后，在冰上孵育30分钟。
    6. 用FACS缓冲液洗涤细胞两次。在4 °C下以500 × g离心3分钟。用200 µL FACS缓冲液重悬细胞，并将细胞悬液转移至流式管中。
    7. 将染色后的细胞上机进行流式细胞术检测，以确定活/死-CD45.1+CD8+Vα2+细胞的比例。
      注意：通常，来自P14转基因小鼠的CD8+ T细胞中超过90%表达Vα2+ TCR，该受体特异性识别LCMV（淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒）的H-2Db GP33-41表位。
  4. 将步骤4.2和4.3中获得的活细胞数与其百分比相乘，计算出活/死-CD45.1+CD8+Vα2+细胞的绝对数量。
  5. 使用100 U胰岛素注射器吸取200 µL P14细胞悬液（含5 × 105个细胞），并去除气泡。初始转移的 naïve P14 细胞数量（5 × 103–5 × 105）不会影响所转移细胞的表型9。
  6. 将小鼠放入笼中，用红外灯加热 5-10分钟，以扩张尾静脉。使用合适尺寸的小鼠固定器固定小鼠，拉直尾巴，并用含75%乙醇的棉球擦拭尾部，使静脉清晰可见。
  7. 将针头平行于尾静脉插入，并轻轻回抽活塞。若观察到血液进入注射器，缓慢将细胞悬液推入静脉。
    注意：若注射过程中出现阻力或尾部肿胀，需调整注射位置。注射应从尾部远端开始。
  8. 注射完成后，迅速拔出针头，并用棉球轻轻按压注射部位。将小鼠放回新的清洁笼中，并密切观察数分钟，以监测任何不良反应。

5. 原发肿瘤的切除

注意：确保所有手术器械在使用前均已高压灭菌。用75%乙醇对生物安全柜内的操作区域进行消毒，随后进行至少30分钟的紫外线照射。手术过程中需穿戴洁净的手术服、帽子、口罩和无菌手套。

  1. 当肿瘤可触及（直径约5 mm）时，切除原发肿瘤。
  2. 通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过夹捏足垫评估麻醉程度，若无疼痛反射，表明已达到适宜的手术时机。若后肢出现回缩反应，需追加10–30 µL麻醉剂。
    注意：或者，可采用腹腔注射美托咪啶 推荐使用（1 mg/kg 体重；Domitor）对小鼠进行麻醉。
  3. 在小鼠眼部涂抹防干燥眼膏。使用脱毛膏去除腹部毛发，充分暴露手术区域。
  4. 将小鼠置于生物安全柜内，仰卧于铺有洁净吸水纸的解剖板上，使小鼠的长轴与实验者平行。
    注意：为维持严格的无菌环境，以下操作必须在生物安全柜中进行。
  5. 用浸有聚维酮碘的棉球对小鼠腹部进行消毒。使用无菌手术刀或眼科剪在荷瘤部位附近切开皮肤。将闭合的剪刀尖端插入切口，充分暴露肿瘤。切开皮肤时，注意避免损伤腹股沟淋巴结。
  6. 在切除肿瘤时，应尽可能保持包膜完整。使用无菌剪刀仔细轻柔地去除肿瘤周围的结缔组织。切除肿瘤 原位 彻底清除，否则可能会复发。

6. 腹股沟淋巴结内注射 B16F10-GP 细胞

注意：双侧肿瘤清除后，将 B16F10-GP 细胞注射至单侧腹股沟淋巴结，同时将 PBS 注射至 对侧。

  1. 用100 U胰岛素注射器吸取20 µL（5 x 104 个细胞）B16F10-GP细胞悬液，排出气泡后，注入一侧腹股沟淋巴结。在另一侧腹股沟淋巴结中注入等体积的PBS。
    1. 注射时，从淋巴结远端插入针头，然后缓慢推进至淋巴结中心。此时若液体准确注入淋巴结内，可见淋巴结明显肿胀。
      注意：从淋巴结远端插入针头时，务必避免刺穿淋巴结。
  2. 使用3-0缝线对切口进行2-3针缝合。用浸有聚维酮碘的棉签对伤口周围皮肤进行消毒。缝合时注意避开淋巴结。
  3. 将小鼠置于清洁笼中，侧卧位下用红外线灯保温。持续监测直至意识恢复。确保术后小鼠完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
  4. 术后连续3天每4-6小时给予一次布托啡诺，以缓解术后疼痛（剂量为0.1-0.5 mg/kg，皮下或腹腔注射）。监测小鼠的进食、饮水、活动及行为状态。通常小鼠在术后3天内可从手术创伤中恢复。
    注意：若小鼠无法恢复正常进食和活动，或出现任何感染迹象，应咨询兽医进行干预或实施安乐死。
  5. 在不同时间点处死小鼠：肿瘤细胞淋巴结内注射后第8天和第18天。通过流式细胞术分析回收活化的供体细胞。

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结果

本实验设计的示意图见图1A。将5 × 105个B16F10-GP细胞溶于100 µL PBS中，皮下（s.c.）接种至CD45.2 C57BL/6J小鼠双侧腹股沟区域。7天后，对荷瘤小鼠腹腔内（i.p.）注射4 mg CTX，随后通过尾静脉（i.v.）注射过继转移5 × 105个CD45.1+P14细胞。当肿瘤生长至直径约3–5 mm（P14细胞转移后约7天）时，切除原发肿瘤，并将5 × 104个B16F10-GP细胞溶于20 µL PBS中直接注射至单侧腹股沟淋巴结。对侧腹股沟淋巴结则注射等体积的PBS。在指定时间点，非转移性淋巴结（nLN）和转移性淋巴结（mLN）的代表性苏木精-伊红（H&E，100倍）染色结果如图1B所示。nLN结构完整。在淋巴结转移早期（第8天），mLN部分区域被肿瘤细胞占据（黑色箭头），仍存在部分未被肿瘤细胞侵袭的淋巴细胞区域（红色箭头）。而在淋巴结转移晚期（第18天），mLN几乎完全被肿瘤细胞填充...

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讨论

在肿瘤发生过程中，抗原呈递细胞（APCs）吞噬肿瘤抗原并迁移至肿瘤引流淋巴结（TdLN），在此处启动CD8+ T细胞。经过启动和活化后，CD8+ T细胞离开TdLN并浸润肿瘤组织，以杀伤肿瘤细胞10。通过切除TdLN以及使用FTY720阻断免疫细胞从淋巴器官中逸出，多项研究已证实TdLN在确保PD-1/PD-L1检查点治疗疗效中的关键作用34,35。与此一致，我们最近发现肿瘤特异性记忆性CD8+ T细胞（TTSM）主要驻留在TdLN中，这些TdLN中的TTSM细胞是免疫检查点阻断（ICB）治疗的真实响应者9。然而，不幸的是，多种类型的癌细胞常从原发肿瘤部位扩散至TdLN，导致TdLN结构重塑及免疫细胞功能障碍。mLN中CD8+ T细胞数量和质量的受损已有报道20...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金优秀青年基金（No. 82122028，LX）、国家自然科学基金（No. 82173094，LX）和重庆市自然科学基金（No. 2023NSCQ-BHX0087，SW）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管KIRGENKG2211
100 U 胰岛素注射器BD 生物科学 320310
15 mL 一次性离心管 比弗 43008
2,2,2-三溴乙醇（Avertin） Sigma T48402-25G 
2-甲基-2-丁醇Sigma240486-100ML 
70 μm 尼龙细胞滤网BD Falcon 352350
APC 抗小鼠 CD45.1 BioLegend 110714克隆：A20 
B16-GP 细胞系中国北京百奥赛图基因科技有限公司自定义
BSA-V（牛血清白蛋白） Biossbs-0292P
细胞培养皿比弗 43701/43702/43703 
离心机Eppendorf5810R-A462/5424R 
环磷酰胺Sigma C0768-25G 
环磷酰胺（CTX）SigmaPHR1404
杜尔贝科改良伊格尔培养基 Gibco C11995500BT 
EDTASigmaEDS-500g 
FACS 管BD Falcon352052
胎牛血清 Gibco10270-106
流式细胞仪BDFACSCanto II
血细胞计数板PorLab 科学HM330
异氟烷真实世界数据生命科学 R510-22-16 
KHCO3 Sangon Biotech A501195-0500 
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒（适用于633或635 nm激发） Life Technologies L10199 
持针器 RWD生命科学 F31034-14 
NH4Cl Sangon BiotechA501569-0500 
多聚甲醛BeyotimeP0099-500ml 
PE 抗小鼠 TCR Vα2BioLegend127808克隆：B20.1 
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液）Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD8a BioLegend100734克隆：53-6.7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
叠氮化钠SigmaS2002 
手术镊RWD生命科学 F12005-10
手术剪RWD Life Science S12003-09 
缝合线RWD生命科学F34004-30 
胰蛋白酶-EDTASigmaT4049-100ml

参考文献

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