肿瘤发生过程中抗原特异性CD8+ T细胞动态变化评估的引流淋巴结转移模型

摘要

本文所提出的实验设计为研究淋巴结（LN）转移过程中抗原特异性CD8⁺ T细胞提供了一个有效的生殖模型，该模型排除了旁观者CD8⁺ T细胞的干扰。

摘要

引流淋巴结中的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞在肿瘤发生过程中对启动抗肿瘤免疫应答的重要性日益凸显。然而，在许多情况下，癌细胞会在进一步转移至远端器官之前，先在淋巴结中形成转移灶。淋巴结转移在多大程度上影响局部和系统性的CD8⁺ T细胞应答，目前仍不明确。为此，我们建立了一种小鼠淋巴结转移模型，结合表达来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）糖蛋白（GP）的替代新抗原的B16F10-GP黑色素瘤细胞系，以及携带针对由主要组织相容性复合体I类分子H-2D^b呈递的GP_33-41肽段特异性T细胞受体（TCR）的P14转基因小鼠。该方案可用于研究淋巴结转移过程中抗原特异性CD8⁺ T细胞的应答情况。在本方案中，将B16F10-GP细胞皮下植入C57BL/6J小鼠体内，随后进行初始P14细胞的过继转移。当皮下肿瘤生长至直径约5 mm时，切除原发肿瘤，并将B16F10-GP细胞直接注射至肿瘤引流淋巴结（TdLN）中。随后，在淋巴结转移过程中动态监测CD8⁺ T细胞的变化。总体而言，该模型为精确研究淋巴结转移期间抗原特异性CD8⁺ T细胞免疫应答提供了一种有效方法。

引言

癌症免疫治疗，尤其是免疫检查点阻断（ICB），已彻底改变了癌症治疗方式¹。ICB通过阻断共抑制性免疫受体（如PD-1、Tim-3、LAG-3和TIGIT），这些受体在肿瘤微环境（TME）中耗竭的CD8⁺ T细胞上高表达，从而重新激活耗竭的CD8⁺ T细胞²。鉴于耗竭型CD8⁺ T细胞的异质性，越来越多的证据表明，肿瘤特异性CD8⁺ T细胞来源于外周，包括引流淋巴结（dLN），而非TME，介导了ICB的疗效^3,4,5,6,7,8。最近研究证实，来源于TdLN的TCF-1⁺TOX^-肿瘤特异性记忆CD8⁺ T细胞（TdLN-T_TSM）是ICB真正的响应细胞，这类细胞具有传统记忆T细胞的多种功能特性，并可在ICB治疗后进一步扩增并分化为子代耗竭细胞

方案

实验所用C57BL/6J小鼠（简称B6小鼠）和 naive P14 转基因小鼠^9,27均为6-10周龄，体重18-22 g。实验包含雄性和雌性小鼠，未进行随机分组或盲法处理。所有动物实验均依照青岛农业大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。

1. 培养基与试剂的准备

1. 通过在DMEM中加入10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺以及额外添加100 U/mL嘌呤霉素，配制B16F10-GP黑色素瘤细胞培养基（称为D10，即完全DMEM培养基）。保持D10无菌，并在2–4 °C下保存，最多可保存2周。
2. 通过在RPMI-1640培养基中加入2% FBS、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺，配制R2培养基（用于终止红细胞裂解）。
3. 通过在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2% FBS和0.01%叠氮化钠，配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。添加叠氮化钠可延长FACS缓冲液的保存时间，可在2–4 °C下保存数月。
4. 通过将155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃和0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶于双蒸水中，并调节pH至7.3，配制红细胞裂解（RBL）缓冲液。将RBL缓冲液在....

结果

本实验设计的示意图见图1A。将5 × 10⁵个B16F10-GP细胞溶于100 µL PBS中，皮下（s.c.）接种至CD45.2 C57BL/6J小鼠双侧腹股沟区域。7天后，对荷瘤小鼠腹腔内（i.p.）注射4 mg CTX，随后通过尾静脉（i.v.）注射过继转移5 × 10⁵个CD45.1⁺P14细胞。当肿瘤生长至直径约3–5 mm（P14细胞转移后约7天）时，切除原发肿瘤，并将5 × 10⁴个B16F10-GP细胞溶于20 µL PBS中直接注射至单侧腹股沟淋巴结。对侧腹股沟淋巴结则注射等体积的PBS。在指定时间点，非转移性淋巴结（nLN）和转移性淋巴结（mLN）的代表性苏木精-伊红（H&E，100倍）染色结果如图1B所示。nLN结构完整。在淋巴结转移早期（第8天），mLN部分区域被肿瘤细胞占据（黑色箭头），仍存在部分未被肿瘤细胞侵袭的淋巴细胞区域（红色箭头）。而在淋巴结转移晚期（第18天），mLN几乎完全被肿瘤细胞填充.......

讨论

在肿瘤发生过程中，抗原呈递细胞（APCs）吞噬肿瘤抗原并迁移至肿瘤引流淋巴结（TdLN），在此处启动CD8⁺ T细胞。经过启动和活化后，CD8⁺ T细胞离开TdLN并浸润肿瘤组织，以杀伤肿瘤细胞¹⁰。通过切除TdLN以及使用FTY720阻断免疫细胞从淋巴器官中逸出，多项研究已证实TdLN在确保PD-1/PD-L1检查点治疗疗效中的关键作用^34,35。与此一致，我们最近发现肿瘤特异性记忆性CD8⁺ T细胞（T_TSM）主要驻留在TdLN中，这些TdLN中的T_TSM细胞是免疫检查点阻断（ICB）治疗的真实响应者⁹。然而，不幸的是，多种类型的癌细胞常从原发肿瘤部位扩散至TdLN，导致TdLN结构重塑及免疫细胞功能障碍。mLN中CD8⁺ T细胞数量和质量的受损已有报道^20.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	KIRGEN	KG2211
100 U 胰岛素注射器	BD 生物科学	320310
15 mL 一次性离心管	比弗	43008
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）	Sigma	T48402-25G
2-甲基-2-丁醇	Sigma	240486-100ML
70 μm 尼龙细胞滤网	BD Falcon	352350
APC 抗小鼠 CD45.1	BioLegend	110714	克隆：A20
B16-GP 细胞系	中国北京百奥赛图基因科技有限公司	自定义
BSA-V（牛血清白蛋白）	Bioss	bs-0292P
细胞培养皿	比弗	43701/43702/43703
离心机	Eppendorf	5810R-A462/5424R
环磷酰胺	Sigma	C0768-25G
环磷酰胺（CTX）	Sigma	PHR1404
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS 管	BD Falcon	352052
胎牛血清	Gibco	10270-106
流式细胞仪	BD	FACSCanto II
血细胞计数板	PorLab 科学	HM330
异氟烷	真实世界数据生命科学	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒（适用于633或635 nm激发）	Life Technologies	L10199
持针器	RWD生命科学	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
多聚甲醛	Beyotime	P0099-500ml
PE 抗小鼠 TCR Vα2	BioLegend	127808	克隆：B20.1
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液）	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD8a	BioLegend	100734	克隆：53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
叠氮化钠	Sigma	S2002
手术镊	RWD生命科学	F12005-10
手术剪	RWD Life Science	S12003-09
缝合线	RWD生命科学	F34004-30
胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T4049-100ml