用于评估肿瘤发生过程中抗原特异性 CD8⁺ T 细胞动力学的引流淋巴结转移模型

癌症免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断 （ICB），彻底改变了癌症治疗¹。ICB 阻断在肿瘤微环境 （TME） 中耗竭的 CD8⁺ T 细胞中高表达的抑制性免疫受体（如 PD-1、Tim-3、LAG-3 和 TIGIT），导致耗竭的 CD8⁺ T 细胞重新焕发活力²。考虑到耗竭的 CD8⁺ T 细胞的异质性，越来越多的证据表明，来源于外周的肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞，包括引流淋巴结 （dLN），但不在 TME 中，介导 ICB ^3,4,5,6,7,8 的疗效。最近，TdLN 衍生的 TCF-1⁺TOX^- 肿瘤特异性记忆 CD8⁺ T 细胞 （TdLN-T_TSM） 被证实是 ICB 的真正应答者，它体现了传统记忆 T 细胞的多种功能特性，并且在 ICB 处理后可以进一步扩增和分化为后代耗竭细胞⁹。总而言之，这些发现证实了LN在增强抗肿瘤免疫力方面的重要性。

淋巴结通过提供结构基础和生物信号，在促进肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞的启动和激活方面发挥着关键作用¹⁰。在系统播散之前，几种类型的癌细胞经常播种前哨淋巴结（SLN，第一个引流原发肿瘤的 LN）¹¹。SLN 转移的存在与人类癌症的不良预后有关，临床前模型表明 TdLN 中的肿瘤细胞可以通过淋巴管和淋巴结¹²、^13、14、15 的血管扩散到远处器官。SLN 活检现在代表了指导许多实体瘤类型的后续治疗决策的标准程序，可以避免不必要的切除未受累的 LN^16,17。即使对于受累的 LN，是否以及何时需要手术切除仍然存在争议，因为多项研究表明，与接受放疗或全身治疗而未进行区域 LN 切除的患者相比，切除区域 LN 并未改善总生存期^18,19。一种解释是，患有微观疾病的转移性 LN （mLN） 可能保留了一些教育免疫细胞的能力并提供一些治疗益处。因此，阐明LN转移如何影响抗肿瘤免疫反应，尤其是TdLN-T_TSM的特性和功能至关重要。

到目前为止，临床前和临床数据都揭示了 mLN²⁰ 的一些结构和细胞改变。然而，肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在LN转移过程中的动态变化尚未被描述。因此，需要开发一个令人信服的 LN 转移模型以进行进一步研究。事实上，一些研究通过不同的方式报告了mLN小鼠模型14,21,22。例如，腋窝 LN 的自发转移是通过将 4T1 乳腺癌细胞植入乳腺脂肪垫²² 进行的。在另一项研究中，Reticker-Flynn 等人通过连续接种从解离的 mLN 组织培养的肿瘤细胞（九轮）¹⁴，生成了从皮下原发肿瘤扩散到 LN 的高发生率黑色素瘤细胞系。另一种常用的模型是通过将肿瘤细胞注射到脚垫中制备的，转移位点将在腘窝LN²²中形成。值得注意的是，很难评估干预的精确时间点，因为这些模型中的 LN 转移并不总是忠实的。

在本研究中，通过节点内注射 B16F10-GP 细胞^23,24 建立了小鼠 LN 转移模型，该模型由 CRISPR/Cas9 介导的 LCMV 病毒糖蛋白 （GP） 基因序列插入 B16F10 细胞系⁹ 的基因组中产生。然后，将这些小鼠与携带转基因 T 细胞受体 （TCR） 的 P14 细胞转移，特异性识别 H-2D^b GP_33-41 表位^25,26，并且可以研究抗原特异性 CD8⁺ T 细胞在 LN 转移过程中的全身和局部动力学。我们的实验设计为免疫反应的研究提供了一个有用的模型，特别是LN转移过程中的抗原特异性CD8⁺ T细胞，排除了旁观者CD8⁺ T细胞的扰动。这些结果将影响临床治疗方案，即是否去除或保留 mLN，并为操纵 mLN 以实现最大治疗益处提供新的线索。

使用的C57BL/6J小鼠（称为B6小鼠）和幼稚P14转基因小鼠^9,27为6-10周龄，体重为18-22g。男性和女性均未纳入随机化或盲法。所有动物研究均按照青岛农业大学机构动物护理和使用委员会的指导方针进行。

1.培养基和试剂的制备

1. 通过加入 DMEM、10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺和额外的 100 U/mL 嘌呤霉素，制备名为 D10（完全 DMEM 培养基）的 B16F10-GP 黑色素瘤细胞培养基。保持无菌D10并在2-4°C下储存长达2周。
2. 通过加入含有 2% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 来制备 R2 培养基（用于终止红细胞裂解）。
3. 通过加入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 2% FBS 和 0.01% 叠氮化钠来制备荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液。叠氮化钠的加入可以延长FACS缓冲液的储存时间，可在2-4°C下储存数月。
4. 通过将 155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃ 和 0.1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 加入双蒸水中并将其 pH 调节至 7.3 来制备红细胞裂解 （RBL） 缓冲液。将RBL缓冲液储存在室温（RT）下，并保持稳定长达3个月。
5. 制备麻醉剂2,2,2-三溴乙醇，如下所述。
   1. 在用铝箔包裹的 50 mL 无菌锥形管中称取适量的 2,2,2-三溴乙醇晶体。在晶体中加入适量的2-甲基-2-丁醇，制得浓度为500mg/mL的储备溶液。
   2. 旋转它以混合并在37°C水浴中加热管，直到晶体溶解。确保所有晶体都溶解。
   3. 充分混合溶液。用0.22μm过滤器将储备溶液过滤到无菌容器中。将冷冻的储备溶液储存在-20°C，或用PBS稀释到浓度为12.5mg / mL的工作溶液中，并储存在4°C。
      注意: 最好使用规定的浓度，因为较高浓度的液体具有刺激性。

2. B16F10-GP细胞悬液的制备

1. 在37°C和5%CO₂的细胞培养箱中解冻并培养一小瓶1×10⁶ B16F10-GP细胞和5mL D10。如下所述，当细胞达到 80% 至 90% 密度时，传代培养细胞。
   1. 用移液枪抽吸弃原始培养基，并用PBS洗涤细胞2次。在细胞培养皿中用 PBS 清洁贴壁细胞时，将 PBS 移至侧壁或将其放入培养皿中。
   2. 抽吸PBS后，向细胞培养皿或烧瓶中加入0.5-1mL 0.25%胰蛋白酶EDTA溶液。轻轻摇晃以覆盖整个细胞表面。将细胞培养皿或烧瓶置于37°C的培养箱中约1分钟或室温下，直到细胞圆润并分离。在倒置显微镜的帮助下观察细胞的剥落。
   3. 加入等体积的新鲜配制的 D10 以终止胰蛋白酶消化。用移液枪吹扫细胞培养瓶的下表面，以确保所有细胞都已分离。
   4. 将 B16F10-GP 细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，并在室温下以 163 x g 离心 4 分钟。
   5. 吸出上清液并弃去。将细胞重悬于 1-2 mL D10 中进行沉淀。将B16F10-GP细胞悬液转移到含有8-10mL D10的新细胞培养皿或烧瓶中，然后在37°C的5%CO₂细胞培养箱中孵育。
2. 在肿瘤植入当天，收集密度约为90%的B16F10-GP细胞，如步骤2.1.1至2.1.4所述。离心后，吸出上清液并弃去。将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
3. 使用0.4%台盼蓝血细胞计数器计数活细胞。加入 PBS 将细胞稀释至 5 x 10 每 100 μL⁵ 个细胞。 将细胞放在冰上直至使用。

3.小鼠双侧腹股沟区B16F10-GP细胞异位接种

1. 使用 1 mL 注射器吸出 100 μL 制备的 B16F10-GP 细胞悬液。轻弹管壁将气泡移动到顶部，然后推动活塞将顶部气泡移出。
2. 将鼠标保持仰卧位，露出腹部。用手指以仰卧位按压鼠标的右后肢，使右腹股沟区域的皮肤完全暴露（与左侧腹股沟区域相同）。
3. 用脱毛膏去除腹部的皮毛，然后用含有75%乙醇的棉花清洁双侧腹部区域。
4. 在插入针头之前，请确保腹股沟区域的皮肤已收紧。将针头以 45° 角插入大腿上部腹股沟区域的皮下空间。确保针头向上斜面，针的深度为 0.5-1 厘米。
5. 注射前轻轻抽吸，如无血，将细胞缓慢注射到皮下组织中。同时，在皮下区域观察一个小的推注（形成液体袋）。
6. 注射后，取出针头，将其放入锐器盒中，然后将鼠标放回笼子中。

4. P14 T细胞过继转移到荷瘤小鼠体内

1. 在肿瘤植入后6-8天，当肿瘤可触及（直径约3-5mm）时，在荷瘤小鼠中进行过继转移。在转移前一天腹膜内注射 4 mg 环磷酰胺 28,29,30。
   注意:CTX注射的目的是通过瞬时消除增殖的淋巴细胞，在淋巴室中为过继转移的T细胞创造空间。
2. 从幼稚P14转基因小鼠的脾脏和LN中分离淋巴细胞，如下所述^31,32（6-10周龄，与荷瘤小鼠相同性别，以避免排斥问题）。
   注意:在生物安全柜中执行以下程序，以确保严格的无菌条件。
   1. 准备两个 6 cm 培养皿，并向其中一个培养皿中加入 3 mL R2 培养基，向另一个培养皿中加入 3 mL RBL 缓冲液。将70μm细胞过滤器放入含有RBL缓冲液的培养皿中。
   2. 在含有异氟醚的密闭容器中对P14小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位。根据受体小鼠的数量调整P14小鼠的数量。
   3. 从安乐死的小鼠身上收获脾脏，腹股沟和腋窝淋巴结，并将它们转移到含有4mL R 2培养基的6cm培养皿中并置于冰上。
   4. 将脾脏放入浸有 3 mL RBL 缓冲液的过滤器中，用 1 mL 注射器内的推杆研磨脾脏。将细胞在室温下孵育 1-2 分钟，然后用 3 mL 冷 R2 培养基终止反应。
   5. 用 1 mL 注射器内的推杆研磨 LN，直到只有结缔组织留在带有 70 μm 细胞过滤器的过滤器中。用冷 R2 培养基冲洗过滤器，并将细胞悬液转移到新的 15 mL 离心管中。将样品在4°C下以500× g 离心6分钟。
   6. 弃去上清液并用 3 mL PBS 重悬细胞。使用70μm细胞过滤器从细胞悬浮液中去除絮凝物质。
   7. 将细胞悬液在4°C下以500× g 离心6分钟。 用 3 mL PBS 重悬细胞并将试管放在冰上。取少量样品，与台盼蓝混合，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
3. 通过流式细胞术测定P14（活/死CD45.1 ⁺ CD8 ⁺ Vα2 ⁺）细胞的百分比。确保转移的供体细胞与受体小鼠（荷瘤B6小鼠为CD45.2 ⁺）表现出不同的同源标记。在转移前进行染色以验证转移细胞的正确表型。
   1. 将 5 x 10^{个 4}- 1 x 10^{个 5} 个细胞加入含有 1 mL FACS 缓冲液的 1.5 mL 离心管中。将细胞悬液在4°C下以500× g 离心3分钟。
   2. 弃去上清液，轻弹试管底部以分散细胞，然后将试管放在冰上。
   3. 制备以下在 100 μL FACS 缓冲液中稀释的偶联抗体^{混合物 9,32}:抗 CD8,1:200;抗TCR Vα2,1:100;抗CD45.1,1:200;活/死染色，1:400。（材料表）。
   4. 将抗体混合物以15,000× g 离心3分钟以聚集颗粒。将混合物放在冰上，并用箔纸包裹避光。只服用上清液，避免吸入颗粒。
   5. 将细胞重悬于100μL抗体混合物中，并通过轻弹管壁充分混合。用锡箔纸包裹后，将试管在冰上孵育30分钟。
   6. 用FACS缓冲液洗涤细胞2次。将管在4°C下以500× g 离心3分钟。用 200 μL FACS 缓冲液重悬细胞，并将细胞悬液转移到流管中。
   7. 在流式细胞仪上运行带有染色细胞的流管，以确定活/死CD45.1 ⁺ CD8 ⁺ Vα2 ⁺细胞的百分比。
      注意:通常，来自P14转基因小鼠的CD8 + T细胞中超过90%的Vα2 ⁺ TCRs具有^{Vα2 +} TCRs，这些Vα2 + TCRs对LCMV（淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒）的H-2D^b GP_33-41 表位具有特异性。
4. 通过将活^/死CD45.1 + CD8 + Vα2 +细胞的百分比乘以步骤4.2和4.3中获得的活细胞数来计算活/死CD45.1 ⁺ CD8 ⁺ Vα2 ⁺ 细胞的绝对数量。
5. 用 100 U 胰岛素注射器吸出 200 μL P14 细胞（5 x 10⁵ 个细胞）悬浮液并除去气泡。转移的幼稚P14细胞的初始数量（5 x 10³ - 5 x 10⁵）不影响转移细胞的表型⁹。
6. 将小鼠放在笼子里，用红外线灯加热5-10分钟，以扩大尾静脉。用适当大小的鼠标固定器固定到位，拉直尾巴，然后用含有 75% 乙醇的棉球擦拭，使静脉可见。
7. 将针头平行于尾静脉插入，然后轻轻拉回柱塞。如果有血液流入注射器，请缓慢将细胞悬浮液推入静脉。
   注意: 如果注射过程中尾部有阻力或肿胀，则需要调整注射位置。注射部位应从远端开始。
8. 注射完成后，迅速拔出针头，用棉球轻轻按压注射部位。将鼠标放回新的干净笼子中，并仔细观察几分钟是否有任何不良反应。

5.原发肿瘤切除术

注意: 确保所有手术器械在使用前都经过高压灭菌。用75%乙醇对生物安全柜内的操作区域进行消毒，然后进行紫外线照射至少30分钟。在手术过程中穿干净的长袍、帽子、口罩和无菌手套。

1. 当肿瘤可触及（直径约 5 毫米）时，切除原发肿瘤。
2. 用腹膜内注射氯胺酮（75mg / kg）麻醉小鼠。捏脚垫评估麻醉程度，如果没有痛反射，则提示手术时机合适。如果后肢被撤回，则再提供10-30μL的剂量。
   注意:或者，腹膜内美托咪定（1 mg/kg体重;Domitor）建议麻醉小鼠。
3. 将干燥预防软膏涂抹在小鼠眼睛上。用脱毛膏去除腹部的皮毛，以完全暴露手术区域。
4. 将小鼠置于生物安全柜中，并将其放置在仰卧位覆盖有干净吸水纸的解剖板上，使小鼠的纵轴平行于实验者。
   注意:为了保持严格的无菌环境，必须在生物安全柜中执行以下程序。
5. 用浸泡在聚维酮碘中的棉球对小鼠的腹部进行消毒。用无菌手术刀或眼科剪刀切开肿瘤部位附近的皮肤。将闭合的剪刀尖端插入切口，以清楚地暴露肿瘤。切开皮肤时，确保不要损坏腹股沟淋巴结。
6. 在肿瘤切除过程中，尽可能保持胶囊完整。用无菌剪刀小心轻轻地去除肿瘤附近的结缔组织。将肿瘤 完全原位 切除，否则可能会复发。

6.腹股沟淋巴结结内注射B16F10-GP细胞

注:双侧肿瘤清除后，将B16F10-GP细胞注射到单侧腹股沟淋巴结中，将PBS注射到另一侧。

1. 用100U胰岛素注射器吸出20μL（5×10⁴ 个细胞）B16F10-GP细胞悬浮液，去除气泡，然后注射到一个腹股沟淋巴结中。将等体积的PBS注射到另一侧的腹股沟淋巴结中。
   1. 在注射过程中，从淋巴结远端插入针头，然后缓慢将针头插入淋巴结中心。此时，如果将液体准确注射到淋巴结中，可以看到淋巴结明显肿胀。
      注意: 当针头从淋巴结远端插入时，请确保不要刺穿淋巴结。
2. 使用 3-0 缝合线缝合切口 2-3 针。用浸有聚维酮碘的棉花对伤口周围的皮肤进行消毒。缝合时注意绕过淋巴结。
3. 将鼠标放在干净的笼子里，并在侧卧位使用红外线保持温暖。持续监测，直到意识恢复。确保接受手术的小鼠在完全康复之前不会返回其他动物的陪伴。
4. 术后连续3天每4-6小时给予丁丙诺啡，以缓解术后疼痛（剂量为0.1-0.5mg / kg，SQ或IP）。监测小鼠的进食、饮水、运动和活动区域。通常，小鼠在3天内从手术创伤中恢复过来。
   注意:如果小鼠无法恢复正常的进食和活动并表现出任何感染迹象，请咨询兽医进行干预或安乐死。
5. 在不同的时间点处死小鼠:结内注射肿瘤细胞后第8天和第18天。使用流式细胞术分析恢复活化的供体细胞。

该实验设计的原理图如图1A所示。将 100 μL PBS 中的总共 5 x 105 个 B16F10-GP 细胞皮下 （皮下注射） 植入 CD45.2 C57BL/6J 小鼠的双侧腹股沟区域。7天后，这些荷瘤小鼠腹膜内（ip）注射4mg CTX，然后通过尾部静脉注射（i.v.）过继转移5×105 CD45.1 + P14细胞。当肿瘤生长到直径约3-5mm时（P14细胞转移后约7天），切除原发肿瘤，并将20μLPBS中的5×104 B16F10-GP细胞直接注射到单侧腹股沟淋巴结中。另一侧的腹股沟淋巴结注射等体积的PBS。图1B显示了非转移性淋巴结（nLN）和转移性淋巴结（mLN）的代表性苏木精和伊红（H&E，100x）染色。nLN的结构完好无损。在LN转移的早期（D8），mLN部分被肿瘤细胞占据（黑色箭头），还有一些剩余的淋巴细胞区域没有被肿瘤细胞侵袭（红色箭头）。在LN转移（D18）的晚期，mLN充满肿瘤细胞，伴有肿瘤血管生成和少量淋巴细胞。在 GP33-41 肽刺激后，在 TdLN 中回收的活化 P14 细胞产生高水平的 IFN-γ 9,31。在这里，通过流式细胞术分析了不同时间点活化的P14细胞的百分比，门控策略如图2所示。早期（D8）和晚期（D18）外周血中抗原特异性CD8 + T细胞的频率分别为2.81%和1.48%（图3A）。据报道，肿瘤特异性 CD8+ T 细胞在肿瘤发生过程中严格驻留在 dLN 中，非引流 LN 回收的有限供体细胞33。在 LN 转移期间，nLN 中抗原特异性 P14 细胞的百分比保持稳定。有趣的是，mLN 中的抗原特异性 CD8+ T 细胞在早期阶段短暂增强，与 nLN 相比，P14 细胞的频率更高，而在晚期急剧下降（图 3B）。

图1:实验设计示意图。（A） C57BL/6J 小鼠 （CD45.2+） 在双侧腹股沟区域植入 5 x 105 个 B16F10-GP 肿瘤细胞。7天后，这些小鼠腹膜内注射4mg CTX，然后在第二天过继转移不同的先天标记（CD45.1 +）P14细胞。当肿瘤生长到直径约3-5mm时（P14细胞转移后约7天），切除原发肿瘤，然后将20μLPBS中的5×104 B16F10-GP细胞直接注射到单侧腹股沟淋巴结中，另一侧的腹股沟淋巴结注射等体积的PBS。 （B） LN 的代表性苏木精和伊红 （H&E，100x） 染色。 缩写:s.c. = 皮下;CTX=环磷酰胺;静脉注射 = 静脉注射;囊=牺牲;nLN = 非转移性 LN;mLN = 转移性 LN。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:流式细胞术分析的设门策略。 用于鉴定供体来源的活化抗原特异性 CD8+ T 细胞的门控策略。缩写:L/D = live/dead。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:LN 转移过程中抗原特异性 CD8+ T 细胞的动力学。 不同时间点抗原特异性CD8+ T细胞在 （A） 外周血、 （B） nLN和mLN中的比例。缩写:nLN = 非转移性 LN;mLN = 转移性 LN。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者声明没有竞争利益。