吲哚菁绿血管造影表征新生血管性年龄相关性黄斑变性的血管形态

年龄相关性黄斑变性 （AMD） 是一种普遍存在的疾病，会导致老年人严重视力丧失¹.仅在美国，AMD患者的数量预计将翻一番，到2050年将达到近2200万，而目前的1100万。在全球范围内，预计到 2040 年，AMD 病例数将达到惊人的 2.88 亿²。

脉络膜新生血管形成 （CNV），也称为"湿性"或新生血管性 AMD，由于中央视网膜下方形成异常血管，会对视力产生毁灭性影响。这会导致出血、视网膜渗出和严重的视力丧失。靶向细胞外 VEGF 的抗血管内皮生长因子 （VEGF） 疗法的引入彻底改变了 CNV 治疗。然而，尽管取得了这些进展，但高达 50% 的患者对这些疗法表现出次优反应，持续的疾病活动，例如积液和未解决或新发出血^{3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14}。

临床研究表明，CNV 患者的抗 VEGF 耐药通常与小动脉 CNV 的存在相对应，其特征是大口径分支小动脉、血管环和吻合口连接⁹。反复的抗VEGF治疗可导致血管异常、小动脉CNV的发展，并最终导致对抗VEGF治疗的耐药^性14,15。在小动脉 CNV 病例中，持续性液体渗漏可能是由于动静脉吻合口环处形成不充分的紧密连接导致渗出加剧，尤其是在高血流量^{条件下 9}。相反，对抗VEGF治疗反应良好的个体往往表现出毛细血管CNV。

在我们使用动物模型的研究中，我们已经证明激光诱导的老年小鼠 CNV 会发展为小动脉 CNV，并显示出对抗 VEGF 治疗的耐药性^16,17。相反，年轻小鼠中激光诱导的CNV导致毛细血管CNV的发展和对抗VEGF治疗的高反应性。因此，在机制和治疗研究中区分 CNV 血管类型至关重要。

在临床环境中，CNV 通常根据荧光素血管造影 （FA） 渗漏模式（例如 1 型、2 型）进行分类，这些渗漏使用荧光素染料来跟踪渗出并识别病理渗漏区域。在AMD研究中，CNV主要在动物模型中使用FA进行研究。然而，FA 未能揭示 CNV 的血管形态。此外，FA只能捕获可见光谱中的图像，而无法可视化视网膜色素上皮（RPE）下方的脉络膜脉管系统。相比之下，吲哚菁绿 （ICG） 对血浆蛋白表现出很强的亲和力，可促进主要的血管内潴留，并能够可视化血管结构和血流⁹。通过利用ICG的近红外荧光特性，使用ICG血管造影（ICGA）对视网膜和脉络膜色素进行成像成为可能。在这种情况下，提出了一种结合 FA 和 ICGA 的方案来研究年轻和老年小鼠中激光诱导的脉络膜新生血管形成 （CNV） 的渗漏和血管形态，其中观察到毛细血管和小动脉 CNV。

本研究中进行的动物实验获得了贝勒医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。所有程序均按照视觉和眼科研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明中概述的指南进行。本研究使用年轻（7-9 周）和老年（12-16 个月）C57BL/6J 雄性和雌性小鼠进行本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 成像系统的准备

1. 在成像平台上放置加热垫（参见 材料表），以确保在成像过程中保持鼠标的体温。激活加热垫并将温度调节至 35 °C。
2. 取下防尘罩并打开激光扫描检眼镜。将 55° 镜头放在机器上。
3. 设置成像软件（见 材料表）并输入基本信息，包括基因型、性别、年龄等。当成像会话开始时，选择用于捕获ICGA图像的 IR （红外通道）。

2. ICGA和FA之前的动物准备

1. 称量小鼠以确定所需的麻醉量（氯胺酮/甲苯噻嗪 70-100/2.5-10 mg/kg，参见 材料表）。
   注意:优化剂量至关重要，因为不同小鼠品系的代谢特征不同。必须确定适当的剂量，以避免小鼠在完成成像之前醒来或过量服用和潜在的动物死亡的风险。
2. 使用 1 mL 无菌注射器和 30-32 G 针头通过腹腔注射进行麻醉。轻轻捏住鼠标的一只爪子，检查鼠标是否被充分麻醉。如果动物表现出任何反应或运动，建议等待更多时间，然后再进行下一步。这允许动物安顿下来，并确保后续程序的最佳条件。
3. 施用1%托卡米特滴眼液以扩张小鼠的双眼。等待至少30秒，然后在双眼上使用0.5%盐酸丙卡因滴剂（见 材料表），以减少眼球运动和眨眼。随后使用润滑剂眼凝胶滴剂。
   注意:在整个麻醉期间，重要的是要解决小鼠眼睛极度干燥的问题，这可能导致角膜混浊。由于能见度受阻，这种不透明度使后续成像具有挑战性。为了防止这种情况，持续使用润滑剂眼凝胶滴剂以保持小鼠的眼睛湿润至关重要。
4. 将鼠标放在加热水垫上。
   注意:小鼠具有较高的表面积与体积比，导致环境的热量损失增加。当与麻醉引起的温度下降相结合时，这可能会对小鼠构成重大风险，可能导致因体温过低而死亡。采取必要的预防措施以防止体温过低并确保小鼠在手术过程中的健康至关重要。
5. 制备 2 mg/mL ICG 和 20 mg/mL 荧光素染料的 1:1 体积混合物（参见 材料表）。使用 1 mL 注射器和 32 G 针头通过腹膜内注射给予 250 μL 混合物。
   1. 将针头插入小鼠腹部左下象限，靠近后腿，与小鼠皮肤平行，以避免穿孔任何器官。
   2. 小心地拔出柱塞并确认没有血液进入注射器盖。继续缓慢而稳定地注入染料，保持一致的速度。
      注意:ICG染料在使用前必须用0.22μm注射器过滤器过滤。

3. ICGA和FA

1. 将鼠标放在成像平台的加热垫上开始成像。
2. 将鼠标的身体与相机成 45 度角，然后将其头部略微向下旋转。这使得视神经处于相机焦点的中心。
3. 用棉签轻轻擦拭眼睛，以去除首先成像的眼睛上的润滑剂滴眼液或凝胶层。确保在完成成像程序后立即涂抹润滑凝胶滴剂。
   注意:不建议在麻醉下离开眼睛超过 1 分钟。
4. 将相机移向鼠标的眼睛。从采集模块中选择 FA通道 。FA通道发出的发光可用于定位在小鼠角膜的中心，以便更快地放置。
5. 将鼠标的头部定位在视神经在屏幕上的中心，避免将激光扫描检眼镜倾斜一定角度。对鼠标的头部位置进行细微调整以达到所需的对齐效果。
6. 在采集模块上，选择 ICGA通道。确保激光强度设置为 100%，然后选择 55° 选项以匹配适当的镜头。这确保了激光扫描检眼镜的最佳设置。
   注意:为防止过度饱和，在早期成像时，可能需要使用较低的激光强度，通常约为 25%-50%。在此范围内调整激光强度有助于捕获清晰准确的图像，而不会导致过度饱和。
7. 当眼睛占据成像软件的整个屏幕时，调整灵敏度和对焦设置，以获得最清晰的 CNV 膜图像。
   1. 旋转采集模块上的 圆形黑色 按钮以调整图像的灵敏度。
   2. 旋转检眼镜上的 旋钮 以调整焦点。使用 FA 可视化视网膜脉管系统的最佳焦点通常在 35-45 D（屈光度）范围内。另一方面，使用 ICGA 可视化脉络膜的理想焦点通常在 10-15 D 之间。
      注意:由于CNV膜的尺寸不同，可能需要在10-30 D中调整焦点以获得血管形态的最佳成像。
8. 调整焦距和感光度以获得最佳图像后，按采集模块上的 圆形黑色 按钮对图像进行归一化。归一化完成（捕获所有帧）后，单击触摸屏面板上的 采集 按钮以保存图像。可能需要移动相机以从不同角度对 CNV 进行成像。鼠标也可以定向到不同的位置，以提供 CNV 病变的最佳图像。
   注意:在远离视神经的地方观察脉管系统时，可能需要重新调整激光扫描检眼镜的焦点或位置。
9. 使用采集模块切换回 FA通道 。完成步骤 3.6-3.7 中列出的相同步骤，调整每张图像的灵敏度和焦点，以捕获 CNV 病变的渗漏。
   注意: 确保选择正确的灵敏度，以避免 CNV 泄漏过度饱和并人为增加泄漏面积。
10. 在注射后 3-4 分钟对 ICGA 和 FA 的"早期阶段"进行成像。
    注意:"早期阶段"是脉络膜脉管系统可以清晰可见的时间。在中期，通常发生在 4-8 分钟之间，视网膜和脉络膜血管更加褪色和弥漫。随着后期（>8-10 分钟）的到来，脉络膜和视网膜血管都变得难以辨别。然而，高荧光 CNV 病变与减弱的背景表现出最大的对比度。这些提到的时间是可变的，取决于注入的ICG染料的浓度和量。更多的ICG染料往往会增加每个阶段的时间线，并提供更独特的容器。阶段应根据上面列出的关键特征而不是绝对时间来定义。
11. 获取所有图像后，在鼠标的眼睛上涂抹凝胶润滑剂或软膏，并在加热垫上仔细监测鼠标的恢复情况。鼠标通常需要 1.5 小时才能完全恢复。
12. 一旦小鼠从麻醉中完全恢复并清醒，将小鼠放回笼子和指定的存放区域。
13. 在关闭成像系统和激光器之前，将图像导出为 TIFF 或 JPEG 文件以供后续分析。

4. RPE/脉络膜平装和染色

1. 将眼睛固定在 4% 多聚甲醛中过夜。用PBS洗眼睛三次。取下晶状体和角膜。
2. 在室温下将眼睛在封闭溶液（10%牛血清白蛋白，0.6%Triton X-100的PBS溶液）中孵育1小时。重复PBS洗涤三次。
3. 在封闭溶液中用异凝集素GS-IB4 Alexa-flour 568偶联物和抗α平滑肌肌动蛋白抗体（见 材料表）孵育眼睛过夜。
4. 用PBS洗涤三次。将样品与Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗（参见 材料表）在室温下孵育2小时。
5. 从边缘到赤道执行 4 次径向切割。小心地取下视网膜¹⁷.
   注意: 必须注意确保新生血管膜不会意外脱落。
6. 将平装脉络膜安装在载玻片上。使用共聚焦显微镜可视化 CNV。

根据该方案，在年轻（7-9 周）和老年（12-16 个月）C57BL/6J 小鼠中对激光诱导的 CNV 进行 ICGA 和 FA。FA 提供有关 CNV 病变的位置和渗漏的信息（图 1，左图），而 ICGA 揭示了 CNV 病变的血管形态（图 1，右图）。在年轻小鼠中，毛细血管CNV在CNV病变中占主导地位。相比之下，老年小鼠表现出以大口径血管、血管环和吻合口连接为特征的小动脉 CNV。年轻和老年小鼠都显示出FA中视网膜脉管系统的清晰可见度（图1，左图）。在年轻小鼠的ICGA图像中，视网膜脉管系统不可见，脉络膜血管出现褪色，表明ICGA的中期阶段以脉络膜脉管系统为重点。在老年小鼠的ICGA图像中，可以观察到部分视网膜脉管系统，而脉络膜血管似乎褪色，这表明由于老年小鼠中小动脉CNV的尺寸较大，中间阶段的焦点在视网膜和脉络膜之间。与年轻小鼠的毛细血管CNV相比，老年小鼠的小动脉CNV表现出更大的CNV大小（图2）和显着更多的渗漏。用抗平滑肌肌动蛋白抗体进行免疫染色可广泛标记老年小鼠的CNV脉管系统，确认小动脉形态（图3）。相反，在年轻小鼠的病变部位脉管系统中观察到α平滑肌肌动蛋白的最小染色，与毛细血管形态一致。

图 1:描述年轻和老年小鼠激光诱导 CNV 的 FA 和 ICGA 图像的比较。 FA 图像显示 CNV 病变的渗漏，而 ICGA 提供血管形态的可视化。比例尺:200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:基于 ICGA 图像的年轻和老年小鼠 CNV 病变大小的量化。 测量 CNV 区域，分别在年轻和老年小鼠中分析了 26 个和 14 个激光点。误差线表示平均值±标准差。 使用非配对 t 检验进行统计分析。P < 0.0001。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:年轻和老年小鼠 CNV 病变的代表性图像，与 Alexa 568 异凝集素和抗α平滑肌肌动蛋白抗体共同标记在 RPE/脉络膜平配座上。 红色代表 Alexa 568 异凝集素，而绿色代表α平滑肌肌动蛋白 （SMA）。比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。