目前，荧光素血管造影（FA）是识别脉络膜新生血管（CNV）动物模型中渗漏模式的首选方法。然而，FA 无法提供有关血管形态的信息。本方案概述了使用吲哚菁绿血管造影（ICGA）来表征小鼠模型中激光诱导的 CNV 不同病变类型的方法。
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摘要
摘要
年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人群致盲的主要原因，且由于人口老龄化，其患病率正在迅速上升。脉络膜新生血管（CNV）或称湿性AMD，约占所有AMD病例的10%–20%，却导致了约80%–90%的AMD相关失明。目前的抗VEGF治疗在约50%的患者中疗效欠佳。CNV患者对抗VEGF治疗的耐药性常与小动脉型CNV相关，而治疗应答者则多表现为毛细血管型CNV。尽管荧光素血管造影（FA）常用于评估湿性AMD患者及动物模型中的渗漏模式，但它无法提供有关CNV血管形态（小动脉型CNV vs. 毛细血管型CNV）的信息。本方案介绍了使用吲哚菁绿血管造影（ICGA）来鉴定激光诱导的CNV小鼠模型中病变类型的实验方法。该方法对于研究湿性AMD中抗VEGF耐药的机制及治疗策略至关重要。建议在机制与治疗研究中联合应用ICGA与FA，以全面评估CNV的渗漏特征和血管特征。
引言
年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致老年人严重视力丧失的常见疾病1。仅在美国，AMD患者人数预计到2050年将翻倍，达到近2200万，而目前为1100万。全球范围内，预计到2040年，AMD病例总数将达到惊人的2.88亿例2。
脉络膜新生血管（CNV），也称为"湿性"或新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD），由于在中央视网膜下方形成异常血管，可能对视力造成严重损害。这会导致出血、视网膜渗出以及显著的视力丧失。靶向细胞外血管内皮生长因子（VEGF）的抗VEGF疗法的引入，彻底改变了CNV的治疗方式。然而，尽管取得了这些进展，高达50%的患者对这些疗法的反应不理想，仍存在持续的疾病活动，如液体积聚以及未解决或新发的出血3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。
临床研究表明，脉络膜新生血管（CNV）患者对抗VEGF治疗的耐药性通常与小动脉性CNV的存在相关，其特征包括大管径分支小动脉、血管环状结构以及吻合连接9。反复的抗VEGF治疗可能促进血管异常化，导致小动脉性CNV的形成，并最终引发对抗VEGF疗法的耐药性14,15。在小动脉性CNV病例中，持续的液体渗漏可能源于动静脉吻合环处紧密连接形成不充分所导致的渗出增加，尤其在高血流条件下更为显著9。相反，对抗VEGF治疗反应良好的个体通常表现为毛细血管性CNV。
在使用动物模型的研究中，我们已证实，在老年小鼠中，激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）会发展为小动脉性CNV，并对抗VEGF治疗产生抵抗16,17。相反，在年轻小鼠中，激光诱导的CNV则导致毛细血管性CNV的形成，并对抗VEGF治疗表现出高度敏感。因此，对于机制和治疗研究而言，区分CNV的血管类型至关重要。
在临床环境中，脉络膜新生血管（CNV）通常根据荧光素血管造影（FA）的渗漏模式（如1型、2型）进行分类，该方法利用荧光素染料追踪渗出情况并识别病理性渗漏区域。在年龄相关性黄斑变性（AMD）研究中，主要通过动物模型中的FA来研究CNV。然而，FA无法揭示CNV的血管形态。此外，FA仅能在可见光谱范围内成像，无法可视化视网膜色素上皮（RPE）下方的脉络膜血管系统。相比之下，吲哚菁绿（ICG）对血浆蛋白具有强亲和力，可在血管内优先滞留，从而实现血管结构和血流的可视化9。利用ICG的近红外荧光特性，可通过吲哚菁绿血管造影（ICGA）对视网膜和脉络膜色素进行成像。在此背景下，本文介绍了一种联合应用FA与ICGA的实验方案，用于研究年轻和老年小鼠激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）的渗漏特征及血管形态，其中可观察到毛细血管和小动脉来源的CNV。
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方案
本研究中的动物实验已获得贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。所有操作均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》中的指导原则。本研究使用了年轻（7–9周龄）和年老（12–16月龄）的C57BL/6J雄性和雌性小鼠。实验动物来自商业来源（见材料表）。
1. 成像系统的准备
- 将加热垫放置在成像平台上（参见材料表），以确保在成像过程中维持小鼠的体温。启动加热垫，并将温度调节至 35 °C。
- 取下防尘罩并打开激光扫描检眼镜。在设备上安装一个 55° 镜头。
- 设置成像软件（参见材料表），输入必要的信息，包括基因型、性别、年龄等。当开始成像时，选择IR（红外通道）以采集 ICGA 图像。
2. ICGA 和 FA 检查前的动物准备
- 称重小鼠以确定所需麻醉剂的剂量（氯胺酮/赛拉嗪 70–100/2.5–10 mg/kg，参见材料表）。
注意：优化剂量至关重要，因为不同品系小鼠的代谢特征存在差异。必须确定合适的剂量，以避免小鼠在成像完成前苏醒，或因过量给药而导致动物死亡的风险。 - 使用带有 30–32 G 针头的 1 mL 无菌注射器，通过腹腔注射给予麻醉剂。轻轻捏住小鼠的一只爪子，检查其是否已充分麻醉。若动物出现任何反应或移动，建议等待更长时间后再进行下一步操作，以确保动物状态稳定，为后续操作提供最佳条件。
- 滴加 1% 托吡卡胺眼用溶液，使小鼠双眼瞳孔扩张。等待至少 30 秒后，在双眼滴加 0.5% 盐酸丙帕他卡因滴眼液（参见材料表），以减少眼球运动和眨眼。随后使用润滑性眼用凝胶滴眼液。
注意：在整个麻醉过程中，必须注意小鼠眼睛极度干燥的问题，否则可能导致角膜混浊。这种混浊会因影响可视性而使后续成像变得困难。为防止该情况发生，必须持续使用润滑性眼用凝胶滴眼液，以保持小鼠眼睛湿润。 - 将小鼠放置于加热水垫上。
注意：小鼠体表面积与体积之比较高，导致其向环境散失热量的速度加快。当这一因素与麻醉引起的体温下降叠加时，可能对小鼠构成重大风险，甚至因低体温症而导致死亡。因此，在操作过程中采取必要措施预防低体温症，对保障小鼠健康至关重要。 - 配制体积比为 1:1 的混合溶液，其中含 2 mg/mL ICG 和 20 mg/mL 荧光素染料（参见材料表）。使用 1 mL 注射器和 32 G 针头，通过腹腔注射给予 250 µL 该混合液。
- 将针头插入小鼠腹部左下象限、靠近后肢的区域，进针角度应与小鼠皮肤平行，以避免刺穿任何器官。
- 缓慢回抽针栓，确认无血液进入注射器。随后缓慢而稳定地注射染料，保持均匀速度。
注意：ICG 染料在使用前必须用 0.22 µm 注射器滤器过滤。
3. ICGA 和 FA
- 将小鼠放置在成像平台的加热垫上，开始成像。
- 将小鼠身体置于与相机成45度角的位置，并轻微向下旋转其头部，以便视神经位于相机焦点的中心。
- 使用棉签轻轻擦拭待成像的眼睛，去除眼表的润滑性滴眼液或凝胶。成像操作完成后应立即重新涂抹润滑凝胶。
注意：在麻醉状态下，眼睛缺乏润滑超过1分钟是不推荐的。 - 将相机移向小鼠眼睛。在采集模块中选择FA通道。FA通道发出的荧光可用于快速将角膜中心定位在相机视野中央。
- 调整小鼠头部位置，使视神经在屏幕上居中，避免需要倾斜激光扫描检眼镜的角度。对小鼠头部位置进行微调以达到理想的对齐状态。
- 在采集模块中选择ICGA通道。确保激光强度设置为100%，并选择55°选项以匹配相应的镜头，从而保证激光扫描检眼镜处于最佳设置。
注意：为防止过饱和，在早期成像阶段可能需要使用较低的激光强度（通常为25%-50%）。在此范围内调节激光强度有助于获取清晰且准确的图像，同时避免过饱和。 - 当眼睛在成像软件中占据整个屏幕时，调整灵敏度和焦距设置，以获得脉络膜新生血管（CNV）膜最清晰的图像。
- 旋转采集模块上的圆形黑色按钮，以调节图像的灵敏度。
- 旋转检眼镜上的旋钮以调节焦距。使用FA观察视网膜血管时，最佳焦距通常在35–45 D（屈光度）范围内；而使用ICGA观察脉络膜时，理想焦距一般在10–15 D之间。
注意：由于CNV膜的大小不同，可能需要将焦距调整至10–30 D范围，以获得最佳的血管形态成像效果。
- 当焦距和灵敏度已调整至最佳图像状态后，按下采集模块上的圆形黑色按钮以归一化图像。归一化完成后（所有帧均已捕获），点击触摸屏面板上的采集按钮保存图像。可能需要移动相机从不同角度对CNV进行成像。也可调整小鼠体位，以获得CNV病灶的最佳图像。
注意：当观察远离视神经的血管结构时，可能需要重新调整激光扫描检眼镜的焦距或位置。 - 使用采集模块切换回FA通道。重复步骤3.6–3.7中列出的相同操作，调节每幅图像的灵敏度和焦距，以捕捉CNV病灶的渗漏情况。
注意：应选择合适的灵敏度，避免CNV渗漏区域过饱和，从而人为扩大渗漏面积。 - 在注射后3–4分钟内完成ICGA和FA的"早期相"成像。
注意："早期相"是指脉络膜血管可被清晰、明确显示的时间段。中期相通常出现在4–8分钟之间，此时视网膜和脉络膜血管信号明显减弱且弥散。晚期相（>8–10分钟）到来时，脉络膜和视网膜血管均难以分辨。然而，高荧光的CNV病灶在此背景下表现出最大对比度。上述时间点存在个体差异，取决于注射的ICG染料浓度和剂量。较高剂量的ICG染料往往会延长各相的时间进程，并使血管显示更清晰。各相的界定应基于上述关键特征，而非绝对时间。 - 所有图像采集完成后，向小鼠眼部涂抹凝胶润滑剂或眼膏，并在加热垫上密切监测其恢复情况。小鼠通常需要约1.5小时才能完全恢复。
- 待小鼠从麻醉中完全恢复并清醒后，将其放回笼子及指定饲养区域。
- 在关闭成像系统和激光之前，将图像导出为TIFF或JPEG格式文件，用于后续分析。
4. 视网膜色素上皮/脉络膜平铺制备及染色
- 用4%多聚甲醛固定眼球，过夜。用PBS洗涤眼球三次。去除晶状体和角膜。
- 将眼球置于封闭液（含10%牛血清白蛋白和0.6% Triton X-100的PBS溶液）中，室温孵育1小时。重复用PBS洗涤三次。
- 在封闭液中加入异凝集素GS-IB4 Alexa Fluor 568偶联物和抗α-平滑肌肌动蛋白抗体（见材料表），与眼球4℃过夜孵育。
- 用PBS洗涤三次。加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二抗（见材料表），室温孵育2小时。
- 从眼球边缘向赤道部做4条放射状切口。小心剥离视网膜17。
注意：操作时需格外小心，避免新生血管膜意外脱落。 - 将展平的脉络膜组织贴于载玻片上，使用共聚焦显微镜观察脉络膜新生血管（CNV）。
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结果
根据实验方案，对年轻（7-9周龄）和年老（12-16月龄）C57BL/6J小鼠的激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型进行了吲哚菁绿血管造影（ICGA）和荧光素眼底血管造影（FA）。FA可提供CNV病灶的位置及其渗漏信息（图1，左侧面板），而ICGA则揭示CNV病灶的血管形态特征（图1，右侧面板）。在年轻小鼠中，CNV病灶以毛细血管型新生血管为主。相比之下，年老小鼠则表现出小动脉型CNV，其特征为大管径血管、血管环状结构以及吻合连接。年轻和年老小鼠在FA图像中均能清晰显示视网膜血管系统（图1，左侧面板）。在年轻小鼠的ICGA图像中，视网膜血管不可见，脉络膜血管呈淡影，提示处于ICGA的中期阶段，主要显示脉络膜血管。在年老小鼠的ICGA图像中，可观察到部分视网膜血管，同时脉络膜血管呈淡影，提示处于中期阶段，成像重点位于视网膜与脉络膜之间，这与年老小鼠中小动脉型CNV体积较大有关。年老小鼠的小动脉型CNV表现出更大的CNV面积（
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讨论
本研究展示了使用吲哚菁绿血管造影（ICGA）来识别激光诱导脉络膜新生血管（CNV）小鼠模型中 arteriolar 和毛细血管脉络膜新生血管（CNV）的血管形态。吲哚菁绿（ICG）染料具有与血红蛋白结合及对红外光敏感的特性，能够检测出CNV的形态结构，而这一目标使用目前研究领域常用的方法——荧光素血管造影（FA）则难以实现。
该方案的第一步关键操作是确保染料被注入腹膜腔内，且不穿透任何器官。将注射部位选择在左下象限，针头斜面与皮肤之间保持较小角度，同时避免将整个针头插入，有助于提高吲哚菁绿染料的吸收效果。若将染料注入器官内部，可能导致吸收减慢，并引发潜在并发症，例如腹部器官撕裂、内出血或感染。该操作的另一个关键环节是在采集图像前将视神经居中，以观察眼球的完整直径。这需要在计算机屏幕上仔细观察，使荧光通道（FA通道）发出的发光信号与小鼠眼球位置重叠。为调整纵向角度，最佳方法是直接原位倾斜小鼠头部，而不是上下调节仪器，从而确保完整视野被捕捉到。
既往研究表明，使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂可导致角膜混浊
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了BrightFocus基金会、视网膜 研究基金会、Mullen基金会以及YF获得的眼科学Sarah Campbell Blaffer捐赠基金的资助，NIH核心资助项目2P30EY002520资助了贝勒医学院，此外，预防失明研究组织向贝勒医学院眼科系提供了一项无限制资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 32-G 胰岛素注射器 | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A11008 | |
| 抗-α 平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 牛血清白蛋白 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J 小鼠（7–9 周龄） | 杰克逊实验室 | 品系编号：000664 | |
| 荧光素钠盐 | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T 泵热疗系统 | Gaymar | TP-500 | 用于小鼠成像后恢复的循环水浴加热泵 |
| GenTeal 凝胶 | Genteal | NDC 58768-791-15 | 透明润滑性眼用凝胶 |
| GS-IB4 Alexa Fluor 568 标记物 | Invitrogen | I21412 | |
| 海德堡眼科学探索仪 | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| 吲哚菁绿 | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| 氯胺酮 | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| 多聚甲醛 | Acros Organics | 416785000 | |
| 盐酸丙帕卡因眼用溶液（0.5%） | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| 光谱域多模态成像系统 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| 托吡卡胺眼用溶液（1%） | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | 用于瞳孔散大 |
| 赛拉嗪 | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
参考文献
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