通过吲哚菁绿血管造影对新生血管性年龄相关性黄斑变性的血管形态学特征进行表征

摘要

目前，荧光素血管造影（FA）是识别脉络膜新生血管（CNV）动物模型中渗漏模式的首选方法。然而，FA 无法提供有关血管形态的信息。本方案概述了使用吲哚菁绿血管造影（ICGA）来表征小鼠模型中激光诱导的 CNV 不同病变类型的方法。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人群致盲的主要原因，且由于人口老龄化，其患病率正在迅速上升。脉络膜新生血管（CNV）或称湿性AMD，约占所有AMD病例的10%–20%，却导致了约80%–90%的AMD相关失明。目前的抗VEGF治疗在约50%的患者中疗效欠佳。CNV患者对抗VEGF治疗的耐药性常与小动脉型CNV相关，而治疗应答者则多表现为毛细血管型CNV。尽管荧光素血管造影（FA）常用于评估湿性AMD患者及动物模型中的渗漏模式，但它无法提供有关CNV血管形态（小动脉型CNV vs. 毛细血管型CNV）的信息。本方案介绍了使用吲哚菁绿血管造影（ICGA）来鉴定激光诱导的CNV小鼠模型中病变类型的实验方法。该方法对于研究湿性AMD中抗VEGF耐药的机制及治疗策略至关重要。建议在机制与治疗研究中联合应用ICGA与FA，以全面评估CNV的渗漏特征和血管特征。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致老年人严重视力丧失的常见疾病¹。仅在美国，AMD患者人数预计到2050年将翻倍，达到近2200万，而目前为1100万。全球范围内，预计到2040年，AMD病例总数将达到惊人的2.88亿例²。

脉络膜新生血管（CNV），也称为"湿性"或新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD），由于在中央视网膜下方形成异常血管，可能对视力造成严重损害。这会导致出血、视网膜渗出以及显著的视力丧失。靶向细胞外血管内皮生长因子（VEGF）的抗VEGF疗法的引入，彻底改变了CNV的治疗方式。然而，尽管取得了这些进展，高达50%的患者对这些疗法的反应不理想，仍存在持续的疾病活动，如液体积聚以及未解决或新发的出血^{3,4,5,6,7,8,9,10<....}

方案

本研究中的动物实验已获得贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。所有操作均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》中的指导原则。本研究使用了年轻（7–9周龄）和年老（12–16月龄）的C57BL/6J雄性和雌性小鼠。实验动物来自商业来源（见材料表）。

1. 成像系统的准备

1. 将加热垫放置在成像平台上（参见材料表），以确保在成像过程中维持小鼠的体温。启动加热垫，并将温度调节至 35 °C。
2. 取下防尘罩并打开激光扫描检眼镜。在设备上安装一个 55° 镜头。
3. 设置成像软件（参见材料表），输入必要的信息，包括基因型、性别、年龄等。当开始成像时，选择IR（红外通道）以采集 ICGA 图像。

2. ICGA 和 FA 检查前的动物准备

1. 称重小鼠以确定所需麻醉剂的剂量（氯胺酮/赛拉嗪 70–100/2.5–10 mg/kg，参见材料表）。
   注意：优化剂量至关重要，因为不同品系小鼠的代谢特征存在差异。必须确定合适的剂量，以避免小鼠在成像完成前苏....

结果

根据实验方案，对年轻（7-9周龄）和年老（12-16月龄）C57BL/6J小鼠的激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型进行了吲哚菁绿血管造影（ICGA）和荧光素眼底血管造影（FA）。FA可提供CNV病灶的位置及其渗漏信息（图1，左侧面板），而ICGA则揭示CNV病灶的血管形态特征（图1，右侧面板）。在年轻小鼠中，CNV病灶以毛细血管型新生血管为主。相比之下，年老小鼠则表现出小动脉型CNV，其特征为大管径血管、血管环状结构以及吻合连接。年轻和年老小鼠在FA图像中均能清晰显示视网膜血管系统（图1，左侧面板）。在年轻小鼠的ICGA图像中，视网膜血管不可见，脉络膜血管呈淡影，提示处于ICGA的中期阶段，主要显示脉络膜血管。在年老小鼠的ICGA图像中，可观察到部分视网膜血管，同时脉络膜血管呈淡影，提示处于中期阶段，成像重点位于视网膜与脉络膜之间，这与年老小鼠中小动脉型CNV体积较大有关。年老小鼠的小动脉型CNV表现出更大的CNV面积（

讨论

本研究展示了使用吲哚菁绿血管造影（ICGA）来识别激光诱导脉络膜新生血管（CNV）小鼠模型中 arteriolar 和毛细血管脉络膜新生血管（CNV）的血管形态。吲哚菁绿（ICG）染料具有与血红蛋白结合及对红外光敏感的特性，能够检测出CNV的形态结构，而这一目标使用目前研究领域常用的方法——荧光素血管造影（FA）则难以实现。

该方案的第一步关键操作是确保染料被注入腹膜腔内，且不穿透任何器官。将注射部位选择在左下象限，针头斜面与皮肤之间保持较小角度，同时避免将整个针头插入，有助于提高吲哚菁绿染料的吸收效果。若将染料注入器官内部，可能导致吸收减慢，并引发潜在并发症，例如腹部器官撕裂、内出血或感染。该操作的另一个关键环节是在采集图像前将视神经居中，以观察眼球的完整直径。这需要在计算机屏幕上仔细观察，使荧光通道（FA通道）发出的发光信号与小鼠眼球位置重叠。为调整纵向角度，最佳方法是直接原位倾斜小鼠头部，而不是上下调节仪器，从而确保完整视野被捕捉到。

既往研究表明，使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂可导致角膜混浊

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32-G 胰岛素注射器	MHC Medical Products	NDC 08496-3015-01
Alexa Fluor 488 山羊抗兔二抗	Invitrogen	A11008
抗-α 平滑肌肌动蛋白抗体	Abcam	ab5694
牛血清白蛋白	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-2323
C57BL/6J 小鼠（7–9 周龄）	杰克逊实验室	品系编号：000664
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	MFCD00167039
Gaymar T 泵热疗系统	Gaymar	TP-500	用于小鼠成像后恢复的循环水浴加热泵
GenTeal 凝胶	Genteal	NDC 58768-791-15	透明润滑性眼用凝胶
GS-IB4 Alexa Fluor 568 标记物	Invitrogen	I21412
海德堡眼科学探索仪	Heidelberg Engineering, Germany	HEYEX2
吲哚菁绿	Pfaultz & Bauer	I01250
氯胺酮	Vedco Inc.	NDC 50989-996-06
多聚甲醛	Acros Organics	416785000
盐酸丙帕卡因眼用溶液（0.5%）	Sandoz	NDC 61314-016-01
光谱域多模态成像系统	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
托吡卡胺眼用溶液（1%）	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	用于瞳孔散大
赛拉嗪	Lloyd Laboratories	NADA 139-236