方法文章

稀有原代细胞的靶向代谢组学

DOI：

10.3791/65690

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2024年2月23日

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1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种准确且可靠地检测稀有细胞类型中代谢物的实验方案。通过技术改进，包括采用改良的鞘液进行细胞分选以及制备相应的空白对照样本，仅需每样本5000个细胞即可实现对代谢物的全面定量分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞功能高度依赖于代谢活动，而通过检测小分子中间产物可以研究其背后代谢网络的功能。然而，传统上要获得准确且可靠的细胞代谢测量结果，尤其是在造血干细胞等稀有细胞类型中，通常需要合并来自多个动物的细胞样本。目前已有新方案使研究人员仅用一只小鼠即可对稀有细胞类型进行代谢物检测，同时还能为较丰富的细胞类型生成多个重复样本，从而显著减少特定研究项目所需的动物数量。本方案在多个关键步骤上不同于传统的代谢组学流程，例如使用5 g/L NaCl作为鞘液、直接将细胞分选至乙腈中，以及采用严格的内标法进行靶向定量，从而实现对细胞代谢更准确、更全面的测量。尽管单细胞分离、荧光染色和分选过程耗时较长，该方案仍能在很大程度上保留不同细胞类型及药物处理之间的代谢差异。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代谢是所有活细胞中发生的基本生物学过程。代谢过程涉及一个庞大且高度调控、相互关联的生化反应网络，使细胞能够产生能量并合成必需的生物分子1。为了理解代谢网络的功能，研究人员会检测细胞内小分子中间产物的水平。这些中间产物是代谢活性的重要指标，能够揭示细胞功能的关键信息。

质谱法（MS）是复杂样品中代谢物特异性检测的首选方法1,2。核磁共振（NMR）在化合物的绝对定量和结构解析方面具有优势，但质谱法通常能够分辨生物流体或细胞提取物等复杂混合物中的更多组分。在实际应用中，质谱法通常与毛细管电泳（CE）、气相色谱（GC）或液相色谱（LC）等分离技术联用3。分离平台的选择主要取决于目标代谢物的范围、样品类型，以及实际条件下仪器设备和专业技术的可获得性。这三种分离平台均适用于广泛且部分重叠的代谢物范围，但各有局限性。简而言之，毛细管电泳仅能分离带电分子，且在实现大量样品的稳健分析时需要较高的操作经验4。气相色谱仅适用于分子量较小、足够非极性且在分解前可挥发的化合物3。考虑到所有市售的液相色谱柱，该技术理论上可分离任意两种代谢物5。然而，许多液相色谱方法的分辨能力低于同等分析时长的毛细管电泳或气相色谱方法。

代谢组学检测所需的起始材料通常为每份样品 5 × 105 至 5 × 107 个细胞、5–50 mg 湿组织或 5–50 µL 体液6。然而，在使用稀有细胞类型的原代细胞（例如造血干细胞（HSCs）或循环肿瘤细胞）时，往往难以获得如此数量的起始材料。这些细胞通常数量极低，且无法在不损害关键细胞特性的情况下进行培养。

造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）是造血系统中分化程度最低的细胞，能够在整个生物体生命周期中持续产生新的血细胞。造血过程的调控在白血病和贫血等疾病中具有重要的临床意义。尽管这些细胞至关重要，但HSCs和MPPs是造血系统中最稀有的细胞类型之一。通常，从一只小鼠中仅能分离出约5000个HSCs7,8,9。由于传统的代谢组学方法需要较多的起始材料，因此在分析这类稀有细胞时，常常需要合并多只小鼠的细胞样本10,11。

在此，我们旨在建立一种实验方案，仅需每样本5000个细胞即可检测代谢物，从而实现从小鼠单个造血干细胞（HSCs）中获取代谢组学数据。12同时，该方法可从单只小鼠中获得多个重复样本，尤其适用于淋巴细胞等细胞数量较丰富的细胞类型。此策略减少了特定研究项目所需的实验动物数量，从而有助于减少动物使用 "3R" 动物实验的“3R”原则（替代、减少、优化）

细胞内的代谢物周转速率可能非常高，通常以秒为单位13。然而，制备用于荧光激活细胞分选（FACS）的样品可能需要数小时，而FACS分选过程本身也可能耗时数分钟至数小时，这会导致在非生理条件下代谢组发生潜在改变。本方案中使用的某些试剂（如氯化铵-氯化钾[ACK]裂解缓冲液）也可能产生类似影响。这些条件可引起细胞应激，进而影响细胞内代谢物的水平和比例，导致对细胞代谢的测量结果不准确或产生偏差14,15,16。由于样品制备所引起的代谢变化有时被称为分选伪影。从坚硬或致密组织中制备单细胞悬液时，可能需要长时间的消化步骤和剧烈的试剂，这会加剧这一问题。可能发生的变化通常取决于细胞类型和处理条件。由于无法测量活体组织中未受干扰细胞的代谢状态，这些变化的具体性质仍不明确。

本方案与传统方法相比包含若干关键差异，主要包括使用5 g/L NaCl作为鞘液、直接将细胞分选至裂解缓冲液中、在亲水相互作用液相色谱-质谱联用（HILIC-MS）中注入大体积样品，以及采用靶向定量分析、严格使用内标和背景对照（图1）。该方案在很大程度上能够保留不同细胞类型之间以及药物处理组与溶剂对照组之间的代谢差异12。即使对于培养细胞，该方法也优于其他替代方案，例如更为常规的离心法和人工去除上清液的方法。然而，由于仍可能存在分选过程引入的人为假象，数据分析时需谨慎解读。尽管存在这一局限性，该方案仍是代谢谱分析领域的重要进步，可实现对稀有原代细胞代谢活动更准确、更全面的检测12。

在稀有原代细胞中稳定测定广泛代谢谱的能力，为涉及这些细胞的生物医学研究开辟了新的实验途径。例如，造血干细胞（HSCs）中由代谢介导的调控已被证实会影响其静息状态和自我更新能力，这对贫血和白血病的研究具有重要意义11,17。在患者来源的循环肿瘤细胞中，已观察到肿瘤细胞与邻近细胞在代谢相关基因表达上的差异18,19。本实验方案使得研究人员能够在代谢水平上系统地研究这些差异，而代谢水平通常被认为比基因表达更接近细胞表型。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案所用小鼠的繁育与饲养均在马克斯·普朗克免疫生物学与表观遗传学研究所（MPI-IE）的常规动物设施中进行，遵循当地主管部门（弗莱堡区政府）的相关规定。小鼠由经FELASA B级培训的人员采用CO2安乐死并实施颈椎脱位，操作过程符合MPI-IE动物福利委员会及当地主管部门批准的指南与规定。未进行任何动物实验，且小鼠无任何健康负担。

注意：本方案中使用的液相色谱-质谱（LC-MS）等高灵敏度分析方法有可能检测到样品中极微量的污染。因此，最大限度地减少此类污染至关重要。最关键的措施是在接触任何与样品接触的物品时始终佩戴洁净手套。这包括缓冲液和鞘液的配制、样品管的标记以及实验室设备的清洁。此外，应尽可能使用一次性实验耗材。玻璃器皿在使用前应以LC-MS级溶剂冲洗。保持清洁的实验环境也有助于减少污染。

1. 一般准备

  1. 配制内标储备液：在超纯水中配制含30% v/v异丙醇的6 mg/mL氯代苯丙氨酸（CLF）和6 mg/mL氨基对苯二甲酸（ATA）溶液。
  2. 配制FACS重悬缓冲液：将0.9 g NaCl、99.5 mL超纯水和0.5 mL内标储备液混合，预冷至4 °C。
  3. 配制鞘液：在鞘液罐中将30 g NaCl溶解于6 L去离子水中，并连接至细胞分选仪。
    ​注意：鞘液中NaCl的浓度已优化，可在细胞分选仪中实现与使用PBS作为鞘液时相当的液滴偏转稳定性，同时最大限度减少对LC-MS代谢物检测的不利影响12。较低浓度的NaCl有利于代谢物检测，但会削弱细胞分选的稳定性。

2. 从脾脏中分离B细胞和T细胞

  1. 每只小鼠准备 90 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），置于冰箱或冰上预冷至 4 °C。将离心机预冷至 4 °C。
  2. 脾脏的分离
    注意：在细胞分离及后续染色步骤中，最关键的是操作迅速、全程置于冰上，并使用低温（4 °C）缓冲液。否则，细胞的代谢谱可能发生显著变化。
    1. 在冰上准备一个 2 mL 反应管，内含 1.5 mL PBS。
    2. 根据当地主管部门批准的指南和方法，处死一只 C57BL6/J 小鼠。
    3. 用 70% 乙醇对毛皮进行消毒。
    4. 用剪刀打开腹腔，使用精细镊子取出脾脏，避免器官破裂。立即将脾脏放入冷 PBS（4 °C）中。
  3. 制备单细胞悬液
    1. 将 70 µm 细胞筛置于 50 mL 离心管上，并用 PBS 润湿。用注射器推杆的柄部将脾脏组织通过筛网，并用 30 mL 冷 PBS（4 °C）冲洗。
    2. 以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    3. 将沉淀重悬于 1 mL ACK 裂解缓冲液中，在室温（RT；20 °C）孵育 2 分钟。
    4. 加入 50 mL 冷 PBS（4 °C），以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  4. FACS 染色
    1. 每只小鼠用 500 µL 冷 PBS（4 °C）配制抗体混合液：CD3-PE（1:200）、B220-A647（1:200）。
    2. 将细胞沉淀重悬于抗体混合液中，转移至 5 mL FACS 管。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
    3. 加入 3 mL 冷 PBS（4 °C），以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    4. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 冷 FACS 重悬缓冲液（4 °C）中，通过带滤膜帽的 FACS 管过滤。细胞即可用于基于流式细胞术的分选。

3. 从骨髓中分离造血干细胞和多能祖细胞

  1. 解剖并分离骨髓。
    注意：在整个操作过程中，最关键的是要迅速操作，并始终保持分离的骨骼和细胞处于低温（4 °C）状态，以确保结果的准确性。此外，为尽量减少背景信号，应在洁净的空间内操作，并使用洁净的实验器材。
    1. 根据当地主管部门批准的指南和方法处死小鼠。
    2. 用70%乙醇喷洒小鼠下半部分。
    3. 使用剪刀解剖腿部和脊柱。在背部做切口，并将切口延伸至腹部周围。剥离后肢的皮肤。
    4. 撕开或剪下后肢，确保腿部包含胫骨、股骨和髋关节。
    5. 用剪刀紧贴脊柱剪下，直至完全分离。
    6. 将后肢和脊柱放入含有冷PBS（4 °C）的6孔板中，并将板置于冰上。
    7. 使用解剖刀和剪刀去除股骨、胫骨、髋关节和椎骨上的软组织。
    8. 用研钵和研杵在5 mL冷PBS（4 °C）中研碎已清理的骨骼。
    9. 将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤至50 mL离心管中。
    10. 重复步骤3.1.8–3.1.9 ，直至骨骼完全呈白色。
  2. 红细胞裂解：
    1. 将收集的细胞悬液在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
    2. 用1 mL冷ACK缓冲液（4 °C）重悬细胞沉淀，冰上孵育5分钟。
    3. 加入冷PBS（4 °C）以终止反应（可选）。
    4. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  3. 谱系耗竭：
    注意：为富集谱系阴性（Lin-）细胞，使用了针对CD4细胞的阴性筛选试剂盒。
    1. 准备磁珠：
      1. 将500 µL磁珠加入2 mL微量离心管中。将管子置于磁力架上，弃去上清液。
      2. 用1 mL冷PBS（4 °C）洗涤磁珠，弃去上清液。
      3. 加入500 µL冷PBS（4 °C），并将磁珠保持在低温（4 °C）。
    2. 在避光条件下，将细胞与500 µL谱系抗体混合物（试剂盒提供的抗体50 µL + PBS 450 µL）在4 °C下振荡孵育25分钟。
    3. 用冷PBS（4 °C）洗涤细胞。
    4. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
    5. 用1000 µL冷PBS（4 °C）重悬细胞，并将细胞悬液转移至磁珠溶液中。
    6. 在4 °C下于旋转仪上孵育15分钟。
    7. 将管子置于磁力架上，等待溶液澄清后，将上清液转移至新的FACS管中。
    8. 用500 µL PBS洗涤磁珠。
    9. 将管子置于磁力架上，等待溶液澄清。
    10. 将上清液转移至新的FACS管中。
    11. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  4. FACS染色
    1. 每只小鼠在冷PBS（4 °C）中配制300 µL抗体混合液。
    2. 干细胞/祖细胞抗体混合液：HSCs：CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000)，c-Kit - PE(1:1000)，Sca1 - APC-Cy7(1:500)，CD48 - BV421(1:1000)，CD150 - BV605(1:300)
    3. 在4 °C避光条件下孵育40分钟。
    4. 用1 mL冷PBS（4 °C）洗涤。在4 °C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于1 mL FACS重悬缓冲液中，并通过带滤膜帽的FACS管过滤细胞。

4. 流式细胞分选

  1. 设置细胞分选仪。
    1. 插入 70 µm 喷嘴。激活 405 nm、488 nm、561 nm 和 633 nm 激光器。
    2. 将分选模式设为 4 向纯度：得率掩码 0，纯度掩码 32，相位掩码 0
    3. 将液滴频率设为 90,400 Hz，并根据制造商说明调节振幅和液滴延迟。将板电压设为 5000 V。
    4. 根据制造商说明定义分选门控。
      1. 对于所有细胞类型，首先根据前向散射和侧向散射信号选择单个细胞，随后根据细胞类型特异性染色进行进一步选择。
      2. 对于 B 细胞，选择 AF647 阳性、PE 阴性群体。
      3. 对于 T 细胞，选择 PE 阳性、AF647 阴性群体。
      4. 对于 HSCs，选择 PE-Cy7 低表达、PE 阳性、APC-Cy7 阳性、BV605 阳性、BV421 阴性群体。
      5. 对于 MPPs，选择 PE-Cy7 低表达、PE 阳性、APC-Cy7 阳性、BV421 阳性、BV605 阴性群体。
      6. 对于碎片样本，根据前向散射和侧向散射信号选择尺寸过小、不足以代表完整细胞的事件。典型的流式细胞分析图示见 图 2 和 图 3。
    5. 调节流速，使每秒事件数低于 15,000。
  2. 准备收集板
    1. 制备酵母提取物储备液：将一份 13C 标记的酵母提取物溶于 7.5 mL 超纯 H2O 和 2.5 mL 甲醇中。
    2. 制备提取缓冲液：将 10 µL 13C 标记酵母提取物储备液加入 10 mL 乙腈中并混匀。
    3. 准备收集板：向将用于收集样本的 96 孔 PCR 板的每个孔中加入 25 µL 提取缓冲液。为减少蒸发，用 PCR 盖板（将条板切割成单个盖子）覆盖各孔。
  3. 进行细胞分选。
    1. 根据需要打开收集孔以收集分选后的细胞，并尽快关闭，以减少蒸发。
  4. 若样本无法立即检测，可将其置于密封容器中，在 -80 °C 下保存数天。解冻后，对样本进行 5 分钟超声处理，以确保代谢物完全重悬。

5. LC-QQQ-MS 测定

  1. 准备液相色谱溶剂
    1. 制备甲巯基丙二酸（medronic acid）储备液（100 mM）：将17.6 mg甲巯基丙二酸溶解于1 mL超纯H2O中。
    2. 制备缓冲液A：将1.92 g碳酸铵溶解于1 L超纯H2O中，并加入50 µL甲巯基丙二酸储备液。
    3. 制备缓冲液B：将50 mL缓冲液与450 mL乙腈混合。
    4. 制备液相色谱测试混合液：将亮氨酸、异亮氨酸、AMP、ADP和ATP各1 ppm溶于80:20乙腈:超纯H2O中。
      注：甲巯基丙二酸储备液可在-20 °C保存数月；其他缓冲液可在室温下保存2天。
  2. 编程液相色谱-三重四极杆质谱（LC-QQQ-MS）方法
    1. 根据仪器制造商的说明优化化合物特异性质谱参数（例如碰撞能量）。对于Agilent 6495系列仪器，请使用补充表1中的设置。
    2. 根据制造商说明优化离子源特性的质谱参数。对于配备JetStream加热电喷雾电离（ESI）源的仪器，使用以下参数：气体温度：240 °C，气体流速：15 L/min，雾化器：50 psi，鞘气温度：400 °C，鞘气流速：11 L/min，毛细管电压：2000 V，喷嘴电压：300 V。
    3. 根据制造商说明优化离子传输光学系统参数。对于配备iFunnel离子光学系统的Agilent仪器，使用以下参数：高压RF正离子模式：110 V，高压RF负离子模式：90 V，低压RF正离子模式：80 V，低压RF负离子模式：60 V。
    4. 编程液相色谱梯度程序：0 min，95% B，150 µL/min；18 min，55% B，150 µL/min；19 min，30% B，150 µL/min；21.5 min，30% B，150 µL/min；22 min，95% B，150 µL/min；22.7 min，95% B，200 µL/min；23.5 min，95% B，400 µL/min；结束时间28 min。色谱柱温度：35 °C。
  3. 设置液相色谱-质谱（LC-MS）仪器
    1. 将色谱柱连接至温控柱温箱中。
    2. 连接缓冲液并冲洗所有管路。
    3. 至少运行4针空白样品或混合样品以平衡色谱柱。
  4. 运行液相色谱测试混合液以检查色谱性能。确保满足以下标准；若不满足，请在运行样品前对仪器进行清洗或故障排查。
    1. 确认初始背压<150 bar，最大背压<400 bar。
    2. 确认保留时间在±1 min范围内：异亮氨酸6.0 min，亮氨酸6.4 min，AMP 9.5 min，ADP 11.2 min，ATP 12.7 min。
    3. 确保亮氨酸与异亮氨酸在+132->86跃迁通道中的谷值低于峰高的<20%。
    4. 确保AMP与ADP的保留时间差为1.5至1.9 min，ADP与ATP的保留时间差为1.1至1.9 min。
  5. 设置样品序列
    1. 以空白样品开始，以最小化液相色谱测试混合液带来的残留效应。
    2. 以随机顺序运行样品。
    3. 以空白样品结束，以清洗色谱柱供后续实验使用。

6. 在 automRm 中进行数据预处理

注意：以下步骤讨论在 msconvert 中将 .d 文件转换为 .mzML 文件、metabdb 的准备、数据与模型及 metabdb 的加载，以及手动峰审查的一般策略。

  1. 使用 ProteoWizard20 将原始数据从 .d 格式转换为 .mzML 格式，设置如下：二进制编码精度：32 位，MS 级别 1-2，选中生成索引，选中使用 zlib 压缩。
  2. 启动 R。
  3. 根据软件包文档安装 automRm21（仅需在首次使用前安装一次）。
  4. 在 R 中启动 automRm 图形用户界面：automRm::automrm_gui()
  5. 在标签页 处理 > 批量处理 中处理一批 .d 文件。
    1. 选择包含代谢物信息的 .xlsx 文件。该文件必须与 LC-QQQ-MS 方法匹配。
    2. 选择包含峰检测机器学习模型的 .RData 文件。
    3. 选择包含峰报告机器学习模型的 .RData 文件。
    4. 选择包含 .mzML 文件的项目文件夹。
    5. 点击 批量处理 开始数据预处理。
  6. 预处理完成后，打开 peakoverview.pdf 以检查色谱峰的正确检出情况。可选操作：在 automRm 图形用户界面的 审阅 标签页中加载 automRmdata_Review.RData，以手动调整峰过滤和峰积分。
  7. 打开项目文件夹中的 peakinfo.xlsx 并检查数据。
    1. 在标签页 13CArea 中检查 13C 内标信号：确保实验组之间以及细胞样品与碎片样品之间的强度值无系统性差异。若存在此类差异，则后续分析仅使用标签页 NormArea 或 NormHeight 中的数据；否则，使用标签页 RawArea 或 RawHeight 中的数据。
    2. 在标签页 RawArea 中检查内标 ATA 和 CLF 的信号强度。确保任一化合物在各实验组间的强度无系统性差异。
    3. 针对每种代谢物，将含细胞的样品信号强度与来自相同细胞悬液的碎片样品进行比较。使用适当的统计检验，识别出含细胞样品信号强度显著高于碎片样品的代谢物。仅将通过该检验的代谢物纳入后续数据分析。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FACS 分选能够从同一细胞悬液中分离出不同细胞类型的纯净群体（图2 和 图3）。该方法的特异性依赖于使用特定表面标志物（例如，脾脏中的B细胞和T细胞）或特定组合的表面标志物（例如，HSCs和MPPs）对不同细胞类型进行染色。对细胞内标志物的染色通常需要对细胞膜进行通透处理。这可能导致代谢物泄漏，因此此类染色不适用于本方案。

液相色谱（LC）在质谱（MS）检测之前实现代谢物的分离（图4）。代谢物从HILIC色谱柱洗脱时大致按极性排序，极性较小的化合物先洗脱，极性较大的代谢物后洗脱。信号强度取决于样品中目标代谢物的含量以及该代谢物特异的响应因子。因此，不同代谢物之间的信号强度无法进行有意义的比较，只能在同一代谢物的不同样品之间进行比较。图4中突出显示的3个峰分别代表：1：烟酰胺在碎片和细胞提取物中均有检测到，但水平不同；2：乙酰肉碱几乎仅在细胞提取物中检测到；3：内标氨基对苯二甲酸在碎片样品和细胞提取物中的检测水平相同。

利用FACS-LC-MS联合方案，可保留来自同一组织的不同细胞类型之间的代谢差异（图5）。对于HSC和MPP细胞，需要来自6只小鼠的细胞以生成6个样本，因此每组内部的变异性较之从小鼠脾脏中分选的B细胞和T细胞更大。代表流程空白对照的碎片样本与含有细胞提取物的样本明显分离。在碎片样本中，两次实验之间也呈现出清晰的分离，突显了细胞在分选前经历的代谢环境差异。当以聚类热图形式展示时（图6），可进一步观察到各样本间代谢物相对水平等额外信息。

细胞悬液、染色、FACS分选和HILIC-MS分析用于细胞研究的流程图。
图1：本方案关键步骤的概览。 该图已获许可转载自 Schoenberger 等人12。 请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术示意图；细胞分选过程；利用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）进行单细胞分析；B细胞、T细胞计数。
图2：从小鼠脾脏中分离纯化的B细胞和T细胞群体。 根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）信号选择细胞和碎片事件。根据细胞类型特异性染色信号选择B细胞和T细胞。本图经Schoenberger等12许可改编。请点击此处查看此图的放大版本。

流式细胞术分析；细胞群门控图；干细胞鉴定过程。
图3：从小鼠骨髓中分离造血干细胞（HSC）和多能祖细胞（MPP）。 根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号选择细胞和碎片事件。HSC和MPP细胞群根据多个阶段的细胞类型特异性染色信号进行筛选。本图经Schoenberger等12许可改编。请点击此处查看此图的放大版本。

吸收值随保留时间变化的高效液相色谱图；化合物分离分析。
图4：示例色谱图。 样品分别为（A）5000个造血干细胞和（B）来自同一次分选的5000个碎片事件。请注意，两个图中的坐标轴采用相同的比例尺。高亮显示的代谢物分别为：1：烟酰胺，2：乙酰肉碱，3：氨基对苯二甲酸（ATA）。 请点击此处查看该图的放大版本。

比较不同实验中细胞类型的PCA散点图；突出显示聚类和变异分析。
图5：同一实验中不同细胞类型及碎片背景样本代谢谱的主成分分析（PCA）。 不同器官之间以及任何器官的碎片背景样本之间均表现出显著分离。此外，各器官内的细胞类型也能够被清晰区分。请点击此处查看该图的放大版本。

代谢物水平的热图；实验显示细胞类型分布及层次聚类。
图6：在不同细胞类型及相应背景对照样本（碎片）中检测到的代谢物热图表示。 缺失值以该代谢物在所有样本中的最小值的一半进行填补。绘图时，每行数据分别归一化至其最大值。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：该表格列出了所选代谢物的化合物特异性参数，包括保留时间（RT）、极性（Pol）、母离子质荷比（Q1）、子离子质荷比（Q3）以及碰撞能量（CE）。 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用本方案成功实施靶向代谢组学最关键的步骤包括：1）采用稳健的染色和设门策略，以获得纯净的细胞群体；2）精确处理液体体积；3）所有实验步骤（尤其是代谢物提取前的所有步骤）的时间需具有可重复性。理想情况下，属于同一批实验的所有样本应在同一批次中进行处理和检测，以尽量减少批次效应22。对于规模较大的实验，建议将细胞提取物收集后保存于 -80 °C，随后在同一批次中完成所有提取物的检测。

处理低输入量样本时，必须特别注意实验过程中所用所有材料的清洁操作23。常见的污染物包括残留缓冲液、去污剂以及护肤品。减少污染的最重要措施是在整个实验过程中使用合适的手套。

为了尽量减少细胞因暴露于非生理条件而导致的代谢物组成变化，至关重要的是在冰上使用预冷试剂（4 °C）进行样品制备。此外，在FACS步骤之前尽可能快速操作将提高测量结果的质量2。抗体染色所建议的时间应尽可能短，同时保证良好的染色效率。在FACS染色程序之前，可增加一步使用Fc阻断抗体来封闭抗体与Fc受体的非特异性结合24,25。这可以防止目标细胞群体受到污染，尤其建议在处理含有大量高表达Fc受体细胞类型（如单核细胞或巨噬细胞）的细胞悬液，或在无血清培养条件下培养的细胞时采用。然而，该步骤将使总体操作时间延长10–15分钟，因此可能为实验结果引入额外的非生理变异。

利用现代质谱仪上的动态多反应监测（MRM）方法，通过一次进样即可检测化合物特定设置中列出的所有代谢物。限制目标代谢物的数量，可使该方案适用于较旧的质谱仪，并加快数据预处理和数据分析的速度。

LC-MS 数据中存在一定程度的背景信号是不可避免的。因此，必须仔细识别那些高于背景水平的代谢物。通过排除过小、不足以代表完整细胞的事件（碎片），可生成相应的过程空白样本，以反映基质依赖性的背景信号强度。此外，内标物有助于识别存在问题的样本，这些样本应从后续数据分析中剔除26。上述两种质量保证措施在具备足够数量重复样本时效果最佳。我们建议每组至少使用六个重复样本。

披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所动物设施为本研究提供了实验动物。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
13C 酵母提取物Isotopic SolutionsISO-1
40 µm 细胞筛Corning352340
乙腈，LC-MS 级VWR83640.32
ACK 裂解缓冲液Gibco104921替代产品：Lonza，货号 BP10-548E
二磷酸腺苷（ADP）Sigma AldrichA2754
单磷酸腺苷（AMP）Sigma AldrichA1752
三磷酸腺苷（ATP）Sigma AldrichA2383
碳酸铵，HPLC 级Fisher ScientificA/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC 色谱柱（100 × 2.1 mm，1.7 µm）Waters186009982
B220-A647Invitrogen103226
B220-PE/Cy7BioLegend103222RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7BioLegend101216RRID:AB_312799
CD150-BV605BioLegend115927RRID:AB_11204248
CD3-PEInvitrogen12-0031-83
CD48-BV421BioLegend103428RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7BioLegend100422RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7BioLegend100722RRID:AB_312761
cKit-PEBioLegend105808RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched 小鼠 CD4 细胞分离试剂盒 Invitrogen11415D
FACSAria IIIBD
Gr1-PE/Cy7BioLegend108416RRID:AB_313381
热封膜NeolabJul-18
异亮氨酸Sigma Aldrich58880
JetStream ESI 电离源AgilentG1958B
亮氨酸Sigma AldrichL8000
甲基丙二酸Sigma AldrichM9508-1G
甲醇，LC-MS 级Carl RothHN41.2
NaClFluka31434-1KG
PBSSigma AldrichD8537
Sca1-APC/Cy7BioLegend108126RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7BioLegend116221RRID:AB_2137789
三重四极杆质谱仪Agilent6495B
Twin.tec 96 孔低吸附带裙边 PCR 板Eppendorf30129512
UHPLC 自动进样器AgilentG7157B
UHPLC 色谱柱温控模块AgilentG7116B
UHPLC 泵AgilentG7120A
UHPLC 样品温控模块AgilentG4761A

参考文献

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