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通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

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DOI：

10.3791/65772

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2024年1月26日

 ,  ,  , 
1Refeyn Ltd., 2Adaptix Ltd., 3Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, University of Oxford, 4The Kavli Institute for Nanoscience Discovery, University of Oxford

本文内容

摘要

本方案将质谱光度法与一种新型微流控系统相结合，用于研究低亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法基于对溶液中高浓度复合物的快速稀释，从而实现对低亲和力的测量，并拓展了质谱光度法的应用范围。

摘要

质谱光度法是一种多功能的质量测量技术，可在无标记条件下研究溶液中的生物分子相互作用及复合物形成。质谱光度法通常适用于分析浓度范围在 100 pM 至 100 nM 的样品。然而，在许多生物系统中，为了研究低亲和力或瞬时相互作用，需要测量更高浓度的样品。本文展示了一种有效扩展质谱光度法分析浓度范围的方法，使其可从纳摩尔级别扩展至数十微摩尔级别。

在本实验方案中，将质量光度法与一种新型微流控系统相结合，用于研究溶液中微摩尔浓度范围内蛋白质复合物的形成。利用该微流控系统，用户可将样品维持在所需的较高浓度，随后在质量光度测量前数毫秒内稀释至纳摩尔浓度范围。由于稀释速度极快，可在样品平衡状态发生改变（即复合物解离）之前获取数据。

该技术用于检测免疫球蛋白G（IgG）抗体与新生儿Fc受体之间的相互作用，揭示了高阶复合物的形成，而此类复合物无法通过静态质量光度测量进行定量。

综上所述，质谱光度法与微流控技术的结合使得在微摩尔浓度范围内表征样品成为可能，并能够有效测量亲和力较弱的生物分子相互作用。这些能力可应用于多种研究场景——包括生物治疗药物的开发与设计——从而实现对多种蛋白质-蛋白质相互作用的全面表征。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用是大多数细胞功能的基础，从免疫调节到DNA复制和翻译均依赖于此。因此，在生命科学领域普遍存在一种基本需求，即研究在通常形成的多种异源复合物中广泛存在的各类相互作用。然而，这些相互作用的检测、表征和定量往往具有挑战性，尤其是对于低亲和力的相互作用1。

免疫沉淀实验常用于检测高亲和力相互作用，但对于低亲和力和瞬时相互作用，检测在很大程度上难以实现2。荧光技术也可用于检测，但需要添加可能干扰功能的荧光标记2。冷冻电镜（Cryo-EM）能够以高空间分辨率提供蛋白质复合物形成的结构快照和整体性读数，但通常需要在浓度过低的条件下工作，因而难以对低亲和力相互作用进行成像。此外，冷冻电镜还面临成本、可及性、样品制备和分析时间等方面的挑战3。

此外，表面等离子共振（SPR）已成为定量分析蛋白质-蛋白质相互作用的常用方法，但该技术需要将蛋白质固定在固相表面，这可能影响结合平衡并导致结合速率变化，从而降低测量准确性4,5。此外，在数据采集与分析之前还需进行多个实验步骤6。

质谱光度法是一种单分子技术，已被用于分析蛋白质-蛋白质相互作用5,6,7。该技术通过测量单个分子或复合物在落到玻璃盖玻片表面时散射的光来确定其质量8。质谱光度法已被用于通过结合伙伴及其形成复合物的相对丰度来量化结合亲和力5。然而，与其他单分子技术类似，待测样品的浓度通常应低于100 nM。若浓度过高，分子在玻璃表面的着陆位置会发生空间重叠，导致数据质量下降7。因此，对于在较低浓度下即发生解离的较弱相互作用（KD ~微摩尔级），由于无法观察到游离态与结合态物种所必需的混合状态，难以进行可靠测量5。

本文介绍了一种基于新型耦合微流控质光度技术装置的解决方案，可克服上述局限性。具体而言，该方法将微流控系统与质光度仪结合使用，从而有效扩展了质光度法可定量检测的相互作用范围。研究表明，微流控技术为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了多种可能性，包括通过快速稀释来检测弱相互作用1,9。本文所述系统通过在微流控芯片上实现样品最高达10,000倍的快速稀释，并立即将稀释后的样品流经芯片的观测区域，使得质光度测量可在分子开始稀释过程后的50毫秒内启动10。稀释过程发生在芯片上的反向特斯拉阀混合器中，当样品与缓冲液在此处汇合时，两种溶液的相对流速决定了稀释倍数（见实验方案第8步）。流速可通过微流控控制软件进行调节。改变流速可能影响物种的相对比例，因为它会影响分子在玻璃表面的结合事件数量，而这一参数正是质光度仪所测量的内容。

该过程的速度足够快，可在相互作用的完整性被破坏之前完成测量（更多细节参见讨论部分）。通过简要了解一级反应理论即可理解这一点，其中 figure-introduction-1。正向（结合）速率常数为 kf，逆向（解离）速率常数为 kb，平衡解离常数（KD）定义为

KD = kb / kf

用于蛋白质结合 kf 通常受限于反应物的扩散11 其范围限制在10以内6-107 M-1·s-1由于的范围有限，因此采用低亲和力（KD ~微摩尔）反应将具有 kb ≈ 1 s-1也就是说， kb = kf · KD = (106 M-1·s-1) (10-6 M) = 1 s-1，该复合物的半衰期约为 0.7 s11,12.

我们的示例系统是IgG单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）与IgG新生儿Fc受体（FcRn）可溶性结构域之间的结合，二者是已知的相互作用分子对13。先前仅使用传统质量光度法（即通过手动稀释样品）获得的发表数据显示，这些蛋白质会形成多种物种。FcRn单体、FcRn二聚体以及未结合的IgG清晰可见，而IgG-FcRn复合物（以1:1和1:2的比例）在pH 5.0条件下虽可检测到，但丰度极低5。这一观察结果引发了一个问题：如果在更高浓度下进行测量，是否能更清晰地检测到IgG-FcRn复合物的形成？事实上，将质量光度法与本文所述的耦合快速稀释方法相结合，通过增加检测到的粒子数量，为复合物的形成提供了更可靠的证据。

本文所述的质量光度法与微流控方案可实现对解离常数（KD）达到微摩尔范围的复合物形成过程进行表征。要准确测定KD值，还需进一步提高流量传感器的精度、泵的稳定性、芯片间的一致性，以及观测窗口内测量位置的重复性，因为这些因素均会影响样品稀释至实际测量之间的时间间隔。

只要可溶性蛋白质具有不同的分子量（相差至少25 kDa），且分子量在质光度计可分析的范围内（30 kDa至6 MDa），该方法也可用于研究任意可溶性蛋白质之间的结合。所获得的见解可能有助于多种领域的研究——从深入理解细胞功能的分子机制，到新型生物治疗药物的设计。

方案

1. 准备仪器并启动软件

  1. 打开质光仪，并在开始任何测量前至少预热1小时。
    注意：由于仪器需要达到恒定温度，若未预热1小时，可能导致质量偏移，从而产生不准确的结果。
  2. 通过打开电源并按下隔振按钮（位于质光仪下方）来启动防振台。振动会限制质光仪的性能，因此防振台对于确保仪器的最大灵敏度至关重要。同时打开微流控控制箱。
  3. 启动数据采集软件和微流控控制软件。 打开空气压缩机。 

2. 蛋白质样品、缓冲液和清洗溶液的制备

  1. 取 200 mL PBS（pH 7.4）缓冲液加入一个洁净的 200 mL 瓶中，另取 200 mL PBS（pH 5.0）缓冲液加入第二个 200 mL 瓶中。
    注意：在后续步骤中，这两个 200 mL 瓶需连接至 "L" 流通单元传感器。校准测量使用 pH 7.4 的 PBS 缓冲液，样品测量使用 pH 5.0 的 PBS 缓冲液。
  2. 在一支 0.5 mL 离心管中，按 1:10 的比例混合 IgG（2 µM）和 FcRn（20 µM），总体积为 60 µL。
    1. FcRn 和 IgG 的储备液浓度分别为 91.9 µM 和 13.5 µM。配制反应液时，在离心管中加入 9 µL IgG 储备液 + 13 µL FcRn 储备液 + 38 µL PBS（pH 5.0，室温 [RT]），总体积为 60 µL。两种反应物的终浓度分别为 IgG 2 µM 和 FcRn 20 µM。整个操作过程中，所有蛋白储备液均需置于冰上保存。
  3. 在另一支 0.5 mL 离心管中，加入 20 µL 浓度为 20 µM 的 β-淀粉酶校准品。
    1. 以本实验所用 β-淀粉酶校准品为例，其配制方法请参照 2.3.1.1–2.3.1.2 步骤。
      1. 将 20 mg β-淀粉酶粉末用 3.57 mL PBS（含 5% 甘油）溶解于原瓶中，得到浓度为 5.6 mg/mL 的溶液，其摩尔浓度为 100 µM（分子量为 56 kDa）。
      2. 将 100 µM 储备液稀释至 20 µM：取 200 µL 100 µM 储备液与 800 µL PBS（pH 7.4，室温）混合于 1 mL 离心管中。
  4. 将样品在室温下孵育至少 30 分钟。
    ​注意：在开启质量光度计后，即可开始配制样品和校准品的稀释液。本实验中，样品孵育时间为 120 分钟。
  5. 在三个 50 mL 离心管中分别分装：50 mL PBS（pH 7.4）——清洗液 1（CS1）、50 mL 0.5 M NaOH——清洗液 2（CS2）和 50 mL 100% IPA——清洗液 3（CS3）。

3. 实验设置

  1. 加载样品和校准液时，将校准液离心管置于微流控盒的 4 号位置，将样品离心管置于 5 号位置（图 1）。
  2. 加载清洗液时，将 CS1、CS2 和 CS3 分别置于微流控盒的 1、2、3 号位置（图 1）。
    注意：样品、校准液和清洗液均连接至多通阀（m-开关）。m-开关连接至 "S" 流通单元传感器。
  3. 将连接缓冲液管路的瓶盖拧紧至 200 mL（pH 7.4）缓冲液瓶上。
    注意：缓冲液管路 连接至一个截止阀，该截止阀连接至 "L" 流通单元传感器。截止阀可防止缓冲液流停止时可能发生的虹吸效应。虹吸可能导致稀释后的残留液体回流至缓冲液储液瓶，造成污染。
  4. 将微流控芯片放置于制备板上。
    将 "S" 流通单元传感器的另一端管路插入微流控芯片第一通道的 "样品入口"（图 1）。样品管路连接完成。
  5. 将 "L" 流通单元传感器的另一端管路插入微流控芯片第一通道的 "缓冲液入口"（图 1）。缓冲液管路连接完成。
  6. 为收集流出液，将一根管路插入微流控芯片第一通道的 "出口"，并将另一端置于废液收集瓶或烧杯中，确保液体顺利排入（图 1）。

4. 使用缓冲液预润样品管路和缓冲液管路

  1. 打开缓冲液管路上的手动截止阀。
  2. 在微流控控制软件中，将缓冲液管路的流速设置为 1000 µL/min，并确保缓冲液管路压力不超过 110 mbar（图 2）。缓冲液管路将自动开始流动（图 1）。
    注意：如果缓冲液管路压力超过 110 mbar，可能是由于空气通过了流量传感器。如果几秒内压力未恢复正常，则可能存在堵塞（通常由于连接处的管路受压变形所致）。此时应停止流动，并从截止阀开始检查缓冲液管路中的各连接处。
  3. 在微流控控制软件中，选择 m-开关的第 1 位（对应 PBS 缓冲液），然后将样品管路的流速设为 8 µL/min，并确保样品管路压力不超过 350 mbar。样品管路将自动开始流动（图 1）。
  4. 使用移液器吸头（或其他软质塑料部件）从芯片上方靠近被截留气泡的位置施加轻微压力，以松动并排出气泡。
    ​注意：务必清除正在使用的通道中“混合区”和“观察区”（图 1）内的所有气泡。操作时注意不要用力过猛，以免损坏芯片。

5. 将微流控芯片放置到质谱光度计上并找到焦点

  1. 在质量光度计的物镜上滴加一滴显微镜浸油。
  2. 将微流控芯片放置在质量光度计的支架上，使"样品入口"朝上，并用载物台夹具固定（图1）。确保所有管路连接保持牢固。
  3. 使用数据采集 软件移动载物台，确保第1通道的"观察区域"与物镜对齐（图1）。
  4. 关闭质量光度计的盖子，并在数据采集 软件中选择Droplet-Dilution Find Focus选项。
  5. 检查数据采集软件左下角的白色对焦环（图3）。若对焦环出现缺口，表明浸油中存在气泡；可通过将载物台速度调至最大并轻轻横向移动载物台来消除气泡。
  6. 对焦完成后，等待2-3分钟再进行首次记录。然后点击Record按钮，记录一段1分钟的测量数据，并通过观察确认无杂质出现。
    注意：杂质可能存在于玻璃表面或缓冲液中。数据采集 软件中的清晰度（Sharpness）值应高于4.5%。

6. 质量光度法校准

  1. 在微流控控制软件中，将 m-开关切换至位置 4（对应校准物），并确保样品管线流速设置为 8 µL/min，且样品管线压力不超过 350 mbar图2).
    1. 校准液将开始流经芯片。等待约1.5–2.5分钟（或直至在数据采集软件中持续观察到校准液信号）。具体时间可能因样品管路长度不同而有所差异。
  2. 一旦校准物持续出现（即事件数量足以进行准确的质量光度测量），在微流控控制软件中将流速降低至0.5 µL/min——本实验的目标稀释水平。
    注意：起始时采用较高的流速仅能缩短校准液到达芯片所需的时间。
  3. 确保没有 "太少" 或 "太多" 分子落在测量表面（图4).
    1. 如果着陆事件密度不是 "理想" (图4），在微流控控制软件中调整流速。如果事件密度太低，增加样品流速，直至观察到分离良好的着陆事件（但不要超过 8 µL/min）。如果事件密度过高，则降低样品流速（但不要低于 0.1 µL/min）。
    2. 如果样品管中的校准品体积不足，应将多通阀位置切换至 PBS pH 7.4 管线（位置 1），以避免注入空气。
  4. 按压 记录 并进行60秒的测量。将文件保存至选定的文件夹中。
    ​注意：数据采集软件生成的文件扩展名为 .mp。

7. 清洗样品管路并停止液体流动

  1. 在微流控控制软件中，将m开关切换至位置2，并将样品压力调整为800 mbar（图2）。用CS2（NaOH）冲洗系统4分钟。
  2. 将m开关切换至位置3，并用CS3（IPA）冲洗系统4分钟。
  3. 将m开关切换至位置1，并用CS1（PBS）冲洗系统4分钟。
  4. 在微流控控制软件中，将样品通道和缓冲液通道的压力均设为0，关闭缓冲液阀门，停止所有流体流动。
  5. 从载物台上取下芯片，将其放回制备板上。断开所有管路连接，并将样品管末端放入废液瓶中。使用异丙醇和擦拭纸清洁物镜。

8. 测量质量光度法样品

  1. 拧下连接至 200 mL (pH 7.4) 缓冲液瓶的瓶盖，并将其拧到 200 mL (pH 5.0) 缓冲液瓶上。
  2. 重复步骤 3.4–5.6，但使用芯片的第二通道而非第一通道。
  3. 在微流控控制软件中，将 m-开关切换至位置 5（对应样品），将样品通道流速设为 8 µL/min，并确保样品通道压力不超过 350 mbar（图 2）。
  4. 重复步骤 6.2–6.4 以测量样品。
    1. 为计算所需流速，请确保流速的倍数差异与目标样品稀释倍数一致。例如，若要在此实现 2000 倍稀释，则流速应相差 2000 倍；缓冲液流速为 1000 µL/min，样品流速为 0.5 µL/min。每次实验结束后，务必按照清洗方案清洗管路，保持系统清洁。

9. 数据分析

  1. 数据采集完成后，启动数据分析软件（图5）。
  2. 单击左上角的加号（+）图标，并选择 .mp 校准文件。软件将开始分析加载的文件。根据文件大小和测量次数的不同，此过程可能需要几分钟时间。
    1. 在使用数据采集软件进行数据采集的同时，切勿在数据分析软件中分析 .mp 文件，因为这可能会降低正在采集的数据质量。
  3. 按下创建质量校准按钮（右下角）。将弹出一个对话框，其中显示包含拟合峰对比值的表格。
  4. 将数值更改为拟合峰对应的实际已知质量值（对于β-淀粉酶，这些值分别为56 kDa、112 kDa和224 kDa），然后点击保存。新创建的校准文件（扩展名为.mc）将出现在质量校准面板中（位于数据分析软件的左下角）（图6）。
  5. 单击左上角的加号（+）图标，并选择 .mp 样品文件。
  6. 如需生成质量直方图（如图5所示），请转到分析选项卡，选择直方图模式和质量绘图选项。根据需要调整组距宽度、质量范围及其他参数。
  7. 如需进一步自定义图表，可在导出图像和/或以 .dmp 文件格式保存整个工作区之前，切换至图表选项卡进行设置。

结果

采用质量光度法测量IgG单克隆抗体曲妥珠单抗与IgG新生儿Fc受体（FcRn）可溶性结构域之间的相互作用。将两种蛋白质以1:10的比例混合（IgG浓度为2 µM，FcRn浓度为20 µM），随后分别用PBS手动稀释至10 nM和20 nM。

稀释步骤是必要的，因为质量光度法是一种单分子质量测量技术，只能分析浓度在 100 pM–100 nM 范围内的样品。尝试测量超出此浓度范围的样品可能会影响结果的准确性（图 4）。本实验未包含在本方案中，因其此前已有描述5,6。

在质谱光度法实验生成的质量直方图中，每个着陆事件的散射信号强度（或“对比度”）沿x轴绘制，并通过质量-对比度校准步骤转换为分子质量。同时，y轴表示具有特定质量（或对比度）的分子计数数量。因此，峰的存在表明在x轴所示分子量范围内存在一个分子群体。构成该峰的事件数（计数）反映了该群体的大小。

通过手动稀释进行的质量光度测量得到的质量直方图中，根据蛋白质预期的分子量，两个最显著的峰分别对应于未结合的FcRn单体（~50 kDa）和IgG抗体单体（~150 kDa）（图7）。与先前发表的质量光度测量数据5类似，未结合的组分信号明显，而在对应复合物的质量范围内的峰则不明显得多。

实验采用快速稀释微流控系统，在质光度测量前立即将混合物稀释至所需浓度。该方法能够检测到在手动稀释步骤中可能已解离的额外低亲和力复合物。为了达到与手动稀释实验相同的2000倍稀释倍数，将IgG浓度为2 µM、FcRn浓度为20 µM的1:10样品混合物以0.5 µL/min的流速注入微流控芯片，同时以1 mL/min的流速通入PBS缓冲液（pH 5.0）。为确保测量时蛋白质未发生降解，将IgG（2 µM）和FcRn（20 µM）在孵育120分钟后，通过微流控系统在流动条件下进行测量。单独的对照实验显示无蛋白质降解现象（补充图1）

对于经过快速稀释的样品，可再次观察到对应于FcRn单体（53 kDa）、FcRn二聚体（97 kDa）以及IgG单体（148 kDa）的峰。此外，还在196 kDa和251 kDa处清晰地观察到两个额外的峰，分别对应于具有1:1和1:2化学计量比的IgG-FcRn复合物（图7）。这两种复合物的预期分子量分别为200 kDa和250 kDa。本研究中所用质量光度计的质量测量偏差在±5%以内14（1:1复合物的偏差为2%，1:2复合物的偏差为0.4%）。

仅在快速稀释样品中检测到这些复合物的存在，这与以下观点一致：在较低浓度下，这些复合物倾向于解离，其解离速率相对于手动稀释过程较快，但相对于微流控系统实现的快速稀释过程较慢15。

figure-results-1
图 1：微流控技术与质量光度法的结合。（A、B）本实验方案中使用的微流控装置，分别从（A）正面和（B）顶部观察。清洗液置于位置 1–3，样品和校准品置于位置 4–6。所有溶液均连接至 m-开关，并与“小型”流速单元传感器相连。（C）整个系统的概览。计算机（左上方）连接至微流控装置（图中位于缓冲液管和样品管旁）以及质量光度计（右下方），微流控芯片即位于质量光度计内。小流量监测器（FRMS）监测样品管路中的流速，而大流量监测器（FRML）监测缓冲液流速。样品管路和缓冲液管路连接至微流控芯片上的通道，并将芯片置于质量光度计内部。（D）每张芯片包含三个通道。FRMS 连接至样品入口，FRML 连接至缓冲液入口。混合区域用于实现样品的快速稀释，观测区域则用于进行质量光度测量。出口处由额外的流量传感器监测，以确保芯片无泄漏。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：微流控控制系统软件。 使用该软件可设定并监测微流控系统的流速、压力通道以及多通阀（m-switch）的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：识别油中气泡的存在。 数据采集软件中的示例显示了清晰且完整的焦环（左图）以及“断裂”的环状结构，后者表明浸油中存在空气气泡（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：样本浓度的代表性示例，分别显示分子着陆事件过少、理想或过多的情况。 在微流控芯片观测区域表面着陆的分子，在质量光度图像的比值视图中会呈现为暗斑。理想情况下，目标浓度应在数据采集期间产生适中的着陆事件密度（中图）。若着陆事件密度过低（上图，“过少”），则无法对质量光度数据进行准确的统计分析。若密度过高（下图，“过多”），着陆的分子将在空间上重叠，导致数据质量下降。这些图像使用质量光度计的数据采集软件获取。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：质谱光度法数据分析软件的界面截图。 此处可加载从数据采集软件导出的 .mp 文件以进行数据分析。可基于处理后的数据生成图表。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：本实验的质量对比度校准截图。 所用校准物为β-淀粉酶，已知其可形成三种物种：单体（56 kDa）、二聚体（112 kDa）和四聚体（224 kDa）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-7
图7质谱直方图显示，仅在样品快速稀释后才可观察到复合物的形成。 质量直方图及相应的最佳拟合高斯分布曲线显示了经手动稀释（橙色）或通过微流控HC系统快速稀释（蓝色）后含IgG和FcRn样品的测量结果。质量标签表明，高斯曲线拟合所得的平均值与快速稀释后测得的质量直方图一致。手动稀释后，观察到对应于FcRn单体（52 kDa，手动稀释测得值）和IgG单体（152 kDa）的峰。快速稀释后，除FcRn和IgG单体外，还清晰观察到对应于FcRn二聚体以及具有1:1和1:2化学计量比的IgG-FcRn复合物的峰。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充数据图1：对照样品在快速稀释后的质谱光度法测量结果显示无蛋白质降解。（A）仅含FcRn样品的质量直方图及最佳拟合高斯分布。快速稀释前的初始样品浓度为20 µM，流速设定为0.5 µL/min。可观察到对应于FcRn单体（53 kDa）和FcRn二聚体（97 kDa）的质量峰。（B）仅含IgG（Herceptin）样品的质量直方图及最佳拟合高斯分布。快速稀释前的初始样品浓度为2 µM，流速设定为1 µL/min。仅观察到一个对应于IgG单体（155 kDa）的质量峰。请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方案提供了一种检测和定量低亲和力蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法结合使用质量光度计与快速稀释微流控系统。质量光度法是一种无标记的生物分析工具，可可靠地测量溶液中分子量在30 kDa至6 MDa范围内的生物大分子的分子质量16。由于质量光度法是一种单分子技术，逐个分析样品，因此通常仅适用于浓度范围在100 pM至100 nM之间的样品。当样品浓度高于此范围时，分子在玻璃表面的着落位置会发生空间重叠，导致数据质量下降；而低于此范围时，获得的数据量过少，难以进行可靠的分析7。这一限制带来的重要影响是，蛋白质相互作用的研究将被局限于那些在该浓度范围内能够形成结合态与未结合态共存混合物的体系。

本文详细介绍了一种利用快速稀释微流控系统逐步扩展适用于质量光度法检测的样品浓度范围的实验方案。通过在微流控芯片上对样品进行稀释，并在50毫秒内将其流经检测器的观测窗口，该系统可在相互作用平衡发生偏移之前捕获未稀释样品中存在的复合物。在单次测量过程中，样品被持续输送至检测器。在此条件下，即使对于亲和力较低的相互作用——其解离常数KD处于微摩尔级别、解离速率快至1 s-1——在测量时仍有95%的复合物保持完整。

可按如下方式计算：对于一个正向速率为 kf、逆向速率为 kb 的反应 figure-discussion-1，

figure-discussion-2

平衡时，三种物质的浓度（A，B，以及该复合物 AB）保持不变，因此 figure-discussion-3 和 figure-discussion-4. 在保守假设下，扰动（本例中为稀释）可能导致复合物解离，但正向（结合）反应不发生，因此该术语 kf [A] [B] 可视为可忽略不计，因此可进行如下简化：

figure-discussion-5

积分得到扰动平衡后某时刻复合物浓度的如下表达式：

figure-discussion-6

复合物在指定时间仍保持结合的比例 t 因此，平衡被扰动后：

figure-discussion-7

在 50 ms 时，对于一个 kb ≈ 1 s-1 的反应，结合比例为 0.95，即 95%11,12。

本研究及先前研究5均采用质量光度法来研究IgG单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）与FcRn可溶性结构域的结合。已有文献报道，这两种结合伙伴在酸性pH条件下以纳摩尔亲和力结合17。在pH 5.0条件下，利用质量光度法对形成的复合物的丰度进行定性评估，并通过额外的微流控系统快速稀释样品。该实验流程根据先前报道的结果5针对特定的蛋白质-蛋白质相互作用进行了优化。相同的流程也可用于研究其他相互作用，前提是使用者对所研究体系具有先验知识，或已优化实验条件，例如缓冲液的选择、初始蛋白质浓度、预期的化学计量比以及为使相互作用达到平衡所需的孵育时间。

当手动稀释IgG-FcRn混合物时，即使已知这些蛋白质之间存在相互作用5，也难以检测到IgG-FcRn复合物的存在。本文表明，采用快速稀释方法可显著增加此类复合物的生成量。对于同一样品，使用快速稀释时，1:1 FcRn-IgG复合物和2:1 FcRn-IgG复合物均能被清晰观察到。这些在复合物形成上的差异表明，研究生物分子相互作用系统时覆盖广泛浓度范围的重要性。

此外，这些结果还表明，利用微流控技术结合单分子分析来捕获弱相互作用是十分简便的，从而填补了该方法领域的一项重要空白。快速稀释微流控技术与质光测定法的结合具有显著优势，这主要得益于质光测定法作为一种分析技术所具备的优点：质光测定无需标记、样品前处理步骤极少，且测量在溶液中直接进行。对于本实验方案而言，质光测定法的另一关键优势在于其能够区分并定量所有形成的组分（只要它们具有不同的分子质量） >30 kDa）。这与表面等离子共振（SPR）等技术形成对比，后者可测量结合与解离速率，但难以直接提供化学计量比信息。8.

对于本方案以及更广泛的质谱光度法实验，有几点注意事项可供参考。首先，最终蛋白质浓度应在质谱光度法可检测的范围之内（100 pM–100 nM）。起始孵育浓度也应处于微流控系统的浓度范围之内（最高达90 µM），并应高于相互作用的实际KD值10。推荐的起始条件是相互作用的两种组分以µM浓度进行1:1的等比例混合。随后可调整比例为1:2、1:5，或如本实验中的情况，1:10。若对蛋白质相互作用尚无先验信息，用户需优化实验条件，建议每种组分均从高浓度（推荐20 µM）开始，以判断组分间的亲和力是否处于本方法所支持的浓度范围内（即是否形成复合物）。优化过程还可能包括选择其他缓冲条件以促进相互作用，或对其中一种相互作用组分进行滴定，以确定合适的混合比例。在确定上述条件后，可进一步优化浓度和流速，以获得适合研究和方法的最佳条件，例如降低浓度以实现更佳的峰分辨效果。

其次，为成功重复本实验，应尽量减少杂质。已知会影响质量光度测量的常见杂质来源包括：纯化后残留的其他蛋白质或细胞碎片、未过滤的缓冲液、形成胶束的去污剂（如果浓度过高）、以及含有高浓度盐、甘油或其他成分的缓冲液。如上述方案中所述，应去除微流控系统中的气泡。气泡可能在管路系统中形成，也可能因样品表面张力较高而易于产生泡沫时形成。气泡还可能出现在浸油中，可通过焦环进行检测（图3）。如果无法通过方案中描述的步骤去除气泡，另一种解决方案是使用干燥器和真空泵对样品进行脱气处理，使样品在减压条件下放置数分钟。不建议对高浓度蛋白质溶液进行涡旋振荡或剧烈摇动，因为这些操作可能促进气泡的形成。

尽管本文演示了对一种特定蛋白质-蛋白质相互作用的测量，但该方案无需重大修改即可应用于其他蛋白质-蛋白质相互作用体系。该方案未来的进一步发展方向是利用测量数据计算所鉴定复合物的KD值，正如在质量光度法的其他研究中已有描述5,7。尽管先前的研究使用了涉及手动稀释和较强相互作用实验的数据，但只要对微流控装置进行进一步改进（例如提高流量传感器的准确性和泵的稳定性），该分析原理即可直接应用于本方案中。

除了蛋白质-蛋白质相互作用之外，质量光度法与快速稀释微流控技术相结合的方法可能具有更广泛的应用前景。质量光度法可用于评估样品纯度、聚集状态和均一性18,19；研究蛋白质寡聚化20、大分子组装21或聚合反应22；以及应用于其他领域。质量光度法的分析范围也不局限于蛋白质；已有研究利用该技术探究核酸与蛋白质之间的相互作用23、病毒颗粒24以及纳米颗粒25。因此，本实验方案描述了一种质量光度法与微流控系统联用的重要应用——它能够直接在单个分子和复合物水平上测量弱蛋白质-蛋白质相互作用。当前应用的价值较高，因为它为简便表征以往难以研究的相互作用提供了可能，且在多个关键治疗领域具有重要意义。这种联用方法还可作为浓度高达数十微摩尔样品更广泛研究的基础。

披露

Myndert Claasen 和 Zornitsa Kofinova 是 Refeyn 公司的员工，该公司生产本文所使用的质量光度计和微流控系统。Weston Struwe 是 Refeyn 公司的股东和顾问。

致谢

W.S. 获得英国研究与创新署未来领袖奖学金 [MR/V02213X/1] 的支持。手稿的文字和图表由 Refeyn 公司科学传播团队成员（Panagiota Paganopoulou、Neus Torres Tamarit 和 Catherine Lichten）提供支持完成。我们还感谢 Camille Hetez、Sofia Ferreira 和 Matthias Langhorst 提供的宝贵反馈意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-丙醇（异丙醇）VWR International LLC20880.320
数据采集软件RefeynAcquireMP (v2022 R1)
数据分析软件RefeynDiscoverMP (v2022 R1)
FCRN，His标签SigmaSRP0624
Herceptin (IgG) Cambridge BioscienceHY-P9907-1mg
质光仪RefeynTwoMP
微流控盒RefeynMassFluidix HC system
微流控芯片RefeynMassFluidix HC chip
微流控控制软件FluigentOxyGEN
磷酸盐缓冲液（PBS），1× 超纯VWR International LLCK812
氢氧化钠（NaOH） SigmaS2770
β-淀粉酶，来源于甘薯SigmaA8781

参考文献

  1. Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
  2. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  3. Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386(2022).
  4. Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
  5. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  6. Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784(2021).
  7. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575(2020).
  8. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  9. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  10. Refeyn Ltd. MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. , https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023).
  11. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  12. Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264(2020).
  13. Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39(2015).
  14. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation. , https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022).
  15. Lai, S. -H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  16. Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
  17. Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
  18. Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288(2022).
  19. Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
  20. Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
  21. Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
  22. Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935(2022).
  23. Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521(2021).
  24. Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
  25. Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

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通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成
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