方法文章

开发和优化用于潜在靶点识别和药物发现的人肝细胞癌患者来源类器官模型

DOI：

10.3791/65785

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2023年8月18日

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1Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Center for Cancer Research and Translational Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, 3Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, 4Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Cancer Hospital, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们对肝细胞癌（HCC）类器官形成的现有方案进行了全面概述和改进，涵盖了类器官培养的所有阶段。该系统可作为识别潜在治疗靶点和评估候选药物有效性的宝贵模型。

摘要

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肝细胞癌 （HCC） 是全球范围内高度流行和致命的肿瘤，其发现较晚且缺乏有效的特异性治疗药物，因此需要对其发病机制和治疗进行进一步研究。类器官是一种与天然肿瘤组织非常相似且可以在 体外培养的新型模型，近年来引起了人们的极大兴趣，有许多关于肝癌类器官模型开发的报道。在这项研究中，我们成功地优化了程序并建立了培养方案，能够形成具有稳定传代和培养条件的更大尺寸的HCC类器官。本文全面概述了该过程的每个步骤，涵盖了HCC组织解离、类器官接种、培养、传代、冷冻保存和复苏的整个过程，并在本文中提供了详细的注意事项。这些类器官表现出与原始HCC组织的遗传相似性，可用于各种应用，包括识别肿瘤的潜在治疗靶点和随后的药物开发。

引言

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肝细胞癌 （HCC） 是一种普遍存在且广泛多样化的肿瘤1，在医学界引起了相当大的关注。HCC中谱系可塑性和大量异质性的存在表明，来自不同患者的肿瘤细胞，甚至同一患者体内的不同病变都可能表现出不同的分子和表型特征，从而为创新治疗方法的发展带来了巨大的障碍2,3,4,5 .因此，迫切需要加强对肝癌耐药性的生物学特性和机制的理解，以便为制定更有效的治疗策略提供信息。

近几十年来，研究人员致力于开发体外模型，以研究HCC 3,4。尽管取得了一些进步，但局限性仍然存在。这些模型包含一系列技术，例如细胞系、原代细胞和患者来源的异种移植物 （PDX） 的利用。细胞系可作为从HCC患者获得的肿瘤细胞长期培养的体外模型，具有方便和易于扩增的优点。原代细胞模型涉及从患者肿瘤组织中直接分离和培养原代肿瘤细胞，从而提供与患者本身非常相似的生物学特征的表示。PDX模型需要将患者肿瘤组织移植到小鼠体内，目的是更忠实地模拟肿瘤的生长和反应。这些模型在HC....

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方案

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在广州医科大学附属肿瘤医院和研究所对各自患者进行人体活检组织，并征得患者知情同意书。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息 ，请参阅材料表 。

1. 从手术样本中建立患者来源的 HCC 类器官

注:HCC类器官的建立包括组织解离、类器官接种、培养、传代、冷冻保存和复苏等各个阶段。组织解离过程需要持续2小时，而将类器官接种到平板上大约需要40分钟。在此之后，使用HCC分离培养基对第一代HCC类器官进行10-14天的培养期。一旦达到令人满意的密度，就会进行类器官传代，这需要1小时。然后使用HCC扩增培养基维持类器官的后续培养物7-10天，这可能因类器官的生长速率和条件而异。

  1. 组织解离
    1. 准备用品和材料
      1. 从手术前未接受过任何局部或全身治疗的患者中收集 1-2 cm3 的 HCC 组织。手术切除后，将组织保持在组织保存溶液（表1）中的4°C直至处理。
        注意:高质量的新鲜组织样本对于成功建立类器官至关重要。及时处理样本很重要，最好在手术切除后 1-4 小时内处理，以保持组织活力。使用无菌材料和试剂在无菌环境中执行所有后续程序。
      2. 在37°C的培养箱中预热超低附着表面细胞培养板（24孔）1小时。 将冷冻的基底膜提取物（BME）在....

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结果

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在实施上述程序后，通常可以在 3 天内观察到 HCC 类器官球体的出现（图 1）。图1A，B显示了已建立的HCC类器官，该类器官在建立的最初一天迅速发育出具有圆润边缘和可渗透性胞质溶胶的致密球状体。在HCC类器官的生长过程中，使用不同浓度的BME对类器官的生长速率有不同的影响。我们在 10%、30%、50% 和 100% 的 BME 中培养两种患者来源的 HCC 类器官，在 HCC 扩增培养基中培养 12 天（表 1），发现 BME 在 30% 和 50% 时是完整的，类器官大小接近，在这些 BME 浓度下直径最大。在10%的BME中，BME是最碎片化的，类器官生长的空间狭窄，直径最小。在100%BME时，BME是最完整的，但类器官的直径在中间。因此，建议在HCC类器官培养物中将BME的浓度控制在30-50%（图2）。增殖的HCC类器官可以按照规定的方案有效繁殖，在培养三代后，每个培养物的大小.......

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讨论

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患者衍生类器官模型的一个显着好处在于它们能够忠实地复制肿瘤的生物学特征，包括组织结构和基因组景观。这些模型表现出非凡的准确性，并有效地反映了肿瘤的异质性和进展，即使在长时间的培养中也是如此6,8,9。通过利用这种改进的类器官培养方案，我们有效地建立了患者来源的 HCC 类器官模型，促进了体外的持续生长，以及根据实验目的冷冻保存和随后复苏类器官的能力。与先前的方案相比，这些类器官表现出更高的生长速率，并且能够在培养中达到更大的尺寸。随后，我们将成熟的类器官置于源自预先筛选的潜在致癌靶点的抗体偶联药物中，从而获得了与体内PDX动物模型一致的显着治疗结果10,11。

本研究的目的是改进先前 HCC 类器官建立方案的缺点，从而在稳定的传代和培养条件下形成.......

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披露

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作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

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本研究得到了国家自然科学基金（82122048;82003773;82203380）和广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515011416）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[Leu15]-胃泌素 I 人默克G9145
1.5 mL 微管默克AXYMCT150LC
A8301（TGF &β; 抑制剂）Tocris Bioscience2939
B27 补充剂 （503），不含维生素 AThermo Fisher Scientific12587010
B-27 补充剂 （503），无血清Thermo Fisher Scientific
BMP7Peprotech120-03P
细胞过滤器尺寸 100 μm默克CLS352360
CHIR99021默克SML1046
胶原蛋白酶 D默克11088858001
康宁 Costar 超低浓度默克CLS3473
Costar 24 孔透明平底超低附件多孔板，独立包装，无菌康宁3473
Costar 6 孔透明平底超低附件多孔板，独立包装，无菌康宁3471
Cultrex 类器官收获溶液R&D SYSTEMS3700-100-01类器官收获溶液
Cultrex 低生长因子 BME，2 型 PathClear （BME）Merck3533-005-02
DAPTMerckD5942
地塞米松MerckD4902
DMSOMerckC6164
DNaseIMerckDN25
Dulbecco 的改良 Eagle 培养基/Ham 的 F-12Thermo Fisher Scientific12634028Advanced DMEM/F-12
Earle's 平衡盐溶液 （EBSS）Thermo Fisher Scientific24010043
镊子N/AN/A
ForskolinTocris Bioscience1099
GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific35050061
HEPES，1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B 荧光电动显微镜徕卡N/A
N2 补充剂 （1003）Thermo Fisher Scientific17502048
N-乙酰半胱氨酸MerckA0737-5MG
烟酰胺MerckN0636
Nunc 15 mL 锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fisher Scientific339651
Nunc 50 mL 锥形无菌聚丙烯ThermoFisher Scientific339653
青霉素/链霉素 （10,000 U/mL）Fisher Scientific15140122
重组人 EGFPeprotechAF-100-15
重组人 FGF10Peprotech100-26
重组人 FGF19Peprotech100-32
重组人 HGFPeprotech100-39
重组人 NogginPeprotech120-10C
Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐MerckY0503
R-spodin1 条件培养基（Broutier 等人）N/A细胞系分泌
手术剪刀N/AN/A
HCC 患者身上取出的肿瘤手术标本医科大学附属肿瘤医院和研究所N/A
TNFαPeprotech315-01A
TrypLE Express 酶 （1x），无酚红Fisher Scientific12604013胰蛋白酶替代品
Wnt-3a 条件培养基（Broutier 等人）N/A细胞系的分泌
17504044 离心管 Thermo 从 广州Thermo

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
  2. Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology.

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