需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人肝细胞癌患者来源类器官模型的建立与优化用于潜在靶点识别及药物发现

3.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65785

⸱

2023年8月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Center for Cancer Research and Translational Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, 3Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, 4Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Cancer Hospital, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们对现有的肝细胞癌（HCC）类器官培养方案进行了全面概述和优化，涵盖了类器官培养的各个阶段。该体系可作为识别潜在治疗靶点和评估药物候选物有效性的有力模型。

摘要

肝细胞癌（HCC）是一种在全球范围内高发且致死率极高的肿瘤，其发现常较晚期且缺乏有效的特异性治疗药物，因此迫切需要进一步研究其发病机制和治疗方法。类器官是一种新型模型，可高度模拟原发性肿瘤组织，并能够进行体外培养 体外近年来，肝癌类器官模型的开发备受关注。本研究成功优化了实验流程，建立了一套稳定的培养方案，可实现较大尺寸的肝细胞癌（HCC）类器官的稳定传代与培养。本文系统阐述了该方案的各个步骤，涵盖HCC组织解离、类器官接种、培养、传代、冷冻保存及复苏的完整流程，并提供了详细的操作注意事项。这些类器官在遗传学特征上与原始HCC组织高度相似，可用于多种应用，包括肿瘤潜在治疗靶点的鉴定及后续药物开发。

引言

肝细胞癌（HCC）是一种常见且具有高度异质性的肿瘤1，在医学界受到广泛关注。HCC中存在谱系可塑性和显著的异质性，提示来自不同患者甚至同一患者不同病灶的肿瘤细胞可能表现出不同的分子和表型特征，从而为新型治疗策略的开发带来巨大挑战2,3,4,5。因此，迫切需要更深入地理解HCC的生物学特性及其耐药机制，以指导更有效治疗策略的制定。

近几十年来，研究人员一直致力于开发 体外 用于研究肝细胞癌的模型3,4尽管取得了一些进展，局限性仍然存在。这些模型涵盖了一系列技术，例如细胞系、原代细胞和患者来源的异种移植（PDX）的利用。细胞系可作为 体外 用于长期培养肝细胞癌患者来源肿瘤细胞的模型，具有操作便捷和易于扩增的优势。原代细胞模型通过直接分离并培养患者肿瘤组织中的原代肿瘤细胞，能够较好地反映患者自身肿瘤的生物学特性。PDX模型则是将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，旨在更真实地模拟肿瘤的生长特征及治疗反应。这些模型在肝细胞癌研究中发挥了重要作用，但仍存在一些局限性，包括细胞系的异质性以及无法完全重现 体内 条件。此外，长期 体外 培养可能导致细胞原有特性和功能的退化，从而难以准确反映肝细胞癌的生物学特性。此外，PDX模型的使用既耗时又昂贵3.

为解决这些局限性并更准确地模拟肝细胞癌（HCC）的生理特性，类器官技术已被引入作为一种极具前景的研究平台，有望突破既往的限制。类器官是三维细胞培养模型 体外，能够模拟真实器官的结构和功能。然而，在肝细胞癌（HCC）研究中，建立类器官模型仍面临若干挑战，包括HCC类器官构建步骤的描述不够详尽、缺乏涵盖HCC类器官构建全过程的完整操作方案，以及培养出的类器官通常体积较小等问题6,7,8鉴于培养类器官通常尺寸有限，我们致力于通过制定一项全面的方案来应对这些挑战，该方案涵盖肝细胞癌类器官构建的全过程6本方案包括组织解离、类器官接种、培养、传代、冷冻保存及复苏。通过优化操作步骤并改进培养基成分，我们成功建立了可长期稳定生长并能持续传代的肝细胞癌（HCC）类器官模型。6,8在后续部分中，将全面阐述肝细胞癌类器官构建过程中涉及的操作细节及相关因素。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

人源活检组织取自广州医科大学附属肿瘤医院及研究所的相应患者，并已获得患者的知情同意。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 从手术样本建立患者来源的肝细胞癌类器官

注意：肝细胞癌类器官的建立包含多个阶段，即组织解离、类器官接种、培养、传代、冷冻保存和复苏。组织解离过程需要约2小时，而将类器官接种至培养板大约需要40分钟。随后，使用肝细胞癌分离培养基对肝细胞癌类器官进行初始培养，培养周期为10–14天。当达到理想的密度后，进行类器官传代，该步骤耗时约1小时。之后，使用肝细胞癌扩增培养基对类器官进行后续培养，培养时间为7–10天，具体时长可能因类器官的生长速率和状态而有所差异。

  1. 组织解离
    1. 耗材与材料准备
      1. 收集未经术前局部或全身治疗的肝细胞癌（HCC）患者手术切除的新鲜组织，体积为 1–2 cm3。手术切除后，将组织置于组织保存液中（表 1），并在 4 °C 条件下保存直至处理。
        注意：高质量的新鲜组织样本是成功建立类器官的关键。应尽快处理样本，理想情况下在手术切除后 1–4 小时内完成，以维持组织活性。所有后续操作均需在无菌环境中使用无菌材料和试剂进行。
      2. 将超低吸附表面的细胞培养板（24 孔）在 37 °C 培养箱中预热 1 小时。将冷冻的基底膜提取物（BME）在 4 °C 条件下过夜解冻，直至使用前。
        注意：为确保 BME 完全解冻，必须将其置于冰上至少 3 小时。BME 的完全融化对于后续类器官培养的成功至关重要。
      3. 使用前，确保消化液（表 1）已预热至 37 °C。
        注意：应在无菌环境中新鲜配制消化液，并立即使用。
    2. 组织处理流程
      1. 在超净工作台中，使用手术剪将肿瘤组织在培养皿上剪切成小块（0.5–1 mm3）。将剪碎的组织转移至 15 mL 圆底离心管中，并加入 5–10 mL 基础培养基（表 1）。
        注意：基础培养基（表 1）可在 4 °C 条件下保存最多 1 个月。
      2. 使用差压移液器尽可能洗去血液，并静置 1–2 分钟以去除部分上清液，包括血细胞和漂浮的脂肪凝块。重复该步骤两次。
      3. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，小心去除上清液。向剪碎的组织中加入 5 mL 预热的消化液（表 1）。
      4. 将离心管置于 37 °C 条件下旋转进行消化。
      5. 初始消化 30 分钟后，在显微镜下观察是否存在细小的细胞团。每 5–10 分钟检查一次，避免过度消化。
        注意：组织消化所需时间取决于组织的大小和类型。组织消化时间不应超过 90 分钟。过度消化的组织在显微镜下表现为大量单个细胞。适当的消化程度表现为大多数为细胞团，呈葡萄串样外观。
      6. 加入冷的基础培养基（表 1）终止消化，并通过 100 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 管中。加入冷的基础培养基至总体积为 50 mL。
      7. 在 8 °C 条件下以 2 × g 离心 10 分钟。小心去除上清液，并通过加入另外 50 mL 冷的基础培养基（表 1）重悬沉淀。重复该步骤两次。
        注意：低速离心可使小的细胞团沉淀，而血细胞和细胞碎片仍悬浮于上清液中；重复该过程数次以获得相对纯净的组织细胞团。
  2. 类器官接种
    1. 第二次洗涤后，尽可能去除上清液，并将所需数量的细胞（每 24 孔板孔 1,000–5,000 个细胞）重悬于适量的 BME 中用于接种。
      注意：使用前应始终将 BME 保持在 4 °C。
    2. 加入 BME，并通过在 Advanced DMEM/F-12 培养基中轻轻吹打使小的细胞团完全悬浮。控制 BME 的终浓度在 30% 至 50% 之间。
    3. 在 24 孔培养板中央接种含有细胞团的 50 µL BME 液滴。
      注意：应尽可能避免液滴扩散至孔壁。低吸附板的孔壁并非处于低吸附状态，液滴与孔壁接触会导致贴壁，不利于后续培养。
    4. 将加样后的培养板置于 37 °C 条件下静置 20 分钟使其凝固。孵育结束后，向每孔加入 500 µL 预热的培养基（表 1），并在 37 °C 细胞培养箱中继续培养。
  3. 类器官培养
    1. 每 2–3 天更换一次培养基（表 1）。培养初期，使用 HCC 分离培养基（表 1）培养 HCC 类器官，持续 2 周。
    2. 使用 HCC 分离培养基培养 2 周后，更换为 HCC 类器官扩增培养基（表 1）（可在 4 °C 条件下保存最多 2 周）。
    3. 每 3 天更换一次培养基。
    4. 使用 HCC 扩增培养基培养 7–10 天后，当类器官达到适当密度或大小时，可根据需要进行实验干预、传代或冻存。
  4. 类器官传代
    1. 耗材与材料准备
      1. 将超低吸附表面的细胞培养板（24 孔）在 37 °C 培养箱中预热 1 小时。将冷冻的 BME 在 4 °C 条件下过夜解冻，直至使用前。
      2. 将类器官收获液和胰蛋白酶替代物在 37 °C 预热 30 分钟。
    2. 传代流程
      1. 从培养孔中移除培养基后，将类器官悬液转移至 15 mL 离心管中。
      2. 根据 BME 体积（每 50 µL BME 加入 500 µL 类器官收获液），使用 1,000 µL 移液器刮取并上下吹打。
        注意：整个过程中应避免产生气泡，以防类器官损失，因为气泡的出现表明移液压力过高。
      3. 在室温下孵育 30 分钟。
      4. 使用 1,000 µL 移液器轻轻吸除 BME，并观察其是否完全溶解。每 10 分钟观察一次，直至显微镜下可见清晰的类器官细胞团，然后在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，并尽可能去除上清液。
        注意：此阶段可将类器官冻存保存。
      5. 进行类器官酶解时，加入 1–5 mL 胰蛋白酶替代物（根据类器官数量），在 37 °C 孵育 2 分钟。在显微镜下观察酶解程度，判断类器官是否已解离为含 2–10 个细胞的小细胞团；若未达到，继续酶解。
        注意：过度消化会导致类器官细胞团裂解为单个细胞，降低其活性并延长后续培养时间。
      6. 加入适量的冷基础培养基（表 1）终止消化。
      7. 在 8 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，尽可能去除上清液。
      8. 将所需数量的类器官（每 24 孔板孔 1,000–5,000 个类器官）重悬于适量基质中用于接种。后续操作步骤同第 1.2 节。
        注意：接种密度应根据类器官的生长速率和大小进行优化。
      9. 根据类器官生长密度，每 10 天以 1:3 或 1:4 的比例进行传代。
  5. 类器官冻存与复苏
    1. 类器官冻存
      1. 准备冻存管，每管冻存来自 24 孔板两个孔的类器官。
      2. 按照第 1.4.2.1 至 1.4.2.4 步骤进行类器官传代操作，获得不含 BME 的类器官，并通过向 24 孔板中每孔加入 500 µL 类器官冻存液，轻轻重悬类器官。
        ​注意：根据类器官的生长状态和大小，建议在培养至第三代以内进行冻存。
      3. 将悬液转移至冻存管中，放入程序降温盒中于 -80 °C 冷冻。在 -80 °C 梯度降温至少 24 小时后，转移至液氮中长期保存。
    2. 类器官复苏
      1. 将冻存管置于 37 °C 水浴中孵育，当仅剩少量冰块时停止孵育。
      2. 在 8 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，彻底去除上清液。
      3. 后续操作参照第 1.2 和 1.3 节进行。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在实施上述步骤后，通常可在3天内观察到肝细胞癌类器官球体的形成。图1). 图1A，B 展示已建立的肝细胞癌（HCC）类器官，其在建立的第一天即迅速形成具有圆润边缘和通透性胞质的致密球状结构。在HCC类器官的培养过程中，不同浓度的BME对类器官的生长速率产生不同影响。我们将两种患者来源的HCC类器官在HCC扩增培养基中，分别置于10%、30%、50%和100%浓度的BME中培养12天。表1) 并发现，在30%和50% BME条件下，BME结构保持完整，类器官大小相近，且在此BME浓度下直径最大。在10% BME条件下，BME碎片化最严重，类器官生长空间狭窄，直径最小。在100% BME条件下，BME结构最为完整，但类器官直径处于中等水平。因此，建议在肝细胞癌（HCC）类器官培养中将BME浓度控制在30–50%图2）。增殖中的肝细胞癌类器官可依据既定方案有效传代扩增，体积可达到超过 500 µm ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

患者来源的类器官模型的一个显著优势在于其能够忠实地再现肿瘤的生物学特性，包括组织结构和基因组特征。这些模型表现出极高的准确性，能够有效模拟肿瘤的异质性和进展过程，即使在长期培养过程中亦能保持这一特性6,8,9通过采用这一优化的类器官培养方案，我们成功建立了患者来源的肝细胞癌类器官模型，实现了持续生长 体外，以及根据实验需求对类器官进行冷冻保存和后续复苏的能力。与先前的方案相比，这些类器官表现出更优的生长速率，并能在培养中达到更大的尺寸。随后，我们将已建立的类器官暴露于基于预筛选潜在致癌靶点的抗体偶联药物中，获得了显著的治疗效果，且结果与 体内 PDX 动物模型10,11.

本研究旨在改进既往肝细胞癌（HCC）类器官建立方案中的不足，从而在稳定的传...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（82122048；82003773；82203380）和广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515011416）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[Leu15]-胃泌素 I 人源MerckG9145
1.5 mL 微量离心管MerckAXYMCT150LC
A8301（TGFβ 抑制剂）Tocris Bioscience2939
B27 添加剂（503），不含维生素 AThermo Fisher Scientific12587010
B-27 添加剂（503），无血清Thermo Fisher Scientific17504044
BMP7Peprotech120-03P
细胞滤筛，孔径 100 μmMerckCLS352360
CHIR99021MerckSML1046
胶原酶 DMerck11088858001
Corning Costar 超低吸附板MerckCLS3473
Costar 24 孔透明平底超低吸附多孔板，独立包装，无菌Corning3473
Costar 6 孔透明平底超低吸附多孔板，独立包装，无菌Corning3471
Cultrex 类器官收获溶液R&D SYSTEMS3700-100-01类器官收获溶液
Cultrex 低生长因子基底膜提取物，类型 2 PathClear（BME）Merck3533-005-02
DAPTMerckD5942
地塞米松MerckD4902
DMSOMerckC6164
DNaseIMerckDN25
杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 培养基Thermo Fisher Scientific12634028Advanced DMEM/F-12
Earle’s 平衡盐溶液（EBSS）Thermo Fisher Scientific24010043
镊子N/AN/A
佛司可林Tocris Bioscience1099
GlutaMAX 添加剂Thermo Fisher Scientific35050061
HEPES，1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B 荧光电动显微镜LeicaN/A
N2 添加剂（1003）Thermo Fisher Scientific17502048
N-乙酰半胱氨酸MerckA0737-5MG
烟酰胺MerckN0636
Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fisher Scientific339651
Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fisher Scientific339653
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122
重组人 EGFPeprotechAF-100-15
重组人 FGF10Peprotech100-26
重组人 FGF19Peprotech100-32
重组人 HGFPeprotech100-39
重组人 NogginPeprotech120-10C
Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐MerckY0503
R-spodin1 条件培养基(Broutier 等)N/A细胞系分泌物
手术剪刀N/AN/A
肝细胞癌患者手术切除的肿瘤标本广州医科大学附属肿瘤医院暨肿瘤研究所N/A
TNFαPeprotech315-01A
TrypLE Express 酶（1x），无酚红Thermo Fisher Scientific12604013胰蛋白酶替代物
Wnt-3a 条件培养基(Broutier 等)N/A细胞系分泌物

参考文献

  1. Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
  2. Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).
  3. Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
  4. Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146(2020).
  5. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
  6. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  7. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  8. Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
  9. Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
  10. Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
  11. Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282(2021).
  12. Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921(2022).
  13. Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36(2022).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

患者来源类器官类器官培养组织解离类器官接种类器官传代类器官冻存治疗靶点鉴定肿瘤球体
人肝细胞癌患者来源类器官模型的建立与优化用于潜在靶点识别及药物发现
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。