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方法文章

探究胰岛β细胞中线粒体自噬流的互补方法

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DOI：

10.3791/65789

⸱

2023年9月15日

 ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

本文内容

摘要

本方案概述了两种用于定量分析胰腺β细胞有丝分裂的实验方法：第一种是结合使用可穿透细胞的线粒体特异性染料，第二种是利用基因编码的有丝分裂报告系统。这两种技术互为补充，可根据具体需求灵活选用，从而在定量研究线粒体质量控制方面实现灵活性与精确性。

摘要

线粒体自噬是一种质量控制机制，对于维持线粒体最佳功能至关重要。β细胞中功能失调的线粒体自噬会导致胰岛素释放不足。目前对线粒体自噬进行高级定量评估通常需要使用遗传报告系统。已在线粒体自噬检测中优化了mt-Keima小鼠模型，该模型表达一种靶向线粒体的pH敏感型双激发比率探针，可通过流式细胞术对线粒体自噬进行定量。通过计算酸性与中性条件下mt-Keima波长发射信号的比值，可稳健地量化线粒体自噬水平。然而，在使用复杂遗传小鼠模型或转染困难的细胞（如原代人胰岛）时，应用遗传性线粒体自噬报告系统可能面临挑战。本实验方案描述了一种基于染料的新型互补方法，利用MtPhagy染料在原代胰岛中定量β细胞的线粒体自噬。MtPhagy是一种pH敏感、可穿透细胞膜的染料，能够富集于线粒体中，并在线粒体进入低pH环境（如线粒体自噬过程中的溶酶体）时增强其荧光强度。通过将MtPhagy染料与选择性标记β细胞的锌离子（Zn2+）指示剂Fluozin-3-AM，以及用于评估线粒体膜电位的四甲基罗丹明乙酯（TMRE）联合使用，可借助流式细胞术特异性地定量β细胞中的线粒体自噬通量。这两种方法高度互补，可在多种β细胞模型中灵活且精确地评估线粒体质量控制过程。

引言

胰腺β细胞能够产生并分泌胰岛素以满足机体代谢需求，β细胞功能障碍会导致1型和2型糖尿病中高血糖的发生及糖尿病的发病。β细胞通过线粒体能量代谢及其代谢产物将葡萄糖代谢与胰岛素分泌相偶联，这一过程依赖于功能性线粒体质量的储备1,2,3。为了维持β细胞的最佳功能，β细胞依赖线粒体质量控制机制来清除衰老或受损的线粒体，从而保持功能性线粒体质量4。选择性线粒体自噬，即线粒体自噬（mitophagy），是线粒体质量控制通路中的关键组成部分。

活细胞中线粒体自噬的评估通常依赖于线粒体自噬过程中发生的线粒体pH变化。线粒体内部呈轻微碱性，健康线粒体通常位于pH中性的细胞质中。在线粒体自噬过程中，受损或功能障碍的线粒体会被选择性地包裹进自噬体，并最终在酸性溶酶体中被清除。5. 多个 体内 转基因线粒体自噬报告小鼠模型，例如 mt-Keima6，mitoQC7，以及 CMMR8，以及可转染的线粒体自噬探针，例如 Cox8-EGFP-mCherry 质粒9利用这种pH变化可对线粒体自噬进行定量评估。通过流式细胞术检测表达mt-Keima pH敏感型双激发比率探针的转基因小鼠，已优化用于胰岛及β细胞中线粒体自噬的评估10,11酸性与中性mt-Keima波长发射的比值（酸性561 nm与中性480 nm激发的发射比值）可用于可靠地定量线粒体自噬6,12.

本方案描述了一种优化的方法，用于评估从mt-Keima转基因小鼠中分离得到的原代胰岛和β细胞中的线粒体自噬流10,11。尽管mt-Keima是一种高度敏感的探针，但它需要复杂的动物繁育方案，或对细胞进行转染，而当与其他遗传模型或原代人胰岛联合使用时，这些操作往往具有挑战性。此外，识别中性和酸性细胞群体需要使用多个荧光激光器和检测器，这可能会限制与其他荧光报告系统的联合应用。

为了克服这些挑战，本方案还描述了一种互补的、基于单荧光通道染料的方法，可用于从分离的小鼠胰岛β细胞中稳健地检测线粒体自噬。该方法被称为MtPhagy法，利用三种细胞膜通透性染料的组合，同时实现对β细胞的筛选、对正在进行线粒体自噬的细胞群体进行定量，以及对线粒体膜电位（MMP或Δψm）的评估。

第一种染料是Fluozin-3-AM，一种可穿透细胞膜的Zn2+荧光探针，其激发/发射波长为494/516 nm13。小鼠胰岛由多种功能不同的细胞组成异质性群体，包括α细胞、β细胞、δ细胞和PP细胞。其中β细胞约占小鼠胰岛细胞总数的80%，因其胰岛素颗粒中含有高浓度的Zn2+，可与其他胰岛细胞类型相区分14,15，因此可通过鉴定Fluozin-3-AMhigh细胞群来识别β细胞。本实验方案中还使用了MtPhagy染料，这是一种pH敏感性染料，通过化学键共价结合于线粒体上，本身荧光信号较弱16。当诱导线粒体自噬时，受损的线粒体被包裹进入酸性溶酶体，MtPhagy染料在低pH环境中荧光强度增强（激发/发射波长为561/570-700 nm）。

此外，四甲基罗丹明乙酯（TMRE）可用于评估线粒体膜电位（MMP）。TMRE是一种可穿透细胞膜的带正电荷染料（激发/发射波长：552/575 nm），健康的线粒体因其膜电位维持相对负电荷，能够富集该染料17。受损或功能异常的线粒体会丧失其膜电位，导致富集TMRE的能力下降。联合使用这些染料，可通过流式细胞术鉴定发生线粒体自噬的β细胞，其特征为FluozinhighMtPhagyhighTMRElow群体。由于线粒体自噬是一个动态而非静态的过程，本实验方案通过使用缬氨霉素（一种K+-离子载体）来优化线粒体自噬流的检测，该试剂可诱导MMP的耗散，进而引发线粒体自噬18。通过比较不同样本组在有无缬氨霉素条件下线粒体自噬水平的差异，可评估各组间的线粒体自噬流变化。

当前方法基于染料的特性，使其可推广应用于人胰岛及其他难以转染的细胞类型，避免了像mt-Keima方案那样需要复杂的动物繁育策略。本方案的总体目标是通过两种独立的基于流式细胞术的方法，在单细胞水平上定量检测β细胞中的线粒体自噬。综上所述，本方案描述了两种强大且互补的方法，可在定量研究线粒体质量控制过程中同时实现精确性与灵活性。

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方案

本方案中涉及的动物实验已通过密歇根大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本研究使用了20周龄的雄性C57BL/6J小鼠，这些小鼠分别接受了为期15周的普通脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD）。

1. 评估线粒体自噬 通过基于染料的 MtPhagy 方法（方法 1）

  1. 小鼠胰岛的制备与处理
    1. 进行胰岛培养并用缬氨霉素处理，步骤如下。
      1. 从常规脂肪饮食（RFD）或高脂饮食（HFD，60 kcal% 脂肪）中分离胰岛19) 小鼠，采用先前描述的方法2,10.
      2. 将胰岛样本在37℃培养过夜 °在补充有100单位/毫升抗真菌-抗生素、50单位/毫升青霉素-链霉素、1 mM丙酮酸钠、10 mM HEPES和10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养（参见 材料表）。该培养基将被称为 "胰岛培养基".
      3. 使用移液器将每种条件下100个胰岛转移至含有2 mL胰岛培养基的6 cm培养皿中。
        注意：本实验方案所用条件：（1）未染色对照：未染色的RFD胰岛；（2）仅DAPI染色对照：用DAPI染色的RFD胰岛；（3）仅Fluozin-3-AM染色对照：用Fluozin-3-AM染色的RFD胰岛；（4）仅MtPhagy染色对照：用MtPhagy染色的RFD胰岛；（5）仅TMRE染色对照：用TMRE染色的RFD胰岛；（6）RFD未处理组：用MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM和DAPI染色的RFD胰岛；（7）缬氨霉素处理的RFD胰岛：经缬氨霉素处理并用MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM和DAPI染色的RFD胰岛；（8）HFD未处理组：用MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM和DAPI染色的HFD胰岛；（9）缬氨霉素处理的HFD胰岛：经缬氨霉素处理并用MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM和DAPI染色的HFD胰岛。
      4. 对于条件（7）和（9）（见上述注释）暴露于缬氨霉素的情况，加入 2 µ250 nLΜ 缬氨霉素储备液（参见 材料表)在培养皿中作用于胰岛3小时以诱导线粒体自噬。
    2. 进行单细胞解离。
      1. 在缬氨霉素处理3小时后，使用移液器从每种条件下分别挑取100个胰岛至不同的微量离心管中。
      2. 离心胰岛，350 × g g 10分钟内1分钟 °C，并用移液器弃去上清液。
      3. 用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤样品 2 次，每次均进行离心步骤（350 × g） g1分钟，10秒 °C) 每次洗涤之间。每次洗涤后用移液器弃去上清液。
      4. 为了将胰岛解离为单个细胞，加入500 µ0.05% 胰蛋白酶（预热至 37 ℃）的 L °C) 加入一个样品的微量离心管中，以防止胰岛过度消化。反复吹打直至胰岛明显分散。
      5. 立即加入 1 mL 预热的胰岛培养基以中和胰蛋白酶。每个样本依次重复进行胰蛋白酶消化及中和步骤。
      6. 500 x g 离心样品 g 5 分钟，10 °C. 用移液器吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
        注意：经缬氨霉素处理的样品，其沉淀物较为脆弱。
      7. 用不含酚红的 RPMI 培养基洗涤样本 2 次，培养基中添加 100 单位/毫升抗真菌-抗生素、50 单位/毫升青霉素-链霉素、1 毫摩尔/升丙酮酸钠、10 毫摩尔/升 HEPES 和 10% 牛血清白蛋白（BSA）。该培养基将简称为 "胰岛流式培养基"。包括离心步骤（350 × g1分钟，10 °C) 每次洗涤之间。每次洗涤后用移液器弃去上清液。
    3. 使用 MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM 和 DAPI 对细胞进行染色，以制备流式细胞术样品。
      1. 将胰岛样本重悬于 500 µL 岛状流式培养基
      2. 加入 0.25 µ升（L）的100倍 µM MtPhagy 储液（参见 材料表）加入到接受 MtPhagy 染料的试管中（条件 4、6、7、8 和 9，步骤 1.1.1 注释）。
      3. 加入 0.25 µ升（L）的100倍 µM TMRE 储液（参见 材料表) 加入含有 TMRE 染料的试管中（条件 5、6、7、8 和 9）。
      4. 加入 0.25 µ1 mM Fluozin-3-AM 储存液的 L（参见 材料表) 加入含有 Fluozin-3-AM 染料的试管（条件 3、6、7、8 和 9）。
      5. 以低速涡旋振荡管子5秒以混匀。
      6. 将微量离心管用铝箔包裹以避光，并在37 °30分钟内保持在C条件下。孵育至一半时，以低速涡旋振荡管子5-10秒以混匀。
      7. 孵育后，将样品在 350 x g 10分钟内1分钟 °C. 使用移液器弃去上清液。
      8. 将样品重悬于 500 µL 离体胰岛流式培养基。加入 0.2 µg/mL DAPI（参见 材料表）至条件2、6、7、8和9。
      9. 350 × g 离心样品 g 10下1分钟 °C. 使用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 500 µL 岛状流式培养基。
      10. 将样品置于冰上。
  2. 流式细胞术
    1. 启动仪器（参见 材料表).
      注意：任何具备适当滤光片的流式细胞仪均可使用。本研究中使用的滤光片如下：（1）VL1 用于 DAPI：激发/发射波长 - 405 nm/440 nm（50 nm）；（2）BL1 用于 Fluozin-3-AM：激发/发射波长 - 488 nm/530 nm（30 nm）；（3）BL2 用于 MtPhagy 染料：激发/发射波长 - 488 nm/590 nm（40 nm）；（4）YL1 用于 TMRE：激发/发射波长 - 561 nm/585 nm（16 nm）。
    2. 调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的电压，以确保细胞群位于散点图的中心。本实验方案中，FSC 使用 120 V，SSC 使用 260 V，以确保细胞均匀分布在 FSC-A 范围内。 与. SSC-A 图（图1A).
    3. 为排除非单细胞，于FSC-H上添加矩形门控 与FSC-W 随后是 SSC-H 与. SSC-W（图1B，C).
    4. 调节DAPI的电压和补偿以筛选活细胞 β细胞。根据未染色的RFD样本设置所用每种荧光染料的荧光门控（图1D- F).
      注意：各通道使用的电压：（1）VL1：320–360 V；（2）BL1：300–340 V；（3）BL2：260–300 V；（4）YL1：300–340 V。
    5. 确定门控后，每份样本收集 10,000 个事件。
      注意：利用此门控方法，在基础条件下及经缬氨霉素诱导后，分别评估了RFD和HFD胰岛中的线粒体自噬水平（图2).
    6. 将数据保存为 FCS 文件以供分析。

2. 使用基因编码的 mt-Keima 报告系统评估线粒体自噬（方法 2）

  1. 小鼠胰岛制备与单细胞解离
    1. 按照以下步骤进行胰岛培养及缬氨霉素处理。
      1. 从野生型（WT）和 mt-Keima/+（mt-Keima）小鼠中分离胰岛6。本方法中使用的是20周龄雄性野生型或 mt-Keima/+ 小鼠，喂养普通饲料（RFD）。
      2. 将胰岛样品在胰岛培养基中于37 °C过夜培养。
      3. 使用移液器将每种条件下100个胰岛转移至含2 mL胰岛培养基的6 cm培养皿中。
        注：本方案使用的条件包括：（1）未染色对照：未染色的野生型胰岛；（2）仅DAPI对照：用DAPI染色的野生型胰岛；（3）仅Fluozin-3-AM对照：用Fluozin-3-AM染色的野生型胰岛；（4）仅mt-Keima对照：未染色的mt-Keima/+胰岛；（5）未处理组：用Fluozin-3-AM和DAPI染色的mt-Keima/+胰岛；（6）缬氨霉素处理组：经缬氨霉素处理并用Fluozin-3-AM和DAPI染色的mt-Keima/+胰岛。
      4. 对于第（6）组缬氨霉素处理条件，在培养皿中向胰岛加入2 µL浓度为250 nM的缬氨霉素储备液，作用3小时以诱导线粒体自噬。
    2. 进行单细胞解离。
      1. 按照步骤1.1.2所述方法进行单细胞解离操作。
    3. 用Fluozin-3-AM和DAPI对细胞染色。
      1. 将胰岛样品重悬于500 µL胰岛流式培养基中。
      2. 向需添加Fluozin-3-AM染料的管中（条件3、5和6）加入0.25 µL浓度为1 mM的Fluozin-3-AM储备液。
      3. 在37 °C孵育细胞，并按步骤1.1.3.5–1.3.10所述进行DAPI处理。
  2. 流式细胞术
    1. 启动仪器。任何配备适当滤光片的流式细胞仪均可使用。
      注：本研究中使用的滤光片如下：（1）VL1用于DAPI：激发/发射波长 - 405 nm/440 nm（50 nm）；（2）BL1用于Fluozin-3-AM：激发/发射波长 - 488 nm/530 nm（30 nm）；（3）VL3用于mt-Keima中性信号：激发/发射波长 - 405 nm/603 nm（48 nm）；（4）YL2用于mt-Keima酸性信号：激发/发射波长 - 561 nm/620 nm（15 nm）。
    2. 调节FSC和SSC电压，并按照步骤1.2.2–1.2.3所述排除非单细胞事件（图3A–C）。
    3. 使用未染色及单阳对照样本（条件1–4）调节DAPI、Fluozin-3-AM和mt-Keima各通道的电压和补偿，确保荧光阳性细胞群与未染色细胞可区分。在完成各通道适当补偿后，设置DAPI阴性门和Fluozin-3-AM阳性门，以筛选活的β细胞（图3D–E）。
    4. 利用mt-Keima阳性样本（条件4）建立三角形设门策略，以识别酸性和中性细胞群（图3F）。
      注：各通道通常使用的电压范围为：（1）VL1：320–340 V；（2）BL2：260–280 V；（3）VL3：280–300 V；（4）YL2：280–300 V。
    5. 设门完成后，每样本采集10,000个事件。条件5和6的设门策略如图3A–G所示。
    6. 将数据保存为FCS文件用于后续分析。

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结果

通过基于染料的 MtPhagy 方法评估线粒体自噬
该基于染料的方法经过优化，可在无需遗传报告系统的情况下，利用 Fluozin-3-AM、TMRE 和 MtPhagy 染料以及 DAPI 排除死细胞，用于分析原代小鼠 β 细胞中的线粒体自噬流。通过将这些染料与缬氨霉素联用以诱导线粒体自噬，本方案概述了一种基于染料的方法，可选择性地测量原代小鼠 β 细胞中的线粒体自噬流18。在使用该 MtPhagy 方法获得的数据中，分析了来自普通脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD，60 kcal% 脂肪）喂养小鼠的胰岛中基础状态及缬氨霉素诱导的线粒体自噬，以评估代谢应激对线粒体自噬流的影响。为确定目标细胞群，使用未经处理的 RFD 胰岛进行设门。首先调整 FSC 和 SSC 电压，使细胞在 SSC-A vs. FSC-A 图中呈现均匀分布（图 1A）。为筛选单细胞，使用 FSC-H vs. FSC-W 和 SSC-H vs. SSC-W 图，排除...

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讨论

本方案描述了两种互补的方法，用于定量解离的原代小鼠胰岛中的线粒体自噬流。使用mt-Keima方法时，线粒体自噬的增加通过酸性（561 nm）与中性（405 nm）细胞比率的升高来定量；而在MtPhagy方法中，线粒体自噬流的增加则通过FluozinhighMtPhagyhighTMRElow细胞群的增多来定量。这些方法可实现对线粒体自噬流的快速、定量且β细胞特异性的评估。

这两种方法均为直接的实验手段。然而，本方案中的某些步骤对于获得高质量且可重复的结果至关重要。这些步骤包括：（1）对胰岛进行适当的解离，以获得单细胞悬液，同时解离条件需足够温和以确保胰岛的活性；（2）谨慎设置门控，以准确识别目标细胞群体；（3）利用软件工具对流式细胞术数据进行客观定量，以确保对线粒体自噬流的无偏评估。

在选择使用何种方法时，应考虑细胞类型以及所用遗传模型的性质。mt-Keima 方法无论是用于体内（in vivo）还是体外转染（in vitro...

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披露

SAS 已获得小野药品工业株式会社的资助，并担任诺和诺德公司的顾问。

致谢

E.L-D. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）（T32-AI007413 和 T32-AG000114）提供的支持。SAS 感谢青少年糖尿病研究基金会（JDRF）（COE-2019-861）、美国国立卫生研究院（NIH）（R01 DK135268、R01 DK108921、R01 DK135032、R01 DK136547、U01 DK127747）、退伍军人事务部（I01 BX004444）、Brehm 家族以及 Anthony 家族提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗生素-抗真菌素Life Technologies15240-062
Attune NxT 流式细胞仪Thermofisher ScientificA24858
二甲基亚砜Sigma-Aldrich317275
无脂肪酸热激BSA粉末EquitechBAH66
胎牛血清Gemini Bio900-108
Fluozin-3AM Thermofisher Scientific F24195将100 μg Fluozin-3AM粉末溶于51 μL DMSO和51 μL Pluronic F-127中，配制成1 mM储备液。 
Gibco RPMI 1640 培养基Fisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MtPhagy 染料DojindoMT02-10将5 μg MtPhagy粉末溶于50 μL DMSO中，配制成100 μM储备液。 
MtPhagy 染料DojindoMT02-10
青霉素-链霉素 (100x)Life Technologies15140-122实验方案中使用1x溶液，通过将原液用ddH2O按1:10稀释获得
磷酸盐缓冲液，10xFisher ScientificBP399-20实验方案中使用1x溶液，通过将原液用ddH2O按1:10稀释获得
丙酮酸钠 (100x)Life Technologies11360-070将5 μg MtPhagy粉末溶于50 μL DMSO中，配制成100 μM储备液。 
TMRE [四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐]AnaspecAS-88061将TMRE粉末溶于DMSO中，配制成100 μM储备液。
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红Thermofisher Scientific25300054
缬氨霉素SigmaV0627将缬氨霉素粉末溶于DMSO中，配制成250 nM储备液。

参考文献

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探究胰岛β细胞中线粒体自噬流的互补方法
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