研究胰腺β细胞线粒体自噬通量的互补方法

胰腺β细胞产生和分泌胰岛素以满足代谢需求，β细胞功能障碍是 1 型和 2 型糖尿病高血糖和糖尿病发病的原因。β细胞通过线粒体能量和代谢输出将葡萄糖代谢与胰岛素分泌结合，这取决于功能性线粒体质量的储备 ^1,2,3。为了保持最佳的β细胞功能，β细胞依靠线粒体质量控制机制来去除老化或受损的线粒体并保留功能性线粒体质量⁴。选择性线粒体自噬，也称为线粒体自噬，是线粒体质量控制途径的关键组成部分。

活细胞中线粒体自噬的评估通常依赖于线粒体自噬期间发生的线粒体 pH 值的变化。线粒体的 pH 值呈微碱性，健康的线粒体通常位于 pH 值中性的胞质溶胶中。在线粒体自噬过程中，受损或功能失调的线粒体被选择性地掺入自噬体中，并最终在酸性溶酶体中清除⁵.几种体内转基因线粒自噬报告小鼠模型，如 mt-Keima⁶、mitoQC⁷ 和 CMMR⁸，以及可转染的线粒自噬探针，如 Cox8-EGFP-mCherry 质粒⁹，利用这种 pH 变化来提供线粒自噬的定量评估。使用表达 mt-Keima pH 敏感双激发比率探针的转基因小鼠已通过流式细胞术^10,11 优化用于胰岛和β细胞的线粒体自噬评估。酸性与中性 mt-Keima 波长发射的比率（酸性 561 nm 与中性 480 nm 激发的比率）可用于稳健地量化线粒体自噬 ^6,12。

该协议描述了一种优化的方法来评估从mt-Keima转基因小鼠^10,11分离的原代胰岛和β细胞中的线粒体自噬通量。虽然 mt-Keima 是一种高度灵敏的探针，但它需要复杂的动物育种方案或细胞转染，这在与其他遗传模型或原代人类胰岛结合使用时通常具有挑战性。此外，使用多种荧光激光器和检测器来识别中性和酸性细胞群可能会限制其他荧光报告基因的组合使用。

为了克服这些挑战，该协议还描述了一种互补的，单荧光通道，基于染料的方法，用于从分离的小鼠胰岛中稳健检测β细胞中的线粒体自噬。这种方法被称为 MtPhagy 方法，它利用三种细胞渗透性染料的组合来选择β细胞，量化积极经历线粒体自噬的细胞群，并同时评估线粒体膜电位（MMP 或 Δψm）。

这些染料中的第一种是 Fluozin-3-AM，这是一种细胞渗透性 Zn²⁺ 指示剂，Ex/Em 为 494/516 nm¹³。小鼠胰岛由功能不同的细胞组成异质性细胞群，包括 α、β、δ 和 PP 细胞。β细胞约占小鼠胰岛细胞的 80%，由于其在胰岛素颗粒中的高 Zn²⁺ 浓度^14,15，因此可以与其他胰岛细胞类型区分开来，从而可以将β细胞鉴定为 Fluozin-3-AM^高细胞群。MtPhagy 染料是一种 pH 敏感染料，通过化学键固定在线粒体上并发出弱荧光，也用于该协议¹⁶。线粒体自噬诱导后，受损的线粒体被掺入酸性溶酶体中，MtPhagy 染料在低 pH 环境 （Ex/Em 561/570-700 nm） 内增加其荧光强度。

此外，四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 用于评估 MMP。TMRE 是一种细胞渗透性带正电荷的染料 （Ex/Em 552/575 nm），由于其膜电位¹⁷ 所支撑的相对负电荷，它被健康的线粒体隔离。受损或不健康的线粒体会耗散其膜电位，导致螯合 TMRE 的能力降低。将这些染料一起使用，通过流式细胞术可以将进行线粒体自噬的β细胞鉴定为 Fluozin^高MtPhagy^高TMRE^低 群体。由于线粒体自噬是一个动态而不是静态过程，因此该方案进行了优化，以使用缬氨霉素评估线粒体自噬通量，缬氨霉素是一种 K⁺ 离子载体，可在 MMP¹⁸ 消散后诱导线粒体自噬。在存在和不存在缬氨霉素的情况下比较线粒体自噬可以评估不同样品组的线粒体自噬通量。

与mt-Keima方案不同，当前方法的基于染料的性质使其可以外推到人类胰岛和其他难以转染的细胞类型，并避免了对复杂动物育种方案的需求。该协议的总体目标是通过两种独立的基于流式细胞术的方法在单细胞水平上量化β细胞中的线粒体自噬。综上所述，该协议描述了两种强大且互补的方法，它们允许在线粒体质量控制的定量研究中具有精确性和灵活性。

本协议中提出的动物研究已由密歇根大学机构动物护理和使用委员会审查和批准。本研究使用20周龄的雄性C57BL / 6J小鼠，采用15周的常规脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD）。

1. 通过基于染料的 MtPhagy 方法评估线粒体自噬（方法 1）

1. 小鼠胰岛的制备和处理
   1. 按照以下步骤进行胰岛培养和缬氨霉素暴露。
      1. 按照先前描述的方法^2,10，^从常规脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD，60kcal%脂肪¹⁹）小鼠中分离胰岛。
      2. 将胰岛样品在37°C下在补充有100单位/ mL抗真菌剂 - 抗生素，50单位/ mL青霉素 - 链霉素，1mM丙酮酸钠，10mM HEPES和10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中过夜（见 材料表）。这种培养基将被称为"胰岛培养基"。
      3. 使用移液管，将每种条件的 100 个胰岛选入 2 mL 胰岛培养基中的 6 cm 培养皿中。
         注:用于本方案的条件:（1）未染色对照:未染色的RFD胰岛;（2）仅DAPI对照:用DAPI染色的RFD胰岛;（3）仅Fluozin-3-AM对照:用Fluozin-3-AM染色的RFD胰岛;（4）仅MtPhagy对照:用MtPhagy染色的RFD胰岛;（5）仅TMRE对照:用TMRE染色的RFD胰岛;（6） 未经处理的 RFD:用 MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM 和 DAPI 染色的 RFD 胰岛;（7）缬氨霉素暴露的RFD胰岛:暴露于缬氨霉素并用MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM和DAPI染色的RFD胰岛;（8） 未经处理的 HFD:用 MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM 和 DAPI 染色的 HFD 胰岛;（9）缬氨霉素暴露于HFD胰岛:暴露于缬氨霉素并用MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM和DAPI染色的HFD胰岛。
      4. 对于暴露于缬氨霉素的条件（7）和（9）（见上面的注释），向培养皿中的胰岛中加入2μL250nΜ缬氨霉素原液（参见 材料表）3小时以诱导线粒体自噬。
   2. 进行单细胞解离。
      1. 缬氨霉素暴露3小时后，使用移液管从每种条件下将100个胰岛选入单独的微量离心管中。
      2. 在10°C下以350× g 离心胰岛1分钟，并使用移液管弃去上清液。
      3. 用1mL 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤样品2x，每次洗涤之间有离心步骤（350× g/1分钟，10°C）。每次洗涤后用移液管丢弃上清液。
      4. 为了将胰岛解离成单个细胞，将500μL0.05%胰蛋白酶（预热至37°C）加入一个样品的微量离心管中，以防止胰岛过度消化。反复上下移液，直到胰岛明显分散。
      5. 立即加入 1 mL 预热胰岛培养基以中和胰蛋白酶。对每个样品重复胰蛋白酶消化和中和，一次一个。
      6. 在10°C下以500× g 旋转样品5分钟。 用移液管除去上清液，注意不要干扰沉淀。
         注意:对于暴露于缬氨霉素的样品，沉淀将是脆弱的。
      7. 用补充有 100 单位/mL 抗真菌抗生素、50 单位/mL 青霉素-链霉素、1 mM 丙酮酸钠、10 mM HEPES 和 10% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 RPMI 培养基洗涤样品 2 次，不含酚红。这种介质将被称为"胰岛流动介质"。包括每次洗涤之间的脱水步骤（350 x g / 1分钟，10°C）。每次洗涤后用移液管丢弃上清液。
   3. 用 MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM 和 DAPI 对细胞进行染色，为流式细胞术做准备。
      1. 将胰岛样品重悬于500μL胰岛流培养基中。
      2. 向接受MtPhagy染料的试管中加入0.25μL的100μMtPhagy原液（参见 材料表）（条件4,6,7,8和9，步骤1.1.1的注意）。
      3. 向接受TMRE染料的试管中加入0.25μL的100μM TMRE原液（参见 材料表）（条件5、6、7、8和9）。
      4. 向接受Fluozin-3-AM染料（条件3、6、7、8和9）的试管中加入0.25μL的1mM Fluozin-3-AM原液（参见 材料表）。
      5. 低速涡旋管5秒混合。
      6. 将微量离心管包裹在铝箔中以避光，并在37°C下孵育30分钟。孵育中途，低速涡旋管5-10秒混合。
      7. 孵育后，在10°C下以350× g 离心样品1分钟。 使用移液管弃去上清液。
      8. 将样品重悬于 500 μL 胰岛流培养基中。将 0.2 μg/mL DAPI（参见材料表）添加到条件 2、6、7、8 和 9 中。
      9. 在10°C下以350× g 旋转样品1分钟。 使用移液管弃去上清液，并重悬于500μL胰岛流培养基中。
      10. 将样品放在冰上。
2. 流式细胞术
   1. 启动仪器（参见 材料表）。
      注意:任何带有适当过滤器的流式细胞仪都可以工作。本研究使用了以下滤光片:（1） DAPI 的 VL1:激发/发射 - 405 nm/440 nm （50 nm）;（2） 氟锌-3-AM 的 BL1:激发/发射 - 488 nm/530 nm （30 nm）;（3） 用于 MtPhagy 染料的 BL2:激发/发射 - 488 nm/590 nm （40 nm）;（4） TMRE 的 YL1:激发/发射 - 561 nm/585 nm （16 nm）。
   2. 调整前向 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 的电压，以确保细胞群位于散点图的中心。对于该协议，FSC 使用的电压为 120 V，SSC 使用的电压为 260 V，以确保电池均匀地落在 FSC-A 与 FSC-A 内。SSC-A图（图1A）。
   3. 要排除非单细胞，请在 FSC-H vs.FSC-W，其次是SSC-H与。SSC-W（图1B，C）。
   4. 调整DAPI的电压和补偿，以滤波带电β电池。根据未染色的RFD样品为所用的每个荧光团设置荧光门（图1D-F）。
      注意: 每个通道使用的电压:（1） VL1:320-360 V;（2） BL1:300-340 V;（3） BL2:260-300 V;（4） YL1:300-340 V。
   5. 建立门后，为每个样本收集 10,000 个事件。
      注意:利用这种门控方法，在RFD和HFD胰岛中评估基础条件下和缬氨霉素诱导后的线粒体自噬水平（图2）。
   6. 将数据另存为 FCS 文件以供分析。

2. 使用基因编码的 mt-Keima 报告基因评估线粒体自噬（方法 2）

1. 小鼠胰岛制备和单细胞解离
   1. 按照以下步骤进行胰岛培养和缬氨霉素暴露。
      1. 从野生型 （WT） 和 mt-Keima/+ （mt-Keima） 小鼠中分离胰岛⁶.在该方法中，使用20周龄的雄性WT或mt-Keima/+喂养的RFD小鼠。
      2. 培养胰岛样品在胰岛培养基中在37°C下过夜。
      3. 使用移液管，将每种条件的 100 个胰岛选入含有 2 mL 胰岛培养基的 6 cm 培养皿中。
         注意:用于该方案的条件:（1）未染色的对照:未染色的WT胰岛;（2）仅DAPI对照:用DAPI染色的WT胰岛;（3）仅Fluozin-3-AM对照:用Fluozin-3-AM染色的WT胰岛;（4）仅mt-Keima对照:未染色的mt-Keima/+胰岛;（5）未经处理:用Fluozin-3-AM和DAPI染色的mt-Keima/+胰岛;（6）缬氨霉素:暴露于缬氨霉素并用Fluozin-3-AM和DAPI染色的mt-Keima/+胰岛。
      4. 对于具有缬氨霉素暴露的条件（6），在培养皿中向胰岛中加入2μL的250nM缬氨霉素原液3小时以诱导线粒体自噬。
   2. 进行单细胞解离。
      1. 执行单细胞解离步骤，如步骤1.1.2所述。
   3. 用 Fluozin-3-AM 和 DAPI 染色细胞。
      1. 将胰岛样品重悬于500μL胰岛流培养基中。
      2. 向接受 Fluozin-3-AM 染料（条件 3、5 和 6）的试管中加入 0.25 μL 的 1 mM Fluozin-3-AM 原液。
      3. 将细胞在37°C孵育并进行DAPI处理，如步骤1.1.3.5-1.3.10所述。
2. 流式细胞术
   1. 启动仪器。任何带有适当过滤器的流式细胞仪都可以工作。
      注:本研究使用了以下滤光片:（1） DAPI 的 VL1:激发/发射 - 405 nm/440 nm （50 nm）;（2） 氟锌-3-AM 的 BL1:激发/发射 - 488 nm/530 nm （30 nm）;（3） mt-Keima 中性的 VL3:激发/发射 - 405 nm/603 nm （48 nm）;（4） 用于 mt-Keima 酸的 YL2:激发/发射 - 561 nm/620 nm （15 nm）。
   2. 调整FSC和SSC电压并排除非单节电池，如步骤1.2.2-1.2.3（图3A-C）所述。
   3. 使用未染色和单阳性对照（条件 1-4）调整 DAPI、Fluozin-3-AM 和 mt-Keima 的电压和补偿，以确保荧光阳性细胞群可与未染色细胞区分开来。一旦对每个通道应用适当的补偿，设置DAPI负门和Fluozin-3-AM正门以过滤活β细胞（图3D-E）。
   4. 使用mt-Keima阳性样品（条件4）建立三角形门控方案，以识别酸性和中性细胞群（图3F）。
      注意: 每个通道通常使用的电压:（1） VL1:320-340 V;（2） BL2:260-280 V;（3） VL3:280-300 V;（4） YL2:280-300 V。
   5. 建立门后，为每个样本收集 10,000 个事件。条件 5 和 6 的门控方案如图 3A-G 所示。
   6. 将数据另存为 FCS 文件以供分析。

通过基于染料的 MtPhagy 方法评估线粒体自噬
这种基于染料的方法经过优化，无需遗传报告基因即可分析原代小鼠β细胞内的线粒体自噬通量，使用 Fluozin-3-AM、TMRE 和 MtPhagy 以及 DAPI 排除死细胞。通过将这些染料与缬氨霉素配对以诱导线粒体自噬，该方案概述了一种基于染料的方法，以选择性地测量原代小鼠β细胞中的线粒体自噬通量18。对于使用这种 MtPhagy 方法显示的数据，在从常规脂肪饮食 （RFD） 或高脂肪饮食 （HFD，60 kcal% 脂肪） 喂养的小鼠中分离的胰岛中分析了基础和缬氨霉素诱导的线粒体自噬，以评估代谢应激对线粒体自噬通量的影响。为了确定感兴趣的细胞群，使用未经处理的RFD胰岛对细胞进行门控。首先调整FSC和SSC电压，以在SSC-A与FSC-A图上实现电池的均匀分布（图1A）。要选择单细胞，FSC-H 与FSC-W 和 SSC-H 与使用SSC-W图，其中多重体被排除在外，因为它们与单个细胞相比具有更高的宽度信号值（图1B，C）。接下来，选择DAPI阴性细胞以排除死细胞20（图1D）。建立主门后，使用单染色对照建立Fluozin-3-AM、MtPhagy和TMRE的荧光门（图1E-G）以及多色荧光流式细胞术的补偿对照。

一旦建立了这些原级门和荧光门，线粒体自噬利用率高的β细胞被定义为使用没有缬氨霉素暴露的RFD在象限3（Q3）中的Fluozin高MtPhagy高TMRE低 群体（图1H）。使用这种门控策略，在RFD和HFD胰岛中表征了基础和缬氨霉素诱导的线粒体自噬水平（图2）。量化线粒体自噬通量，基础 与。使用以下比率比较缬氨霉素诱导的线粒体自噬水平:

使用该比率，对线粒体自噬通量进行量化，并在 RFD 与 RFD 中进行比较。HFD β细胞评估诱导肥胖和外周胰岛素抵抗后线粒体自噬的差异。RFD 中线粒体自噬通量的量化 与HFD样品如 图2E所示。这一结果强调了该测定法使用基于染料的简单方法定量β细胞中线粒体自噬的可行性。该方法也可用于人类胰岛、难以转染的细胞以及从复杂遗传模型中分离的胰岛，在这些模型中，与 mt-Keima 转基因模型的杂交会很麻烦。

使用基因编码的 mt-Keima 报告基因评估线粒体自噬
Mt-Keima 是一种双激发荧光蛋白，与 Cox8 定位序列融合，使其能够靶向线粒体内膜。mt-Keima 的双峰荧光特性使其能够将其激发光谱从中性 （405 nm） 切换到酸性 （561 nm） 波长，具体取决于细胞内隔室6 的 pH 值。这使得线粒体自噬的稳健比例荧光分析成为可能，其中酸性与中性性比的增加表明线粒体自噬诱导。在该方案中，Fluozin-3-AM也用于通过流式细胞术选择β细胞。在这些代表性研究中，使用从喂食 RFD 饮食10,11 的小鼠中分离的胰岛评估线粒体自噬通量。首先调整 FSC 和 SSC 电压，以实现 SSC-A 上电池的均匀分布。FSC-A图（图3A）。要选择单细胞，FSC-H 与FSC-W 和 SSC-H 与使用SSC-W图，其中多重体被排除在外，因为与单细胞相比，它们的宽度信号值更高（图3B，C）。DAPI和Fluozin-3-AM的电压和门控策略使用单染胰岛确定（图3D，E）。然后使用没有缬氨霉素暴露的mt-Keima阳性样品鉴定酸性和中性群体的三角门（图3F）。

一旦建立了这些初级和荧光门，就使用基础和缬氨霉素诱导的mt-Keima荧光变化来评估线粒体自噬通量（图3F，G）。量化线粒体自噬通量，基础线粒体自噬与。使用以下比率比较缬氨霉素诱导的水平:

使用该比率，对RFD细胞中的线粒体自噬通量进行定量。该结果的定量如 图3H所示。重要的是，这些结果与使用MtPhagy方法生成的RFD胰岛结果相当（图3H）。

图 1:MtPhagy 方法的门控方案。 （A） 流图，显示为所有细胞选择的门控方案。（B） 根据 FSC-H 与 FSC-H 选择单线的门控。FSC-W 和 （C） SSC-H 与SSC-W型。（D） DAPI阴性细胞的门控以排除死细胞。（E） Fluozin-3-AM高 细胞的门控，以选择用于 β 细胞。（F） MtPhagy 染料的门控方案，用于识别 MtPhagy高 细胞群和 MtPhagy低 细胞群。（G） TMRE的门控方案，用于识别TMRE高 细胞群和TMRE低 细胞群。（H） 使用未经处理的 RFD 胰岛建立象限门控方案，以将象限 3 （Q3） 中的 Fluozin高MtPhagy高TMRE低 细胞识别为经历线粒体自噬的 β 细胞。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:使用 MtPhagy 门控方案评估代谢应激后小鼠β细胞的线粒体自噬通量差异。 （A） 未处理的 RFD β 细胞、（B） 未处理的 HFD β细胞、（C） 缬氨霉素暴露的 RFD β 细胞和 （D） 缬氨霉素暴露的 HFD β 细胞的代表性流式细胞术图。（E） β细胞中线粒体自噬通量的定量，使用暴露于缬氨霉素的 MtPhagy高TMRE低 细胞与未暴露于缬氨霉素的 MtPhagy高TMRE低 细胞的比率计算，用于 RFD 和 HFD 样品。*p < 0.05 通过学生的非配对 t 检验。n = 3/组。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:mt-Keima 方法的门控方案以及两种方法之间的比较。 （A） 流图，显示要为所有单元选择的浇注方案。（B） 根据 FSC-H 与 FSC-H 选择单线的门控。FSC-W 和 （C） SSC-H 与SSC-W型。 （D） DAPI阴性细胞的门控以排除死细胞。（E） Fluozin-3-AM高 细胞的门控，以选择用于 β 细胞。（F） mt-Keima/+ 未处理细胞和 （G） mt-Keima/+ 缬氨霉素暴露细胞的代表性流式细胞术图。（H）来自RFD喂养的小鼠β细胞中线粒体自噬通量的定量，使用暴露于缬氨霉素的酸性/中性细胞与未暴露于缬氨霉素的酸性/中性细胞的比率计算，使用mt-Keima方法，并与MtPhagy方法进行比较（MtPhagy方案的数据最初显示在 图2E中）。n = 3/组。 请点击这里查看此图的较大版本.

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