探究胰岛β细胞中线粒体自噬流的互补方法

摘要

本方案概述了两种用于定量分析胰腺β细胞有丝分裂的实验方法：第一种是结合使用可穿透细胞的线粒体特异性染料，第二种是利用基因编码的有丝分裂报告系统。这两种技术互为补充，可根据具体需求灵活选用，从而在定量研究线粒体质量控制方面实现灵活性与精确性。

摘要

线粒体自噬是一种质量控制机制，对于维持线粒体最佳功能至关重要。β细胞中功能失调的线粒体自噬会导致胰岛素释放不足。目前对线粒体自噬进行高级定量评估通常需要使用遗传报告系统。已在线粒体自噬检测中优化了mt-Keima小鼠模型，该模型表达一种靶向线粒体的pH敏感型双激发比率探针，可通过流式细胞术对线粒体自噬进行定量。通过计算酸性与中性条件下mt-Keima波长发射信号的比值，可稳健地量化线粒体自噬水平。然而，在使用复杂遗传小鼠模型或转染困难的细胞（如原代人胰岛）时，应用遗传性线粒体自噬报告系统可能面临挑战。本实验方案描述了一种基于染料的新型互补方法，利用MtPhagy染料在原代胰岛中定量β细胞的线粒体自噬。MtPhagy是一种pH敏感、可穿透细胞膜的染料，能够富集于线粒体中，并在线粒体进入低pH环境（如线粒体自噬过程中的溶酶体）时增强其荧光强度。通过将MtPhagy染料与选择性标记β细胞的锌离子（Zn²⁺）指示剂Fluozin-3-AM，以及用于评估线粒体膜电位的四甲基罗丹明乙酯（TMRE）联合使用，可借助流式细胞术特异性地定量β细胞中的线粒体自噬通量。这两种方法高度互补，可在多种β细胞模型中灵活且精确地评估线粒体质量控制过程。

引言

胰腺β细胞能够产生并分泌胰岛素以满足机体代谢需求，β细胞功能障碍会导致1型和2型糖尿病中高血糖的发生及糖尿病的发病。β细胞通过线粒体能量代谢及其代谢产物将葡萄糖代谢与胰岛素分泌相偶联，这一过程依赖于功能性线粒体质量的储备^1,2,3。为了维持β细胞的最佳功能，β细胞依赖线粒体质量控制机制来清除衰老或受损的线粒体，从而保持功能性线粒体质量⁴。选择性线粒体自噬，即线粒体自噬（mitophagy），是线粒体质量控制通路中的关键组成部分。

活细胞中线粒体自噬的评估通常依赖于线粒体自噬过程中发生的线粒体pH变化。线粒体内部呈轻微碱性，健康线粒体通常位于pH中性的细胞质中。在线粒体自噬过程中，受损或功能障碍的线粒体会被选择性地包裹进自噬体，并最终在酸性溶酶体中被清除。⁵. 多个 体内 转基因线粒体自噬报告小鼠模型，例如 mt-Keima⁶，mitoQC⁷，以及 CMMR⁸，以及可转染的线粒体自噬探针，例如 Cox8-EGFP-mCherry 质粒

方案

本方案中涉及的动物实验已通过密歇根大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本研究使用了20周龄的雄性C57BL/6J小鼠，这些小鼠分别接受了为期15周的普通脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD）。

1. 评估线粒体自噬 通过基于染料的 MtPhagy 方法（方法 1）

1. 小鼠胰岛的制备与处理
   1. 进行胰岛培养并用缬氨霉素处理，步骤如下。
      1. 从常规脂肪饮食（RFD）或高脂饮食（HFD，60 kcal% 脂肪）中分离胰岛¹⁹) 小鼠，采用先前描述的方法^2,10.
      2. 将胰岛样本在37℃培养过夜 °在补充有100单位/毫升抗真菌-抗生素、50单位/毫升青霉素-链霉素、1 mM丙酮酸钠、10 mM HEPES和10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养（参见 材料表）。该培养基将被称为 "胰岛培养基".
      3. 使用移液器将每种条件下100个胰岛转移至含有2 mL胰岛培养基的6 cm培养皿中。
         注意：本实验方案所用条件：（1）未染色对照：未染色的RFD胰岛；（2....

结果

通过基于染料的 MtPhagy 方法评估线粒体自噬
该基于染料的方法经过优化，可在无需遗传报告系统的情况下，利用 Fluozin-3-AM、TMRE 和 MtPhagy 染料以及 DAPI 排除死细胞，用于分析原代小鼠 β 细胞中的线粒体自噬流。通过将这些染料与缬氨霉素联用以诱导线粒体自噬，本方案概述了一种基于染料的方法，可选择性地测量原代小鼠 β 细胞中的线粒体自噬流¹⁸。在使用该 MtPhagy 方法获得的数据中，分析了来自普通脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD，60 kcal% 脂肪）喂养小鼠的胰岛中基础状态及缬氨霉素诱导的线粒体自噬，以评估代谢应激对线粒体自噬流的影响。为确定目标细胞群，使用未经处理的 RFD 胰岛进行设门。首先调整 FSC 和 SSC 电压，使细胞在 SSC-A vs. FSC-A 图中呈现均匀分布（图 1A）。为筛选单细胞，使用 FSC-H vs. FSC-W 和 SSC-H vs. SSC-W 图，排除.......

讨论

本方案描述了两种互补的方法，用于定量解离的原代小鼠胰岛中的线粒体自噬流。使用mt-Keima方法时，线粒体自噬的增加通过酸性（561 nm）与中性（405 nm）细胞比率的升高来定量；而在MtPhagy方法中，线粒体自噬流的增加则通过Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^low细胞群的增多来定量。这些方法可实现对线粒体自噬流的快速、定量且β细胞特异性的评估。

这两种方法均为直接的实验手段。然而，本方案中的某些步骤对于获得高质量且可重复的结果至关重要。这些步骤包括：（1）对胰岛进行适当的解离，以获得单细胞悬液，同时解离条件需足够温和以确保胰岛的活性；（2）谨慎设置门控，以准确识别目标细胞群体；（3）利用软件工具对流式细胞术数据进行客观定量，以确保对线粒体自噬流的无偏评估。

在选择使用何种方法时，应考虑细胞类型以及所用遗传模型的性质。mt-Keima 方法无论是用于体内（in vivo）还是体外转染（in vitro.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素	Life Technologies	15240-062
Attune NxT 流式细胞仪	Thermofisher Scientific	A24858
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	317275
无脂肪酸热激BSA粉末	Equitech	BAH66
胎牛血清	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	将100 μg Fluozin-3AM粉末溶于51 μL DMSO和51 μL Pluronic F-127中，配制成1 mM储备液。
Gibco RPMI 1640 培养基	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy 染料	Dojindo	MT02-10	将5 μg MtPhagy粉末溶于50 μL DMSO中，配制成100 μM储备液。
MtPhagy 染料	Dojindo	MT02-10
青霉素-链霉素 (100x)	Life Technologies	15140-122	实验方案中使用1x溶液，通过将原液用ddH2O按1:10稀释获得
磷酸盐缓冲液，10x	Fisher Scientific	BP399-20	实验方案中使用1x溶液，通过将原液用ddH2O按1:10稀释获得
丙酮酸钠 (100x)	Life Technologies	11360-070	将5 μg MtPhagy粉末溶于50 μL DMSO中，配制成100 μM储备液。
TMRE [四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐]	Anaspec	AS-88061	将TMRE粉末溶于DMSO中，配制成100 μM储备液。
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Thermofisher Scientific	25300054
缬氨霉素	Sigma	V0627	将缬氨霉素粉末溶于DMSO中，配制成250 nM储备液。