小鼠咬肌冻结损伤建立口面部肌肉纤维化模型

Summary

该协议的目标是建立口面部肌肉纤维化模型。冻伤后小鼠咬肌和胫骨前肌组织学比较证实咬肌纤维化。该模型将有助于进一步研究口面部肌纤维化的潜在机制。

Abstract

口面部肌是骨骼肌组织的一个子集，具有独特的进化轨迹和发展起点。与体节衍生的肢体肌肉不同，口面部肌肉起源于分支弓，完全来自颅神经嵴。最近的一项研究表明，口面部肌肉群的再生也不同。然而，其底层的监管机制仍有待揭示。目前的骨骼肌再生模型主要集中在肢体和躯干肌肉上。在该方案中，使用干冰诱导小鼠咬肌和胫骨前肌的冻结损伤，以创建口面部肌肉纤维化模型。两种肌肉之间肌肉卫星细胞和纤维脂肪生成祖细胞的时间动力学不同，导致肌纤维再生受损和细胞外基质沉积过多。借助该模型，可以对口面部区域的肌肉再生进行更深入的研究，以开发针对口面部疾病患者的治疗方法。

Introduction

口面部肌肉在日常生理活动中至关重要，例如咀嚼、言语、呼吸和面部表情¹。然而，在先天性口面部畸形中，这些肌肉表现出萎缩和纤维化的改变，导致身体健康和社会认知受损².面部重建手术仍然是一线治疗方法，但高达 30-70% 的术后患者仍然患有肌肉流失和肌肉功能障碍 ^3,4 口面部肌肉再生的失败归因于内在因素，这些因素无法单独通过手术来纠正。

口面部肌肉的出现是一种进化上的新奇事物，伴随着复杂的脊椎动物头部和腔室心脏 ^5,6。与体节衍生的肢体对应物不同，口面部肌肉起源于分支弓⁷。这些系统发育和个体发育特征可能使它们易感于不同的再生行为⁸.据报道，当胫骨前肌 （TA） 在暴露于相同程度的损伤后完全再生时，咬肌 （MAS） 肌肉发生了严重的纤维化 ^1,9。然而，人们对再生的根本机制仍然知之甚少。

本研究建立了小鼠咬肌冻害模型，以利于研究口面部肌肉再生。我们选择损伤后 14 天作为评估纤维化表型的时间点，因为这是两块肌肉之间可检测到明显差异的最早时间点。损伤后 MAS 的完全再生至少需要 40 周¹.一致地，这项研究揭示了与受伤后 14 天 TA 的常规再生相比，MAS 冷冻损伤后胶原蛋白的显着沉积。借助该模型，可以进行肌肉萎缩和纤维化的进一步机制研究，这反过来将有助于开发潜在的治疗途径，以促进手术后口面部肌肉再生。

Protocol

本研究所有动物手术均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2020-114）审查通过。雄性C57BL / 6小鼠（5周龄）在湿度控制（53±2%）和温度控制（23±2°C）设施中饲养，并处于12小时光照/黑暗循环中。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1.冻伤

1. 麻醉:用异氟醚浸泡的棉球镇静小鼠，并以50mg / kg的剂量腹膜内注射tiletamine-zolazepam。术前和术后通过腹膜内注射美洛昔康以 1 mg/kg 的剂量提供镇痛。用兽药膏保护他们的眼睛。在整个过程中，将保持在38°C的加热垫放在手术帘下，为动物提供热支持。将小鼠侧放到手术台上后，用胶带固定小鼠（图1）。通过眼睑反射丧失、矫正反射和踏板退出反射来评估麻醉的充分性。
   注意:使用异氟烷麻醉时，一只手握住鼠标，另一只手握住异氟烷浸泡的棉球。确保棉球与动物保持一定距离，以避免不适和皮肤刺激。
2. 术前脱毛:用电动剃须刀剃掉小鼠小腿和面部的毛发，然后用棉签将脱毛膏涂抹在皮肤上，覆盖咬肌和胫骨前肌。1-2分钟后，用乙醇基手术擦拭物洗去糊状物（图2A 和 图2G）。手术部位通过三轮碘基磨砂膏和 75% 乙醇进行消毒。
   注意:仅使用电动剃须刀不足以脱毛，尤其是在咬肌区域。使用脱毛膏时，重要的是不要使用过多的糊剂。洗去糊状物时轻轻擦拭皮肤，以免灼伤皮肤。
3. 手术野暴露:在手术前用手术帘覆盖。对于 MAS 肌肉，首先沿下颌骨的下缘触诊。在距边缘 5 毫米处，沿着连接口腔连合物和耳屏的线做一个 7 毫米的切口（虚线表示 图 2B 中切口的位置）。
4. 对于 TA 肌，首先沿小腿触诊，以找到胫骨的前缘。用手术刀从皮肤向后方切2毫米，从膝盖开始，到脚踝结束（虚线表示 图2H中切口的位置）。对于每只小鼠，如果左侧的 MAS 和 TA 肌肉受伤，则使用对侧的另一块肌肉作为对照。
   注意:这种切口非常浅，以确保在切口过程中肌肉不会受伤。面部切口不应太靠近耳屏。否则，腮腺会暴露在外，导致在接下来的冷冻过程中出血过多。
5. 干冰冷冻:用预冷的镊子沿着MAS和TA肌肉的长轴握住一块干冰（分别为图2C 和 图2I）。将干冰直接放在肌肉表面 5 秒。确认肌肉在移除干冰后立即出现僵硬和淡白色（图2D 和 图2J），但在22-25秒内恢复正常颜色和质地，类似于相邻未受伤的肌肉（图2E 和 图2K）。
   注意: 盛放干冰的镊子应预冷，以避免干冰快速升华。在进行 5 秒的冷冻损伤和计算肌肉的 22-25 秒恢复时间时，必须使用计时器。任何恢复时间短于 22 秒或长于 25 秒的肌肉都应被放弃。这一步需要练习。
6. 伤口闭合:肌肉完全恢复后，用至少三根 7-0 缝合线闭合皮肤伤口（图 2F 和 图 2L）。
7. 复苏:缝合完成后，将小鼠放入带有热支撑的笼子中，并持续监测它们，直到所有矫正反射都恢复。

2.肌肉收集

1. 用过量的异氟烷对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位。收获两侧的 MAS 和 TA 肌肉进行组织学分析。
2. MAS肌肉解剖:切开小鼠面部的皮肤，切除腮腺，露出MAS肌肉的后部。解剖 MAS 从其前附着物一直到下颌骨上的后附着物。白色虚线区域表示MAS的暴露部分（图3A）。
   注意:MAS 肌肉由深层和浅层隔室组成，两者都紧密附着在下颌骨表面。在解剖过程中，请务必将剪刀按压在下颌骨上，以确保MAS完全隔离。注意通过颧骨和下颌骨之间的边界来区分颧下颌匝肌和 MAS。
3. TA肌肉解剖:切开从脚踝到膝盖的皮肤，切开筋膜，露出TA肌肉。使用显微解剖钳的尖端隔离 TA 的肌腱，并将其一直滑到膝盖，以切断附着在胫骨上的纤维。然后，切断脚踝上的肌腱（图3B）。
   注意:对于TA肌肉，小鼠脚踝周围有一些肌肉肌腱;需要练习才能辨别 TA 的肌腱，它是最大和最靠近胫骨的肌腱。
4. 预冷异戊烷:准备两个保温桶;在小桶中填充异戊烷，在大桶中填充液氮。在肌肉解剖前10分钟将小桶放入大桶内（图3D）。
5. 嵌入模具准备:为每个样品制作一个圆柱形锡箔模具，并用最佳切割温度 （OCT） 化合物填充它们。
6. 新鲜冷冻:将肌肉浸入OCT中，使其垂直于OCT化合物（图3C）。使用针架将模具转移到预冷的异戊烷中。等待 40 秒，使 OCT 变为白色和固体（图 3D）。
   注意: 确保模具的位置不要太低。否则，异戊烷将与OCT混合并损害肌肉冷冻过程。模具中OCT的水平应与肌肉样品的高度相当。避免过量的 OCT，以确保快速有效地冷冻。
7. 样品储存:将新鲜冷冻肌肉样品储存在标记清晰的 24 孔板中。立即切片样品或将其储存在-80°C以供长期使用。

3. 组织学分析

1. 使用低温恒温器从肌肉样品中切下 10 μm 厚的切片到表面处理过的载玻片上。
2. 将载玻片置于冰冷的丙酮中 20 分钟，然后在通风橱中风干 20 分钟。
3. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤载玻片3 x 5分钟。
   注意:从此步骤开始，载玻片保持在湿度室中以避免干燥。
4. 天狼星红染色
   1. 通过将 0.5 g 天狼星红粉末溶解在 500 mL 饱和苦味酸中来制备天狼星红工作溶液。
   2. 在室温下用Sirius Red工作溶液染色载玻片1小时。
   3. 用 0.5% 乙酸洗涤载玻片 2 x 5 分钟。
   4. 染色过程后，应先在95%乙醇中将样品脱水15秒，然后在无水乙醇中脱水1分钟。最后一步涉及用中性香脂安装载玻片。
5. 免疫组织学染色
   1. 在室温下用0.3%Triton在PBS中透化切片20分钟，然后用PBS洗涤。
   2. 对于 Pax7 染色，使用参比试剂盒随附的试剂封闭切片;对于层粘连蛋白和 Pdgfrα 染色，在室温下用 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 5% 驴血清在 PBS 中封闭 1 小时。
   3. 将切片与针对Pax7，层粘连蛋白和Pdgfrα的一抗在4°C下孵育过夜，然后用PBS洗涤3 x 5分钟。
   4. 在室温下用荧光染料偶联的二抗孵育切片 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 x 5 分钟。
   5. 在室温下与 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 孵育 3 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 x 5 分钟。
   6. 将安装介质放在切片上，将盖玻片放在顶部，然后使用指甲油密封盖玻片。

Results

HE 和 Sirius Red 染色（图 4 和补充图 S1）揭示了该冻伤模型中 TA 的完全肌肉再生。相比之下，MAS表现出肌纤维再生受损和细胞外基质沉积过多。完整 MAS 和 TA 肌肉的组织学如图 4A、B 所示，其中肌纤维对齐，纤维化区域仅出现在间质空间和不同束之间。虽然TA肌肉在受伤后14天与其完整对照组的肌肉结构基本相同（图4G-J），但MAS肌肉的结构受到严重干扰（图4C-F）。纤维化区域出现在 MAS 肌肉的前、中、后横截面的几乎所有肌肉纤维的位置（图 4C-F

Discussion

有多种损伤模型可用于研究骨骼肌再生，包括使用物理、化学和手术刺激 10,11,12,13,14,15,16。心脏毒素和氯化钡是启动肌肉再生的两种最广泛使用的化学物质^10,11，但它们会导致 ~7 dpi 的短暂纤维化和 3 周后的完全再生^12,14。局部注射甘油适用于模拟异位脂肪堆积的肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良症

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL 注射器	时峰医疗器械（中国四川成都）	1 ml 注射器	/
丙酮	Chron Chemicals	丙酮	/
粘附显微镜载玻片	Citotest Scientific	188105	/
动物脱毛剂	Phygene Scientific	PH1877	/
BSA（牛血清白蛋白）	Solarbio Life科学	A8010	/
DAPI	Solarbio Life Sciences	C0065	/
驴抗山羊 Alexa Fluor 488	Abcam	ab150129	1：200
驴血清	Solarbio Life Sciences	SL050	/
干冰	Sinrro Technology（中国四川成都）	米形干冰	/
IFKine 红驴抗兔	Abbkine科学公司	A24421	1：200
保温桶（大）	膳魔师	D600	/
保温桶（小）	Polar Ware	250B	/
异氟烷	RWD 生命科技公司（中国广东深圳）	R510-22	/
异戊烷	MACKLIN	M813375	/
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L9393	1：1000
液氮	Sinrro 技术（中国四川成都）	/	/
M.O.M 试剂盒	Vector Laboratories	BMK-2202
小鼠	大硕生物科技公司（中国 四川 成都市）	5周龄	/
封固剂	Solarbio Life Sciences	S2100	/
神经香脂	Solarbio Life Sciences	G8590	/
Pax7	发育研究杂交瘤细胞库	Pax7	1：5
Pdgfra	R&D systems	AF1062	1：40
Sirus Red 染色试剂盒	Solarbio Life Sciences	G1472	/
手术器械（镊子、剪刀、持针器、手术刀和缝合线）	卓悦医疗器械（中国江苏宿迁）	/	/
Tissue-tek OCT	Sakura	4583	/
Triton	上海赛恩生物科技	ABIO-Biofroxx-0006A	/
Zoletil	Virbac	Zoletil 50	/