闭合性头部轻度创伤损伤大鼠模型及其验证

摘要

本文介绍了一种闭合性轻度创伤性脑损伤（mTBI）大鼠模型，并对其进行了验证，结果显示该模型在急性期和亚急性期的行为学表现与人类轻度创伤性脑损伤具有显著相似性。

摘要

动物模型对于推进我们对轻度创伤性脑损伤（mTBI）的理解并指导临床研究至关重要。为了获得有意义的研究结果，建立一个稳定且可重复的动物模型是必不可少的。在本研究中，我们详细描述了一种闭合性头部mTBI模型，并采用Sprague-Dawley大鼠展示了一种具有代表性的验证方法，以确认建模效果。该模型通过将一个550 g的重物从100 cm高度直接坠落至置于可破坏表面的大鼠头部，随后进行180度翻转来实现。为评估损伤情况，大鼠在损伤后10分钟内接受了一系列神经行为学评估，包括意识丧失时间、首次寻行为时间、逃逸能力以及横梁平衡能力测试。在损伤后的急性和亚急性阶段，通过行为学测试评估运动协调能力（横梁任务）、焦虑水平（开放场测试）以及学习与记忆能力（Morris水迷宫测试）。该闭合性头部mTBI模型产生了稳定一致的损伤反应，死亡率极低，并能较好地模拟真实生活中的损伤情境。所采用的验证方法有效确认了模型的建立，确保了模型的稳定性与一致性。

引言

轻度创伤性脑损伤（mTBI），即脑震荡，是最常见的损伤类型，可导致多种短期和慢性症状¹。这些症状可能包括头晕、头痛、抑郁和快感缺失等，给mTBI患者带来显著的痛苦²。由于大多数mTBI由钝力创伤引起³，因此迫切需要建立能够准确模拟此类损伤的动物模型。这些模型对于深入理解损伤本身及其潜在机制至关重要，相较于人类研究，可提供一个变异性和异质性更小的受控环境。

目前已建立了多种成熟的啮齿类动物创伤性脑损伤（TBI）模型，包括液体冲击损伤（FPI）⁴、可控性皮层冲击损伤（CCI）⁵、落重损伤⁶、爆炸性创伤性脑损伤⁷等。然而，这些模型主要侧重于模拟中度至重度TBI的情况。相比之下，专门用于模拟轻度创伤性脑损伤（mTBI）的实验模型受到的关注相对较少，仍处于探索不足的状态⁸。因此，迫切需要建立一种稳定且可重复的动物模型，以准确反映mTBI的病理特征。此类模型将显著增进我们对mTBI相关的神经生物学和行为学后果的理解。

人们无法区分轻度创伤性脑损伤大鼠与正常大鼠之间的功能缺陷 通过 麻醉作用消退后的随意观察。因此，有必要实施特定的测试。在人类中，采用多种临床评估方法来评价患者^9,10,11同样，建立大鼠模型的成功也需要使用快速评估工具来确定其有效性。

本研究介绍了一种闭合性头部轻度创伤性脑损伤（mTBI）大鼠模型，该模型能够以接近人类病情的方式对轻度创伤性脑损伤进行研究。对该模型及其验证方法的详细描述，有助于全面理解研究轻度创伤性脑损伤所采用的实验方法。

方案

动物实验已获得中南大学动物护理与使用委员会的批准。所有研究均遵循实验动物福利与伦理原则进行。

1. 动物喂养与麻醉操作

1. 将体重280-320 g的雄性Sprague-Dawley大鼠分组饲养，维持12 h光照/12 h黑暗循环，自由摄食和饮水 随意摄取在大鼠适应6天后进行实验。
2. 在诱导箱中以每分钟0.6升气流速度的3%异氟烷麻醉大鼠，直至其对足部或尾部夹捏无反应。维持该气流速度30秒。
   注意：未使用止痛药物，因为它们会干扰大鼠在神经行为学评估中的反应。

2. 术前准备

1. 将一块硬度值为35D（海绵密度为35 kg/m³）、长宽与之相同但厚度为12 cm的海绵，放入一个无顶盖的亚克力盒（15 cm × 22 cm × 43 cm）中。
2. 裁剪一张厚度为20 µm的锡箔，并使用胶带将其固定在亚克力盒上，形成一个可破坏的表面，以支撑大鼠的重量。此外，在锡箔上标记一条长约10 cm的切割线，作为放置大鼠头部的指定位置。
3. 借助铁架台，将PVC管牢固固定。准备一个质量为550克、直径为18毫米的穿孔重物。将该重物通过鱼线悬挂在聚氯乙烯（PVC）管内距底部1米的高度处，并调节导管位置，使其位于锡箔上方3厘米处。
4. 准备一个头盔和一个枕头。使用一个直径为10 mm、厚度为3 mm的不锈钢圆盘制作头盔。准备一个楔形海绵枕头，置于大鼠头部下方，确保其方向与重力方向垂直。
   注：冲击装置的示意图见图1。头盔用于确定冲击位置并增强外力的分布效果；枕头则用于确保损伤的均匀性和稳定性。

3. 轻度创伤性脑损伤诱导

1. 迅速将麻醉后的大鼠俯卧于锡箔上。
   注意：诱导轻度创伤性脑损伤（mTBI）需要两名操作人员——一人负责准备，另一人负责核验。
2. 准备：将垫枕置于大鼠下方，确保其头部与锡箔纸平行。将头盔与大鼠双耳对齐并固定到位。
3. 核验：确认PVC管正对头盔上方。两名操作人员均确认装置正确后，进入下一步。
4. 诱导头部旋转：释放重物，使其下落并撞击大鼠头部，导致其跌落至海绵并完成180°旋转。
5. 将大鼠仰卧放置于清洁的笼中。

4. 假手术诱导

1. 以与先前mTBI诱导描述相同的方式处理大鼠，但不对其头部施加冲击。

5. 验证程序：急性神经行为学评估

注意：以下评估方法根据神经功能缺损评分⁹以及Flierl等人的方案¹⁰进行了修改。所有评估均在大鼠恢复翻正反射后10分钟进行。

1. 意识丧失时间：记录大鼠从麻醉开始到恢复翻正反射所持续的时间。
   注意：翻正反射是指将大鼠仰卧放置时，其自行翻转过来的过程。失去翻正反射应被视为人道终点，须根据机构指南对动物实施安乐死。
2. 首次寻觅行为时间：记录大鼠从麻醉开始到首次出现寻觅行为所持续的时间。
   注意：寻觅行为是大鼠对周围环境产生兴趣的表现，属于一种生理反应。
3. 逃逸能力
   1. 将大鼠置于一个圆形装置（直径0.5 m，高0.3 m）的中央，装置设有一个出口（长12.5 cm，宽9 cm）。
   2. 记录大鼠离开圆圈所需的时间。
      注意：若大鼠在180 s内未能离开圆圈，则记录时间为180 s。
4. 横梁平衡能力测试
   1. 分别将大鼠置于宽3 cm、2 cm和1.5 cm的横梁上，每根横梁测试1 min。
   2. 若大鼠在横梁上保持平衡且姿势稳定，则评分为0。
   3. 若大鼠抓握横梁侧边，则评分为1；若大鼠抱住横梁且有一肢滑落，则评分为2。
   4. 若大鼠抱住横梁且有两肢滑落，或在横梁上旋转（>60 s），则评分为3。
   5. 若大鼠试图在横梁上保持平衡但滑落（> 40 s），则评分为4。
   6. 若大鼠试图在横梁上保持平衡但滑落（>20 s），则评分为5。
   7. 若大鼠未尝试在横梁上保持平衡或抓握横梁，且在20 s内滑落，则评分为6。
      注意：横梁平衡测试无需预先训练。

6. 验证程序：神经行为学评估

注意：在进行行为学实验之前，大鼠需连续3天每天抓取处理2分钟，以尽量减少应激反应和新奇环境带来的干扰。所有行为学实验开始前，均需将动物置于测试环境中适应60分钟。

1. 运动协调能力（平衡木实验）
   1. 实验装置
      1. 将大鼠放置在平衡木的一端（平衡木长1.5米，离地面75厘米），在另一端放置一个逃生箱（倾斜的垫料饲养笼）。
      2. 在平衡木下方放置泡沫垫，以减轻大鼠在测试过程中跌落时可能受伤的风险。
      3. 打开摄像机。
      4. 在损伤后或假手术处理后的特定时间点安排测试日（例如第1天、第3天和第7天）。
   2. 训练阶段（2天）
      1. 训练大鼠连续3次通过4厘米宽的平衡木，随后进行2次2厘米宽平衡木的试验。
      2. 在训练期间，轻柔地引导大鼠通过平衡木，直到它们能够轻松通过而无需干预。
   3. 平衡木实验
      1. 将大鼠放置在2厘米宽的平衡木上，进行5次连续试验。
      2. 当大鼠的鼻尖分别越过起始线和终点线时，记录每次试验的开始和结束时间。
      3. 实验结束后将大鼠放回其饲养笼中。
   4. 基线测试
      1. 在损伤或处理前进行平衡木实验。
      2. 根据这5次连续试验的结果计算平均值，以建立每只大鼠的基线数据。
   5. 数据分析
      1. 由对实验条件设盲的研究人员通过视频分析，评估大鼠通过平衡木所需的时间以及后肢滑落的总次数。
2. 焦虑行为（旷场实验）
   1. 实验装置
      1. 准备旷场实验装置，确保其清洁且无先前的气味残留。将旷场区域划分为三个区域：中央内区（33 cm × 33 cm）、中间区（66 cm × 66 cm）和外周区。
   2. 测试阶段
      1. 将一只大鼠置于旷场装置的中心位置并启动计时器，允许其自由探索5分钟。5分钟后，小心而轻柔地将大鼠放回其饲养笼中。
   3. 数据采集
      1. 测量大鼠在5分钟探索期间的总移动距离，并确定其在中央内区、中间区和外周区所花费的时间。
   4. 数据分析
      1. 使用总移动距离作为整体探索行为和运动能力的指标；计算大鼠在中央内区停留的时间，作为焦虑样行为的指标。
3. 学习与记忆能力（Morris水迷宫实验）
   1. 确保水迷宫装置处于良好状态。将水染成黑色，并在四个正方向放置视觉线索。将平台置于水面以下2.5 cm处。
   2. 设置监控系统以记录和观察大鼠的行为。
   3. 训练日
      1. 迅速将大鼠放入水迷宫中。如果大鼠在2分钟内未能找到平台，使用木棒轻柔引导其到达平台。
      2. 让大鼠在平台上停留20秒以熟悉迷宫环境，然后将其移出。一旦大鼠登上平台，即让其停留20秒后再将其移走。
   4. 每日重复
      1. 重复训练日的操作，从不同象限将大鼠放入水中。重复步骤6.3.3，连续进行5天训练。
   5. 探针测试日：第6^天，移除平台，将大鼠从同一象限放入水中，持续2分钟。
   6. 观察与记录：利用监控系统记录训练日和探针测试日大鼠的行为表现。
   7. 清洁：将大鼠从水迷宫中取出后，使用毛巾将其彻底擦干。

结果

本研究所使用的装置是Kane模型和Richelle Mychasiuk儿科模型的改良版本^11,12。在本研究中，SD大鼠被分为假手术组和轻度创伤性脑损伤（mTBI）组。为验证该模型的可重复性，我们独立重复了三次该模型实验，并同步进行了急性期神经行为学评估，每次实验使用8–12只大鼠。本研究共使用了30余只mTBI大鼠，其中2只因麻醉原因死亡，但实验过程中无大鼠因脑损伤死亡。这些实验的结果见图2。此外，神经行为学评估还分别在急性期和亚急性期进行（图3、图4和图5）。

急性神经行为学评估结...

讨论

该模型成功模拟了闭合性头部轻度创伤性脑损伤（mTBI），无需进行头皮切开或开颅操作，从而更准确地再现了人类病例中观察到的冲击情景。避免头皮切开有助于防止可能与实际情况不符的炎症反应。与Richelle Mychasiuk的儿科模型¹²相比，本研究中使用的模型专门针对体重在280–320 g之间的成年大鼠设计，使我们能够深入理解mTBI对成年个体的影响。此外，通过引入枕头和头盔等关键组件，有助于传递更均匀的冲击力，并协助操作者精确定位冲击目标区域。

需要强调的是，大鼠的撞击操作是在没有维持麻醉的情况下进行的，因此在开始撞击前必须确认麻醉深度。我们通过轻轻摇动麻醉诱导箱并观察大鼠是否无反应来确认麻醉状态，同时将麻醉时间额外延长30秒，以确保达到足够的麻醉水平。建议在1分钟内完成整个撞击过程。

本研究中描述的冲击装置相对易于构建，几乎可在任何实验室中根据所提供的规格进行复制。这有助于在不同研究环境中实现实验数据的更高标准化和可比性。此外，本研究获得的验证数据为研究人员解答特定科学问题提...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酸盒	内部	N/A	15 cm × 22 cm × 43 cm
麻醉机	RWD Life Science Co.	R540 小鼠 &和大鼠动物麻醉机
头盔	内部	N/A	直径10 mm、厚度3 mm的不锈钢圆盘
莫里斯水迷宫	RWD Life Science Co.		直径150厘米，高50厘米，平台直径35厘米
开放场	RWD Life Science Co.	63007	宽度100 cm，高度40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
穿孔砝码	内部	N/A	重量为550 g，直径为18 mm
枕头	内部	N/A	置于大鼠头部下方的楔形海绵