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方法文章

一个 离体 用于实验性主动脉瓣手术及新型医疗器械水动力学测试的猪模型

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DOI：

10.3791/65885

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2023年8月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Columbia University Medical Center, 2College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3School of Medicine and Surgery, University of Bologna, 4Division of Cardiac, Thoracic, and Vascular Surgery, Section of Pediatric and Congenital Cardiac Surgery, New York-Presbyterian Morgan Stanley Children’s Hospital, Columbia University Medical Center

本文内容

摘要

我们介绍了一种将猪主动脉瓣安装在脉动流模拟器上以测试其流体动力学特性的方法。该方法可用于在实验操作或新型医疗器械应用于大型动物模型之前，评估其对流体动力学性能的影响。

摘要

在动物模型中应用之前，用于测试新型心脏手术方法和研究性医疗器械的方案十分有限。本研究中，我们介绍了一种将猪主动脉瓣安装在脉动流模拟器中以评估其流体动力学特性的方法。通过该方法，可在实施待研究的手术操作和/或应用研究性医疗器械前后，对这些流体动力学特性进行评估。由于左心室流出道缺乏完整的心肌组织，流入段的固定存在一定困难。本方法通过利用二尖瓣前叶固定流入段，并将左心室游离壁缝合在流入端固定装置周围，从而解决了这一问题。流出段的固定则较为简单，只需将固定装置插入主动脉弓上部的切口即可。我们发现，组织固定前后，样本的流体动力学特性存在显著差异。这一发现促使我们在测试中采用新鲜样本，使用该方法时应充分考虑此因素。在本研究中，我们利用该方法对新型心内补片材料在瓣膜位置的应用性能进行了测试，具体操作是在安装好的猪主动脉瓣上实施主动脉瓣三叶成形术（Ozaki 手术）。这些瓣膜在手术前后均接受了测试，以评估其流体动力学特性的变化，并与天然瓣膜进行比较。本文报道了一种可用于实验性主动脉瓣手术流体动力学测试的平台，该平台支持与天然瓣膜进行比较，并可用于评估不同器械及技术在待研究手术中的表现。

引言

主动脉瓣疾病对公共卫生构成了重大负担，尤其是主动脉瓣狭窄，全球约有900万人受其影响1。目前，针对该疾病的治疗策略正在不断发展，包括主动脉瓣修复和主动脉瓣置换。在儿科人群中，尤其倾向于修复而非置换瓣膜，因为目前可用的假体容易发生结构性瓣膜退变（SVD），且不具备随生长而适应的能力，随着患者的生长发育，往往需要再次手术进行更换。即使是Ross手术——将病变的主动脉瓣（AV）以患者自身的肺动脉瓣（PV）替代——也仍需在肺动脉位置植入假体或移植物，而这些材料同样可能发生结构性瓣膜退变，并常表现出生长耐受性有限的问题2。新的主动脉瓣疾病治疗策略正在研发中，在应用于大型动物模型之前，亟需在具有生物学相关性的环境中进行测试。

我们已开发出一种用于测试猪主动脉瓣（AV）的方法，可在实验性操作或应用新型医疗器械前后，深入了解瓣膜的功能。通过将猪主动脉瓣安装在商用脉动模拟器上，我们能够比较常用于瓣膜假体研究及最终审批的血流动力学特性，包括反流分数（RF）、有效瓣口面积（EOA）和平均正向压差（PPD）3,4。随后可在具有生物学相关性的环境中对干预措施进行精细调整，再应用于大型动物模型，从而减少为开发可用于人类的手术方法或假体所需使用的动物数量。本实验所用心脏可取自当地屠宰场或其它实验的废弃组织，因此无需仅为本实验额外宰杀动物。

在本研究中，我们采用该方法开发了一种用于瓣膜修复与置换的新型补片材料。我们通过对猪主动脉瓣（AV）实施主动脉瓣再造术（Ozaki 手术5,6,7），并在脉动流模拟器中对多种补片材料在手术前后进行血流动力学功能测试。这使我们能够根据材料的血流动力学表现对其进行优化。因此，该方法为在大型动物模型中应用之前，针对主动脉瓣的实验性手术操作及新型医疗器械提供了血流动力学测试平台 。

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方案

所有研究均按照机构关于动物护理的指导原则进行。

1. 实验的注意事项与准备工作

  1. 使用合适的脉动流模拟器（PD）来模拟通过主动脉瓣（AV）的每搏输出量。该PD需能够容纳生物材料，并可进行清洁。
    1. 采用适用于主动脉瓣测试的PD设置：70 mL的排量体积，70次/分钟的心率（5 L/min的心输出量），心室收缩期占心动周期的35%，平均跨瓣压差为100 mmHg，最大压差为120 mmHg，最小压差为80 mmHg。
    2. 使用室温（RT）生理盐水（0.9% NaCl）作为流体介质。
  2. 寻找或制备（使用3D打印或类似方法）合适的夹具，用于将猪主动脉瓣固定在PD上进行测试。
    1. 采用以脉动流模拟器配套夹具为模型设计的夹具，规格如下：确保夹具的内径与所研究主动脉瓣的直径相近，连接长度至少为2 cm，可用连接宽度至少为4 cm（图1）。
    2. 在夹具两端使用橡胶O型圈作为密封垫片。
  3. 在心脏切除术后获取心脏标本（图2A）。
    1. 使用来自屠宰场的猪心脏标本，或使用其他健康动物的废弃组织，且这些动物未参与任何可能影响其心脏的实验方案。
    2. 在心脏切除术后获取标本，或进行死后心脏切除，包括在主动脉弓远端切断上腔静脉、下腔静脉、主肺动脉（PA）、所有肺静脉和主动脉。
      注：本实验应使用新鲜标本，即死后6小时内获取的标本，或在含1%抗生素溶液（青霉素和链霉素）的无菌生理盐水中保存，并置于4 oC冰箱中不超过7天的标本。经甲醛或戊二醛固定的组织会因刚度增加而导致水动力学结果发生改变。

带测量标注的静态平衡装置示意图；物理实验装置。
图1：用于在脉冲复制仪上安装猪主动脉瓣的定制3D打印夹具。 如实验方案中所述，连接长度应至少为2 cm，可用连接宽度应至少为4 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 右侧结构的切除

  1. 使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）从主动脉上解剖分离肺动脉（PA），直至心室组织可见（图2B）。
  2. 在冠状动脉起源于主动脉窦处，用丝线结扎两条冠状动脉，注意避免缩窄主动脉窦。
  3. 在丝线结扎远端横断两条冠状动脉。
  4. 使用梅岑鲍姆剪刀在肺动脉瓣基底部、主动脉与肺动脉（PA）之间切开右心室（RV）（图2C）。
  5. 从前侧开始，沿室间隔环形延伸切口，以去除右心室游离壁（图2D、E）。
  6. 继续向后延伸切口，穿过三尖瓣环并沿房间隔走行，以完全去除右心房组织（图2F）。

心脏解剖示意图；展示使用手术器械逐步进行解剖探索的步骤。
图 2：心脏切除标本及右侧结构的切除。 （A）心脏切除标本。（B）将主肺动脉从主动脉上解剖分离，直至可见心室组织。（C）在肺动脉瓣基底部切开右心室（RV）。（D）沿室间隔前方向前继续切开。（E）沿室间隔周向继续环形切开，以去除右心室游离壁。（F）已去除右侧结构的标本。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 准备左心室流出道（LVOT）以使用PD夹具进行插管

  1. 使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）从右肺静脉开口处沿主动脉平行切开左心房（LA）（图3A）。
    注意：尽管存在一定个体差异，猪的肺静脉解剖结构通常以两个肺静脉开口汇入左心房为主8。
  2. 将切口继续向前外侧二尖瓣交界处延伸，保留主动脉侧至少3 mm的心房组织袖状结构。
  3. 修剪多余的左心房组织，保留主动脉侧3 mm的心房组织袖状结构，并完整保留二尖瓣环周的组织（图3B）。
  4. 将切口通过二尖瓣的前外侧交界处延伸至左心室（LV），注意保护前外侧乳头肌（图3C）。
  5. 切断前外侧乳头肌至后叶二尖瓣瓣叶的腱索，保留其与前叶二尖瓣瓣叶的连接。
  6. 继续将切口延伸至心脏心尖部。
  7. 修剪乳头肌下方多余的左心室组织，保留两个乳头肌（图3D）。

心脏解剖过程；解剖学研究示意图；识别心脏结构和组织。
图3：使用脉冲复制装置夹具进行左心室流出道插管前的准备。（A）通过右肺静脉开口切开左心房（LA）。（B）修剪多余的左心房组织，保留主动脉上至少3 mm的心房组织袖状结构，并完整保留二尖瓣环的周向结构。（C）通过二尖瓣的前外侧交界处将切口延伸至左心室（LV）。（D）去除乳头肌下方多余的左心室组织。图像右上角可见剪刀。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 使用 PD 固定装置对主动脉进行插管前准备

  1. 从主动脉上修剪掉多余的淋巴组织、结缔组织或肺动脉组织（图4A）。
  2. 使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）沿降主动脉至左锁骨下动脉处切开主动脉弓的上表面（图4B）。
  3. 继续沿主动脉弓上表面从左锁骨下动脉切至无名干（brachiocephalic trunk）（图4C，D）。
    ​注意：猪主动脉弓的分支从远端到近端依次为左锁骨下动脉和无名干，后者发出右锁骨下动脉、右颈总动脉和左颈总动脉9。

心脏瓣膜解剖过程示意图；剪刀，手套；解剖学研究；外科技术。
图4：使用脉动模拟装置夹具进行主动脉插管前的准备。（A）已去除多余组织的主动脉弓。注意猪主动脉弓上的两个弓部分支血管，即头臂干和左锁骨下动脉。（B）从降主动脉开始，沿主动脉弓上缘向左锁骨下动脉方向做切口。（C）继续沿主动脉弓上缘从左锁骨下动脉向头臂干方向延伸切口。（D）完成的主动脉弓切口。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 使用PD装置对左心室流出道进行插管

  1. 测试固定装置在左室流出道（LVOT）中的位置，并修剪多余的左心室组织。
    1. 将固定装置插入二尖瓣（MV）前叶下方的左室流出道（LVOT）内。
    2. 将左心室游离壁包裹在固定装置周围。
    3. 修剪多余的左心室组织，以保持固定装置周围紧密贴合。
    4. 从室间隔开始，去除左心室游离壁一半的厚度，游离缘处至少保留1 cm的心外膜，以维持缝合线的完整性（图5A）。
    5. 从左心室游离壁包裹部分的上角修剪掉1 cm的组织（图5A）。
  2. 将固定装置置于左室流出道（LVOT）中，使支撑杆连接孔位于左心室切口后方1 cm处（图5B）。
    1. 注意不要将固定装置插入过深，以免扩张主动脉瓣（AV）瓣环。
  3. 使用一根或两根6英寸扎带，将其置于瓣叶腱索之间，将二尖瓣（MV）前叶固定在装置上（图5C）。
  4. 将左心室游离壁围绕固定装置进行缝合（图5D）。
    1. 首先使用带圆锥形针尖的缝针，以连续缝合法将主动脉上的左心耳（LA）组织套筒缝合至二尖瓣瓣环。
    2. 继续将连续缝合延伸至左心室，注意不要撕裂左心室组织。

心脏组织解剖；支架上的心脏样本；解剖学研究制备过程。
图 5：使用脉冲复制装置对左心室流出道进行插管。（A）切除左心室游离壁一半厚度，保留游离缘处1 cm的心外膜。虚线表示需从左心室游离壁包裹部分的上角去除的1 cm区域。（B）支撑杆固定孔位于左心室游离壁切口后方1 cm处。（C）使用扎带将二尖瓣前叶固定至近端装置。（D）将左心室游离壁缝合固定在装置周围。请点击此处查看本图的放大版本。

6. 使用 PD 固定装置对主动脉进行插管及腹膜透析测试的最终准备

  1. 使用 Hegar 扩张器测量主动脉瓣（AV）的直径，以辅助解释 PD 测试的结果。
  2. 通过抓握主动脉将标本从台面上抬起，确定主动脉的中立位置（图 6A）。
  3. 将 PD 夹具插入主动脉，注意将杆连接孔对准主动脉的中立位置。
  4. 插入支撑杆以检查标本的长度。
  5. 使用一个或两个 6 英寸扎带将 PD 夹具固定在主动脉上（图 6B）。
  6. 使用一个或两个 8 英寸扎带将左心室流出道（LVOT）固定在 PD 夹具周围。
  7. 使用 PD 套件附带的螺丝将支撑杆固定到位。
  8. 将标本放入 PD 装置并开始测试（图 6C、视频 1、和 视频 2）。
  9. 根据需要缝合任何泄漏部位。

骨组织拉伸测试装置；示意图显示实验中的应力-应变测量过程。
图6：主动脉插管及在脉动模拟器中进行测试。（A）通过主动脉将样本从台面上抬起，以确定主动脉的中性位置。（B）使用扎带将远端夹具固定在主动脉中。（C）将样本安装至脉动模拟器中进行流体动力学测试。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 执行实验操作

注意：按照先前所述的方法进行实验操作，例如 Ozaki 手术5,6,7，并重复 PD 测试。

  1. 如果在操作过程中组织变得干燥，应收紧扎带并根据需要加强缝合线。

8. 标本的长期保存（如需要）

  1. 将样本置于10%福尔马林中固定168小时（1周）10,11。
  2. 组织固定后，用去离子水清洗样本，并将其置于70%乙醇中长期保存。

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结果

脉动模拟器收集的代表性数据包括反流分数（RF）、有效瓣口面积（EOA）和平均正向压差（PPD）。其中，RF 和 EOA 被用于人工瓣膜的 ISO 标准（ISO 5840），若正在研究人工瓣膜产品，则这些参数的采集至关重要。PPD 可提供关于开启瓣膜所需压力的信息，在讨论人工瓣膜置换时经常被引用3,4。本实验所使用的 HDTi-6000 脉动模拟器（BDC Laboratories, Wheat Ridge, CO）还可根据需要采集其他参数，包括关闭容积、泄漏容积、总反流容积、总前向流量容积、收缩期持续时间、最大正向压差以及平均前向流量。

正确实验条件下测得的天然主动脉瓣（n = 20）血流动力学参数（反流分数（RF）、有效瓣口面积（EOA）和平均压差（PPD））如表1所示。所获得的数值均在主动脉瓣测量的正常范围内，包括平均反流分数为5.74%12，以及平均预测主动脉瓣面积指数为1.08...

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讨论

本文介绍的方法为进行主动脉瓣（AV）的流体动力学测试提供了一个平台，可用于评估实验操作或新型医疗器械的影响。通过将天然主动脉瓣安装在脉动模拟器上，我们能够确定实验操作对所有用于新型瓣膜假体研究与审批过程中的流体动力学参数（ISO 5840）的影响。该方法为在大型动物模型中应用之前优化实验操作和假体设计提供了机会。

由于左心室流出道缺乏环形心肌，流入段的固定存在一定困难。本方法通过利用二尖瓣前叶固定流入段，随后将左心室游离壁缝合在流入装置周围，并在心室袖带上额外使用扎带，从而解决了这一问题。其他类似方法曾采用将聚对苯二甲酸乙二醇酯（Dacron）管缝合至左心室流出道15,16，或将流入装置固定于房室瓣环附近17,18。这些方法存在一定的风险：若将瓣环固定于直径大于其天然尺寸的相对刚性流入装置上，可能导致有效开口面积（EOA）人为增大，而反流分数（RF）...

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披露

作者无相关利益冲突需披露。

致谢

我们感谢Gordana Vunjak-Novakovic博士实验室的成员，包括Julie Van Hassel、Mohamed Diane和Panpan Chen，允许我们使用他们实验中的心脏废弃组织。本研究工作得到了新泽西州巴特勒的先天性心脏病联盟以及马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院（5T32HL007854-27）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印机UltimakerUltimaker S5用于打印流体动力学测试用的定制夹具
Crile-Wood 持针器Emerald Instruments2.0638.15用于心室缝合
Debakey 镊子Jarit320-110用于解剖和样本制备（若有助手协助操作，可使用多个）
乙醇 200 证明Decon Labs Inc.DSP-MD.43用于固定组织的储存
10% 福尔马林Epredia5701用于组织固定
Gerald 镊子Jarit285-126用于解剖和样本制备
玻璃罐QAPPDAB07QCP54Z3用于组织储存
25% 戊二醛Electron Microscopy Sciences16400用于组织固定
HEPES 1 M 缓冲液FisherBP299-100用于配制 0.6% 戊二醛溶液
Mayo 剪刀Jarit099-200用于剪断缝线
Metzenbaum 剪刀Jarit099-262用于解剖和样本制备
O 型圈Sterling Seal & Supply Inc.AS568-117用作 3D 打印夹具末端的垫圈
聚乳酸树脂Ultimaker1609用于 3D 打印夹具
聚丙烯缝线CovidienVP-762-X用于心室缝合，带圆锥形针头
脉动模拟器BDC LaboratoriesHDTi-6000用于流体动力学测试
丝线结扎线CovidienS-193用于冠状动脉结扎
扁桃体钳AesculapBH957R用于冠状动脉解剖
扎带（6 英寸）Advanced Cable Ties, Inc.AL-06-18-9-C用于将样本固定在夹具上，长 157.14 mm（6 英寸），宽 2.5 mm
扎带（8 英寸）GTSEGTSE-20025B.1000用于将样本固定在夹具上，长 203 mm（8 英寸），宽 2.5 mm

参考文献

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