姜黄素介导的抗菌光动力疗法在口腔念珠菌病小鼠模型上的应用

口腔念珠菌病（OC）是口腔的主要真菌感染;它是由 念珠菌 属的过度生长引起的。OC 的诱发因素包括内分泌功能障碍、使用广谱抗生素、放疗和化疗、营养缺乏、口干症（唾液流量低）、使用假牙、卫生条件差，尤其是免疫抑制¹。在 念珠菌 物种中， 白色念珠菌 是最普遍和最致命的一种;它被发现为人体内的共生物种和机会性病原体。 白色念珠菌 有能力将其形态从共生酵母（胚孔）转变为致病丝（菌丝和假菌丝）²。丝状形式，尤其是菌丝，可以通过内吞作用或主动渗透侵入宿主上皮，引起感染³. 白色念珠 菌的其他毒力因子包括粘附、生物膜形成以及脂解和水解酶和毒素的分泌，例如脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和念珠菌溶血素⁴。

OC治疗包括使用抗真菌药物，特别是局部多烯和唑类（制霉菌素和咪康唑）⁵。然而，它们仅显示出短期疗效，并且复发频繁。此外，抗真菌药物的过度使用引发了抗真菌药物耐药性发展和传播的问题⁶。因此，需要替代疗法，例如抗菌光动力疗法 （aPDT），它在氧气存在下将光敏剂 （PS） 和适当波长（与 PS 吸收相同）的光结合在一起。PS与细胞结合或被细胞吸收，当被光激活时，会产生对致敏细胞有毒的活性氧（ROS^）7。

在aPDT中，使用的光敏剂（PS）之一是姜黄素（CUR），这是一种从姜黄植物（Curcuma longa L.）的根茎中提取的天然化合物。姜黄素具有多种治疗特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌能力 ^8,9。先前的一项研究发现，利用 CUR 的 aPDT 有效地减少了口腔念珠菌病小鼠模型中的白色念珠菌，而不会对宿主的组织造成任何伤害¹⁰。CUR是从姜黄中提取的主要姜黄素，但其他多酚，如脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素，也存在于这种植物中。姜黄素介导的 aPDT 对导管中生长的金黄色葡萄球菌的生物膜具有抗菌活性¹¹。然而，据我们所知，其对白色念珠菌的抗真菌活性仍不清楚。因此，在这项研究中，我们评估了在 OC 小鼠模型中由姜黄素盐介导的针对白色念珠菌的 aPDT。

使用小鼠的研究方案已获得UNESP阿拉拉夸拉牙科学院的动物使用伦理委员会（案例编号05/2008和09/2020）的批准。 白色念珠菌 （ATCC 90028）作为参比菌株。本研究使用体重范围为 20-30 g 的六周龄雌性瑞士小鼠 （n = 45）。这些动物由圣保罗州立大学、UNESP、Botucatu提供。

1. PS的制备和aPDT光源的选择

1. 根据要测试的物质的规格准备PS。
   注:在这项研究中，使用姜黄素类水溶性混合物（基于CUR的水溶性盐混合物¹²）作为PS（参见 材料表 和 图1）。20μM、40μM和80μM（分别为15.6、29.2和58.4mg/L）的稀释液在使用前立即在超纯水中制备，并保持在5°C。
2. 选择具有适当波长（与PS吸收波长相同）的光设备，该光设备能够均匀地同时照亮整个光敏目标，而不会加热组织。
   注:在这项研究中，使用了由圣保罗大学，圣卡洛斯，SP，巴西圣保罗大学）设计的包含发光二极管（LED， 见材料表）的手机。在大约 455 nm 的蓝色波长下，光提供的输出功率为 89.2 mW/cm² 。

2. 白色念珠菌 接种物的制备

1. 将参比菌株白色 念 珠菌（ATCC 90028）保存在-80°C下含有50%甘油的酵母 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YEPD，参见 材料表）中直至使用。
2. 在室温下解冻冷冻菌株，将100μL等分试样铺在培养皿上，用Sabouraud葡萄糖琼脂（SDA）和氯霉素（参见 材料表），并在37°C孵育48小时。
3. 将五个菌落转移到含有2%葡萄糖（YNBg）培养基的10mL酵母氮肉汤中，并在37°C有氧生长16小时。
4. 在新鲜YNBg（1:10）中稀释酵母培养物，并在37°C有氧孵育，直到光密度达到生长的中对数阶段。
   注意:之前对每个实验室的微生物生长曲线进行标准化。在目前的研究中，允许培养物孵育约8小时，直到它们达到生长的中对数阶段，如540nm处的光密度（OD₅₄₀）所示，平均值为0.536±0.062任意单位（平均值±标准差[SD]）。
5. 在室温下以5,000×g离心培养物5分钟，弃去上清液，并用相同体积的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS;0.136M NaCl，2mM KCl，1mM KH₂PO 4,10mM Na₂HPO_4，pH 7.4）洗涤沉淀两次。
6. 使用100μL等分试样在PBS中进行四次连续10倍稀释，在SDA板上摊开稀释液，并在37°C孵育48小时进行菌落计数。作为标准，真菌悬浮液的浓度约为每毫升 4.5 ×^{10 7 个} 菌落形成单位 （CFU/mL）]。

3. 诱导小鼠OC

注:以下方法先前由Takakura等人¹³描述，并由我们的^小组10,14复制，并进行了一些修改。

1. 将小鼠随机分布在九组（n = 5）中，对应于相同数量的治疗（补充文件1）。
   注意:小鼠的口腔对 念珠菌 生长应该是阴性的。这需要通过擦拭口腔并将样品镀在 SDA 上来检查。
2. 将动物保存在丙烯箱¹⁰（每箱最多5只小鼠）中，用刨花作为地板覆盖物，在23±2°C的温控动物饲养箱中，在12/12小时的光/暗循环下。无需提供具体的富集。
3. 随意维持小鼠挤出小鼠饮食和过滤水。
4. 皮下注射免疫抑制药物泼尼松龙（100mg / kg体重，见 材料表），在第一天首次向C+L + 20，C + L + 40，C + L + 80，C + L- 20μM，C + L- 40，C + L- 80，C-L +和C-L-（补充文件1）的所有成员注射。
   注意:将来自同一组的小鼠放在同一个盒子中，并每天监测它们是否有任何压力和体重减轻的迹象。如果发现压力或体重减轻，请寻求兽医建议，以镇痛或改变食物/水。
5. 从第一天开始直到实验结束，在饮用水中以 0.83 mg/mL¹³ 提供盐酸四环素。
6. 在第二天接种小鼠舌头，包括 C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L-20、C+L-40、C+L-80、C-L+和 C-L-（补充文件 1），用 白色念珠菌 接种物。不要接种阴性对照组（NCtrl）的小鼠。
   1. 在进行接种之前，通过在每块大腿肌肉上肌肉注射10mg / kg氯丙嗪氯化物（见 材料表）来镇静动物。
   2. 通过将无菌拭子（每只动物一个）浸泡到新鲜制备的（即接种前立即制备的） 白色念珠菌标准化悬浮液中，对小鼠进行口内接种。
   3. 将镇静的小鼠置于仰卧位。用无菌镊子轻轻地将他们的舌头从嘴里拉出来。用浸湿的棉签擦拭每只老鼠的舌头 30 秒。监测小鼠，直到它们从镇静中恢复过来。
7. 在第 5 天，补充皮下注射泼尼松龙（100 mg/kg 体重）以维持免疫抑制。
   注意:该方案足以在口内接种后将感染保持 7 天。协议时间线如 图 2 所示。

4. 抗菌光动力疗法和白色 念珠菌 从口腔病变中恢复

1. 在第七天，在治疗之前，使用腹膜内注射盐酸氯胺酮（100mg / kg体重）与甲苯噻嗪（10mg / kg体重）联合麻醉动物（见 材料表）。
2. 将每只动物仰卧放置在垫装置^14,15上，该装置配有不锈钢丝，可以缠绕在门牙上以保持嘴巴张开。
   注意:建议使用等温垫在镇静时加热小鼠，防止室温下体温过低并避免与麻醉^{相关的死亡率15}。当捏住脚趾以确认麻醉深度时，应通过缺乏戒断反射来监测每个麻醉动物。如果需要，可以给予原始剂量的 1/3 氯胺酮维持剂量（不含甲苯噻嗪）。
3. 下颌骨和脸颊缩回，轻轻地将舌头放在嘴外。
4. 对于来自C + L +组的小鼠，在舌背上移液70μLPS（以测试浓度之一）。将小鼠保持在黑暗环境中20分钟作为照射前期。确保在此期间，每只动物的舌头保持在口腔内，以防止光敏剂（PS）被摄入。
5. 光敏期过后，将舌头从嘴里拉出来进行照明。将 LED 设备放在舌背上并以 37.5 J/cm² （使用现有设备 7 分钟）照射（图 3）。
6. 对于来自C + L-组的动物，在舌背上移取70μL的PS之一，并使这些小鼠在黑暗中保持27分钟。
7. 对于来自C-L +组的动物（用光处理，没有任何先前的光敏作用），在舌背上移液70μL无菌盐水溶液。将小鼠置于黑暗中20分钟，然后以37.5J / cm² （使用本装置7分钟）照射其舌头。
8. 对于来自C-L-组的小鼠（既未用PS处理也不用光处理），将70μL无菌盐水溶液移液移液在舌背上，并将它们置于黑暗中27分钟。
9. 治疗后立即从所有小鼠的舌头中恢复 白色念珠菌 。用无菌棉签擦拭舌背 1 分钟。
10. 将每个样品拭子放入含有 1 mL 无菌盐水的试管中并涡旋 1 分钟以重悬微生物细胞。
11. 立即在 PBS 中连续稀释 10 倍，并在 SDA 板上将 25 μL 等分试样平板一式两份。将板在37°C有氧孵育48小时。
12. 48小时后，使用数字菌落计数器（参见 材料表）确定酵母菌落计数。计算每只动物的 白色念珠菌 负荷（CFU/mL）。
13. 将 CFU/mL 值转换为对数₁₀ ，并根据实验设计和数据假设进行正确分析。
    注:在本研究中，使用了 Welch 单因素方差分析和 Games-Howell 事后检验 （α = 0.05）¹⁶ 。

5. 组织病理学分析

1. 在第八天，通过腹腔内注射用100mg / kg的氯胺酮与10mg / kg的甲苯噻嗪联合麻醉小鼠，并用过量的氯胺酮（200mg / kg通过腹腔内给药）对小鼠实施安乐死。通过检查无呼吸运动（呼吸暂停）和无心跳（心脏停搏）来确认死亡。
2. 小心地捏住舌头并将其从动物的嘴里拉出来。使用手动手术刀，在环状前切开一个切口，手术切除整个舌头，而不会对前部和中央区域造成任何伤害。
3. 将舌头固定在10%缓冲福尔马林（pH 7.2-7.4）中24小时，并在流水中洗涤2小时。
4. 继续加入石蜡过程:脱水，澄清和浸渍^10,14。
5. 使用切片机切割连续切片（5μm厚），然后将切片贴在载玻片上。继续使用高碘酸-希夫和苏木精（PAS-H）对这些切片进行染色，以进行组织病理学检查，并通过在光学显微镜下观察来鉴定真菌。
6. 请病理学家（最好对所研究的群体不知情）检查由于 白色念珠菌 感染引起的组织反应。
7. 描述组织（上皮和结缔组织）的组织学特征，特别是不同强度的局部炎症反应。

OC的小鼠模型显示所有感染小鼠的舌头上有典型的白斑和假膜（图4A）。从C-L-动物中回收 的白色念珠菌 证实了该微生物的组织定植（值范围为1.62 x 104 至4.80 x 105 CFU/mL）。正如预期的那样，来自NCtr组的动物在取样后没有表现出任何组织改变或菌落生长（图4B）。

当在80μM下使用姜黄素进行光敏化时，aPDT降低了 白色念珠菌 的活力（图5）。与C-L-组相比，80μM PS介导的aPDT实现的平均log10 减少为2.47（p = 0.008）。

从小鼠舌头中回收的 白色念珠菌 菌落数在用姜黄素处理的小鼠中没有显着差异没有显着差异没有光照（C+L-组），用光处理但先前没有光敏的小鼠（C-L+组）和未处理的小鼠（C-L-组）（p ≥ 0.210）。

未感染动物舌头的组织学特征（NCtr）显示正常/健康组织，包括完整的固有层，基底膜和丝状（图6A）。相反，当检查C-L-组小鼠舌头的组织病理学图像时，很明显酵母和细丝存在于上皮的角质化层内，尽管没有真菌浸润。在下面的结缔组织中，观察到轻微的炎症反应，主要由单核细胞介导，丝状明显缺失（图6B）。C+L-和C-L+组小鼠舌头的组织学分析显示出相似的特征。相比之下，用80μM姜黄素介导的aPDT治疗的小鼠的舌头切片显示真菌细胞数量减少，主要局限于上皮的角质化层（图6C）。

图1:光敏剂的化学结构。 用作光敏剂的水溶性盐混合物的化学结构，包括53.4%的天然姜黄素和46.6%的其他姜黄素类化合物（去甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素）。最终平均分子量为 730.32 g/mol。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:口腔念珠菌病和 aPDT 小鼠模型的方案时间表。 概述口腔念珠菌病和抗菌光动力疗法 （aPDT） 小鼠模型方案的时间表。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:光敏后小鼠舌头的照明。光敏化后（用光敏剂孵育感染组织），使用蓝色（~455nm）LED灯以37.5 J /cm 2照射舌头。请点击这里查看此图的较大版本.

图4:小鼠口腔念珠菌病模型中的白色病变。 （A）描述在口腔念珠菌病小鼠模型中观察到的白色病变的代表性图像。（B） 阴性（未感染）对照。 请点击这里查看此图的较大版本.

图5:从小鼠舌头中回收的 白色念珠菌 。 数据表示治疗组的平均值±log 10（CFU/mL）的标准差。Welch单因素方差分析表明，各组间治疗效果有统计学意义（p < 0.001）。根据 Games-Howell 检验 （p≤ 0.030），均值旁边的不同小写字母 （a、b、c） 表示具有统计学意义的差异。 请点击这里查看此图的较大版本.

图6:小鼠舌头组织学切片的代表性图像。 用PAS-H染色小鼠舌头的组织学切片，并以200倍的速度捕获图像。 （A）无诱导口腔念珠菌病，光敏和照明的阴性对照小鼠（NCtr组）。（B）具有诱导的口腔念珠菌病的小鼠，既不光敏也不暴露于LED照明（C-L-组）。（C）诱导口腔念珠菌病的动物，暴露于80μM姜黄素类化合物和37.5J / cm2 LED照明（C + L + 80组）。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件1:实验组。 本研究中使用的实验组列表。 请点击此处下载此文件。

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.