本方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用。aPDT 采用水溶性姜黄素类化合物混合物结合蓝光 LED 照射进行。
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摘要
摘要
抗菌光动力疗法（aPDT）已得到广泛研究 体外，感染的临床前动物模型适用于在临床试验前评估替代疗法。本研究描述了光动力抗菌疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的疗效。40只小鼠通过皮下注射泼尼松龙进行免疫抑制处理，随后使用预先浸入念珠菌悬液的口腔拭子对小鼠舌部进行接种 C. albicans 细胞悬液。给予四环素 通过 实验期间，小鼠可自由饮用饮水。真菌接种后第5天，将小鼠随机分为八组；另设第九组未处理且未感染的小鼠作为阴性对照组（n = 5）。采用三种浓度（20 µM、40 µM 和 80 µM）的姜黄素类化合物混合物，并结合蓝光LED（89.2 mW/cm²）进行处理2；~455 nm）以及无光照（分别为 C+L+ 和 C+L- 组）。单独光照（C-L+）、无任何处理（C-L-）以及未感染动物作为对照组进行评估。数据采用 Welch's ANOVA 和 Games-Howell 检验进行分析（α = 0.05）。所有感染动物均成功建立口腔念珠菌病模型，并通过舌背出现典型白色斑块或假膜在宏观上得以观察。组织病理学切片显示，C-L- 组中大量酵母和菌丝局限于上皮角化层；而在接受 40 µM 或 80 µM 姜黄素类化合物介导的 aPDT 治疗的小鼠图像中，真菌细胞的存在在视觉上明显减少。80 µM 姜黄素类化合物介导的 aPDT 实现了 2.47 log 的降低10 与C-L-组相比，菌落计数减少（p = 0.008）。其他所有组均未显示菌落数量的统计学显著减少，包括仅使用光敏剂（C+L-）或仅使用光照（C-L+）的组别。姜黄素介导的抗菌光动力疗法减少了小鼠舌部的真菌负荷。
引言
口腔念珠菌病（OC）是口腔主要的真菌感染，由念珠菌属真菌过度生长引起 假丝酵母 spp. 口腔念珠菌病的易感因素包括内分泌功能障碍、广谱抗生素的使用、放疗和化疗、营养缺乏、口干症（唾液流量降低）、义齿佩戴、口腔卫生不良，尤其是免疫抑制状态。1. 在……之中 假丝酵母 物种, 白色念珠菌 是最常见且毒力最强的一种；它在人体内可作为共生菌存在，也可作为机会性病原体。 C. albicans 能够从共生酵母形态（芽生孢子）转变为致病性菌丝形态（菌丝和假菌丝）2菌丝状形态，尤其是菌丝，可通过内吞作用或主动侵入方式侵入宿主上皮细胞，从而引起感染3. 其他毒力因子 C. albicans 包括黏附、生物膜形成，以及脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和念珠菌溶素等脂解酶、水解酶和毒素的分泌4.
口腔念珠菌病（OC）的治疗涉及使用抗真菌药物，尤其是局部应用的多烯类和唑类药物（如制霉菌素和咪康唑）5。然而，这些药物仅表现出短期疗效，且复发频繁。此外，抗真菌药物的过度使用已导致抗真菌耐药性的产生与传播问题6。因此，亟需替代疗法，例如抗菌光动力疗法（aPDT），该疗法结合光敏剂（PS）、在适当波长（与PS吸收波长相同）的光照以及氧气的存在下发挥作用。光敏剂可与细胞结合或被细胞摄取，在光照激活后产生对敏感细胞具有毒性的活性氧（ROS）7。
在光动力疗法（aPDT）中，一种常用的光敏剂（PSs）是姜黄素（CUR），这是一种从姜黄植物（Curcuma longa L.）的根茎中提取的天然化合物。姜黄素具有多种治疗特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌能力8,9。先前的一项研究发现，在口腔念珠菌病的小鼠模型中，使用姜黄素的aPDT能有效减少白色念珠菌（C. albicans）的数量，且未对宿主组织造成任何损伤10。姜黄素是从姜黄中提取的主要姜黄素类化合物，但该植物中还含有其他多酚类物质，如去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。姜黄素类化合物介导的aPDT已被证实对导管中培养的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜具有抗菌活性11。然而，据我们所知，其对白色念珠菌（C. albicans）的抗真菌活性仍不明确。因此，在本研究中，我们评估了姜黄素类盐介导的aPDT在中国台湾地区建立的OC小鼠模型中对白色念珠菌（C. albicans）的作用效果。
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方案
本研究使用小鼠的研究方案已获得圣保罗州立大学（UNESP）阿拉拉夸拉牙科学院动物使用伦理委员会的批准（批准编号：05/2008 和 09/2020）。实验采用白色念珠菌（C. albicans，ATCC 90028）作为参考菌株。本研究共使用45只6周龄雌性瑞士小鼠（n = 45），体重范围为20–30 g。实验动物由巴西圣保罗州立大学（UNESP）博图卡图校区提供。
1. 光动力疗法中光敏剂的制备与光源的选择
- 根据待测物质的规格制备光敏剂（PS）。
注意：本研究中使用了一种水溶性姜黄素类化合物混合物（基于姜黄素的水溶性盐混合物12）作为光敏剂（参见材料表和图1）。使用前立即用超纯水配制20 µM、40 µM和80 µM（分别为15.6、29.2和58.4 mg/L）的稀释液，并于5 °C保存。 - 选择具有合适波长（与光敏剂吸收波长相同）、能够均匀且同时照射整个光敏化靶区而不引起组织加热的光源设备。
注意：本研究使用了由巴西圣卡洛斯圣保罗大学圣卡洛斯物理研究所（Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil）设计的手持式发光二极管（LED，参见材料表）装置。光源输出功率在约455 nm的蓝光波长下为89.2 mW/cm2。
2. 准备 白色念珠菌 接种物
- 将标准菌株 C. albicans (ATCC 90028) 保存于含50%甘油的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD，参见材料表）培养基中，置于 -80 °C 保存至使用。
- 在室温下解冻冻存菌株，取100 µL菌液涂布于含氯霉素的沙保葡萄糖琼脂（SDA）培养皿（参见材料表），于37 °C 培养48小时。
- 挑取五个单菌落接种至10 mL含2%葡萄糖的酵母氮源培养基（YNBg）中，于37 °C 需氧培养16小时。
- 将酵母菌液按1:10比例接种于新鲜YNBg培养基中，于37 °C 需氧培养至菌液处于对数生长中期。
注：各实验室应预先建立标准化的微生物生长曲线。在本研究中，菌液培养约8小时，直至在540 nm处测得的光密度（OD540）达到对数生长中期，平均值为0.536 ± 0.062（均值 ± 标准差[SD]）。 - 在室温下以5,000 x g 离心5分钟，弃上清液，用等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS；0.136 M NaCl，2 mM KCl，1 mM KH2PO4，10 mM Na2HPO4，pH 7.4）重悬菌体沉淀并洗涤两次。
- 取100 µL菌悬液用PBS进行连续4次10倍梯度稀释，将各稀释液涂布于SDA平板，于37 °C 培养48小时进行菌落计数。通常使用浓度约为4.5 × 107 菌落形成单位/毫升（CFU/mL）的真菌悬液作为标准。
3. 小鼠骨钙素（OC）的诱导
注意：以下方法先前由 Takakura 等人13描述，并由我组10,14重复实现，略有修改。
- 将小鼠随机分为九组（n = 5），每组对应一种处理方式（补充文件 1).
注意：小鼠口腔应呈阴性 假丝酵母 生长情况需通过口腔拭子取样并在SDA培养基上接种培养来检测。 - 将动物饲养在聚丙烯盒中10（每箱最多5只小鼠） 使用木屑作为地面铺垫物， 在23 ± 2 °C的温度控制动物饲养室中，采用12/12小时明暗循环光照。无需提供特定的环境丰富化措施。
- 将小鼠饲养在挤压颗粒小鼠饲料和过滤水的条件下 随意摄取.
- 皮下注射免疫抑制药物泼尼松龙 （100 mg/kg 体重，参见 材料表)，首次在第一天给予 C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20 µM、C+L- 40、C+L- 80、C-L+ 和 C-L- 各组所有成员补充文件 1).
注意：将同组小鼠饲养于同一笼内，每天监测其是否有应激或体重减轻的迹象。若发现应激或体重减轻，应咨询兽医以确定是否需要使用镇痛剂或调整食物/饮水。 - 从第一天开始直至实验结束，将盐酸四环素以0.83 mg/mL的浓度加入饮水中给予13.
- 第2天接种小鼠舌部，包括 C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L- 20、C+L- 40、C+L- 80、C-L+ 和 C-L- 组（补充文件 1），其中的 C. albicans 接种物。不要对阴性对照组（NCtrl）的小鼠进行接种。
- 通过肌肉注射 10 mg/kg 氯丙嗪氯化物使动物镇静（参见 材料表) 在每侧大腿肌肉上 在进行接种之前。
- 对小鼠进行口腔内接种 通过将无菌棉签（每只动物一支）浸入新鲜配制的（即接种前立即制备的标准化悬液 C. albicans.
- 将麻醉后的小鼠置于仰卧位。使用无菌镊子轻轻将其舌头拉出口外。用浸湿的棉签擦拭每只小鼠的舌头30秒。监测小鼠直至其从麻醉状态恢复。
- 第5天，给予泼尼松龙（100 mg/kg体重）皮下补充注射，以维持免疫抑制状态。
注意：本方案适用于口腔内接种后维持感染7天。方案的时间线如下所示： 图2.
4. 抗菌光动力疗法及从口腔病变中回收C. albicans
- 在第七天治疗前，通过腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合赛拉嗪（10 mg/kg 体重）对动物进行麻醉（参见材料表）。
- 将每只动物仰卧放置于带有不锈钢丝的垫板装置上14,15，不锈钢丝可绕在门齿周围以保持口腔张开。
注意：建议使用恒温垫在动物镇静期间为其保温，防止室温下发生低体温，并避免与麻醉相关的死亡15。应通过夹捏脚趾时无回缩反射来监测每只麻醉动物，以确认麻醉深度。如需要，可追加一次维持剂量的氯胺酮（剂量为初始剂量的1/3，不含赛拉嗪）。 - 在下颌和面颊回缩的情况下，轻柔地将舌头移出口腔外。
- 对于C+L+组的小鼠，将70 µL光敏剂（PS）溶液（选择一种测试浓度）滴加至舌背表面。将小鼠置于黑暗环境中持续20分钟，作为照射前孵育期。在此期间，确保每只动物的舌头保持在口腔内，以防止光敏剂（PS）被吞咽。
- 光敏化阶段结束后，将舌头拉出以进行光照。将LED装置置于舌背表面，以37.5 J/cm2的剂量照射（使用当前设备需照射7分钟）（图3）。
- 对于C+L-组的小鼠，在舌背表面滴加70 µL光敏剂（PS）溶液（选择一种测试浓度），并将这些小鼠在黑暗环境中放置27分钟。
- 对于C-L+组的小鼠（仅接受光照处理，未预先进行光敏化），在舌背表面滴加70 µL无菌生理盐水。将小鼠在黑暗环境中放置20分钟后，以37.5 J/cm2的剂量进行舌部照射（使用当前设备需照射7分钟）。
- 对于C-L-组的小鼠（既未接受光敏剂处理也未接受光照处理），在舌背表面滴加70 µL无菌生理盐水，并在黑暗环境中放置27分钟。
- 治疗后立即从小鼠舌部回收C. albicans。使用无菌棉签在舌背表面擦拭1分钟。
- 将每根取样棉签放入含有1 mL无菌生理盐水的试管中，涡旋振荡1分钟以重悬微生物细胞。
- 立即在PBS中进行10倍系列稀释，取25 µL稀释液重复接种于SDA平板上。将平板置于37 °C有氧条件下培养48小时。
- 48小时后，使用数字菌落计数器（参见材料表）测定酵母菌落数量。计算每只动物的C. albicans载量（CFU/mL）。
- 将CFU/mL数值转换为log10值，并根据实验设计和数据假设进行适当的统计分析。
注意：在本研究中，采用Welch单因素方差分析及Games-Howell事后检验（α = 0.05）16。
5. 组织病理学分析
- 第8天，使用100 mg/kg的氯胺酮与10 mg/kg的赛拉嗪联合麻醉小鼠 通过腹腔注射给予过量氯胺酮（200 mg/kg，腹腔注射）处死小鼠，通过检测呼吸运动消失（呼吸暂停）和心跳停止（心搏停止）确认死亡。
- 小心捏住舌头并将其拉出动物口腔。使用手动手术刀，在轮廓乳头前方做一切口，完整切除整个舌头，同时避免对舌前部和中部区域造成任何损伤。
- 用10%中性缓冲福尔马林（pH 7.2–7.4）固定舌头24小时，然后在流水下冲洗2小时。
- 继续进行石蜡包埋流程：脱水、透明和浸蜡10,14.
- 使用切片机切取连续切片（5 µm 厚），将切片贴附于玻璃载片上。随后采用过碘酸-希夫与苏木精（PAS-H）染色，以进行组织病理学检查，并在光学显微镜下观察以鉴定真菌。
- 请一位病理学家（最好对所研究的分组设盲）评估组织反应 C. albicans 感染
- 描述组织的组织学特征（上皮和结缔组织），尤其是不同程度的局部炎症反应。
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结果
小鼠OC模型显示，所有感染小鼠的舌头上均出现典型的白色斑块和假膜（图4A）。从C-L-动物中回收的C. albicans证实了该微生物对组织的定植（菌落数量范围为1.62 × 104 至 4.80 × 105 CFU/mL）。与预期一致，NCtr组动物在取样后未显示任何组织改变或菌落生长（图4B）。
当使用80 µM姜黄素类化合物作为光敏剂时，aPDT降低了白色念珠菌（C. albicans）的存活率（图5）。与C-L-组相比，80 µM光敏剂介导的aPDT实现的平均log10减少值为2.47（p = 0.008）。
在未接受光照的姜黄素处理组（C+L- 组）、仅接受光照但未进行光敏化的处理组（C-L+ 组）以及未处理组小鼠（C-L...
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讨论
C. albicans 与免疫功能低下者、糖尿病患者、长期使用抗生素者以及口腔卫生不良者的口腔和食管感染相关1,3。人类传染性疾病的研究需要在开展临床试验之前，进行体外（in vitro）和体内（in vivo）的研究，以确保试验设计的安全性和准确性。本研究描述了一种建立小鼠口腔念珠菌病（OC）模型的方法，可用于评估 C. albicans 引起的口腔感染的发病机制以及抗真菌治疗策略的有效性15,16,17,18,19。
本研究中采用的小鼠OC模型已成功建立，这通过从病灶中...
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致谢
作者感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，项目编号 FAPESP #2013/07276-1（CePID CePOF）和 2008/00601-6）提供的资金支持。我们还要感谢 Ana Paula Silva 博士提供了有关基于 CUR 的水溶性盐的信息。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C. albicans | 美国模式培养物集存库（ATCC，Rockville，Md，USA） | 90028 | 用于制备念珠菌接种物 |
| 离心机 | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R，B. Braun，Melsungen，Hesse，德国 | 022628146 (NA) | 用于制备念珠菌接种物 |
| 氯丙嗪氯化物 2 mg/mL | 巴西圣保罗州阿拉拉夸拉的药房配制 | - | 用于在接种白色念珠菌期间使动物镇静 |
| 基于姜黄素的水溶性盐 | PDTPharma，巴西克雷文斯 | - | 由53.4%的天然姜黄素组成，以及 46.6% 的其他姜黄素类物质（去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素）。以水和N-甲基-D-葡萄糖胺配制（最终平均分子量为730.32 g·mol⁻¹）−1) |
| 数字菌落计数器 | CP 600 Plus，Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda，巴西圣保罗州阿拉拉夸拉 | - | 用于计数琼脂平板上的菌落 |
| 挤压成型的小鼠饲料 | Benelab 饲料，Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda.，Lindóia, Sã巴西圣保罗州 | - | 用于小鼠喂养 |
| 盐酸氯胺酮 10% | 氯胺酮 Agener，União Quí米卡制药ê乌蒂卡国家股份有限公司，恩布瓜ç巴西圣保罗 | - | 用于在动物实验前进行麻醉 治疗和安乐死 |
| 发光二极管手柄（原型） | 中国台湾 F研究所í西卡 de São Carlos，S大学ã圣保罗，São Carlos, SP, 巴西 | - | 使用LXHL-PR09型Luxeon III发光器（Lumileds Lighting，美国加利福尼亚州圣何塞）制备 |
| 醋酸甲泼尼龙 40 mg | DEPO-MEDROL，辉瑞，纽约 | - | 用作免疫抑制剂 |
| 切片机 | Leica Microsystems，美国伊利诺伊州班诺克本 | SM2500 | 用于切割舌组织的连续切片 |
| 丙烯箱（笼具 housing）H13 × L20 × D30 cm | 邦瑟设备，里贝朗ão 巴西普雷图 | - | 用于在整个实验过程中饲养动物 实验周期 |
| 含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂 | HiMedia，孟买，印度 | MM1067-500G | 用于酵母生长的培养基（琼脂） |
| 分光光度计 | 分光光度计 Kasvi K37-VIS, São José 巴西多斯皮尼亚伊斯 | K37-VIS | 用于标准化接种物浓度 |
| 盐酸四环素 | 巴西圣保罗州阿拉拉夸拉的药房配制 | - | 用于诱导口腔菌群失调的抗生素 |
| 木屑 | J.R. 木屑，Comerce of Sawdust Ltda. 公司，Conchal，Sã巴西圣保罗州 | - | 用于 housing boxes 内部的地面覆盖 |
| 2% 赛拉嗪 | Calmiun, União Quí米卡制药ê乌蒂卡国家股份有限公司，恩布瓜ç巴西圣保罗 | - | 与氯胺酮联合用于麻醉 |
| 酵母氮源肉汤 | Difco，InterLab，底特律，密歇根州，美国 | DF0919-07-3 | 酵母生长培养基（液体） |
| 酵母提取物蛋白胨葡萄糖肉汤 | NutriSelect Basic，Sigma Aldrich | Y1375 | 用于在 -80 保存菌株的培养基°C 和生长 |
参考文献
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