姜黄素类介导的光动力抗菌疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用

摘要

本方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用。aPDT 采用水溶性姜黄素类化合物混合物结合蓝光 LED 照射进行。

摘要

抗菌光动力疗法（aPDT）已得到广泛研究 体外，感染的临床前动物模型适用于在临床试验前评估替代疗法。本研究描述了光动力抗菌疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的疗效。40只小鼠通过皮下注射泼尼松龙进行免疫抑制处理，随后使用预先浸入念珠菌悬液的口腔拭子对小鼠舌部进行接种 C. albicans 细胞悬液。给予四环素 通过 实验期间，小鼠可自由饮用饮水。真菌接种后第5天，将小鼠随机分为八组；另设第九组未处理且未感染的小鼠作为阴性对照组（n = 5）。采用三种浓度（20 µM、40 µM 和 80 µM）的姜黄素类化合物混合物，并结合蓝光LED（89.2 mW/cm²）进行处理²；~455 nm）以及无光照（分别为 C+L+ 和 C+L- 组）。单独光照（C-L+）、无任何处理（C-L-）以及未感染动物作为对照组进行评估。数据采用 Welch's ANOVA 和 Games-Howell 检验进行分析（α = 0.05）。所有感染动物均成功建立口腔念珠菌病模型，并通过舌背出现典型白色斑块或假膜在宏观上得以观察。组织病理学切片显示，C-L- 组中大量酵母和菌丝局限于上皮角化层；而在接受 40 µM 或 80 µM 姜黄素类化合物介导的 aPDT 治疗的小鼠图像中，真菌细胞的存在在视觉上明显减少。80 µM 姜黄素类化合物介导的 aPDT 实现了 2.47 log 的降低₁₀ 与C-L-组相比，菌落计数减少（p = 0.008）。其他所有组均未显示菌落数量的统计学显著减少，包括仅使用光敏剂（C+L-）或仅使用光照（C-L+）的组别。姜黄素介导的抗菌光动力疗法减少了小鼠舌部的真菌负荷。

引言

口腔念珠菌病（OC）是口腔主要的真菌感染，由念珠菌属真菌过度生长引起 假丝酵母 spp. 口腔念珠菌病的易感因素包括内分泌功能障碍、广谱抗生素的使用、放疗和化疗、营养缺乏、口干症（唾液流量降低）、义齿佩戴、口腔卫生不良，尤其是免疫抑制状态。¹. 在……之中 假丝酵母 物种, 白色念珠菌 是最常见且毒力最强的一种；它在人体内可作为共生菌存在，也可作为机会性病原体。 C. albicans 能够从共生酵母形态（芽生孢子）转变为致病性菌丝形态（菌丝和假菌丝）²菌丝状形态，尤其是菌丝，可通过内吞作用或主动侵入方式侵入宿主上皮细胞，从而引起感染³. 其他毒力因子 C. albicans 包括黏附、生物膜形成，以及脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和念珠菌溶素等脂解酶、水解酶和毒素的分泌⁴.

口腔念珠菌病（OC）的治疗涉及使用抗真菌药物，尤其是局部应用的多烯类和唑类药物（如制霉菌素和咪康唑）⁵。然而，这些药物仅表现出短期疗效，且复发频繁。此外，抗真菌药物的过度使用已导致抗真菌耐药性的产生与传播问题⁶。因此，亟需替代疗法，例如抗菌....

方案

本研究使用小鼠的研究方案已获得圣保罗州立大学（UNESP）阿拉拉夸拉牙科学院动物使用伦理委员会的批准（批准编号：05/2008 和 09/2020）。实验采用白色念珠菌（C. albicans，ATCC 90028）作为参考菌株。本研究共使用45只6周龄雌性瑞士小鼠（n = 45），体重范围为20–30 g。实验动物由巴西圣保罗州立大学（UNESP）博图卡图校区提供。

1. 光动力疗法中光敏剂的制备与光源的选择

1. 根据待测物质的规格制备光敏剂（PS）。
   注意：本研究中使用了一种水溶性姜黄素类化合物混合物（基于姜黄素的水溶性盐混合物¹²）作为光敏剂（参见材料表和图1）。使用前立即用超纯水配制20 µM、40 µM和80 µM（分别为15.6、29.2和58.4 mg/L）的稀释液，并于5 °C保存。
2. 选择具有合适波长（与光敏剂吸收波长相同）、能够均匀且同时照射整个光敏化靶区而不引起组织加热的光源设备。
   ​注意：本研究使用了由巴西圣卡洛斯圣保罗大学圣卡洛斯物理研究所（Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, ....

结果

小鼠OC模型显示，所有感染小鼠的舌头上均出现典型的白色斑块和假膜（图4A）。从C-L-动物中回收的C. albicans证实了该微生物对组织的定植（菌落数量范围为1.62 × 10⁴ 至 4.80 × 10⁵ CFU/mL）。与预期一致，NCtr组动物在取样后未显示任何组织改变或菌落生长（图4B）。

当使用80 µM姜黄素类化合物作为光敏剂时，aPDT降低了白色念珠菌（C. albicans）的存活率（图5）。与C-L-组相比，80 µM光敏剂介导的aPDT实现的平均log₁₀减少值为2.47（p = 0.008）。

在未接受光照的姜黄素处理组（C+L- 组）、仅接受光照但未进行光敏化的处理组（C-L+ 组）以及未处理组小鼠（C-L.......

讨论

C. albicans 与免疫功能低下者、糖尿病患者、长期使用抗生素者以及口腔卫生不良者的口腔和食管感染相关^1,3。人类传染性疾病的研究需要在开展临床试验之前，进行体外（in vitro）和体内（in vivo）的研究，以确保试验设计的安全性和准确性。本研究描述了一种建立小鼠口腔念珠菌病（OC）模型的方法，可用于评估 C. albicans 引起的口腔感染的发病机制以及抗真菌治疗策略的有效性^{15,16,17,18,19}。

本研究中采用的小鼠OC模型已成功建立，这通过从病灶中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C. albicans	美国模式培养物集存库（ATCC，Rockville，Md，USA）	90028	用于制备念珠菌接种物
离心机	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R，B. Braun，Melsungen，Hesse，德国	022628146 (NA)	用于制备念珠菌接种物
氯丙嗪氯化物 2 mg/mL	巴西圣保罗州阿拉拉夸拉的药房配制	-	用于在接种白色念珠菌期间使动物镇静
基于姜黄素的水溶性盐	PDTPharma，巴西克雷文斯	-	由53.4%的天然姜黄素组成，以及  46.6% 的其他姜黄素类物质（去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素）。以水和N-甲基-D-葡萄糖胺配制（最终平均分子量为730.32 g·mol⁻¹）−1)
数字菌落计数器	CP 600 Plus，Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda，巴西圣保罗州阿拉拉夸拉	-	用于计数琼脂平板上的菌落
挤压成型的小鼠饲料	Benelab 饲料，Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda.，Lindóia, Sã巴西圣保罗州	-	用于小鼠喂养
盐酸氯胺酮 10%	氯胺酮 Agener，União Quí米卡制药ê乌蒂卡国家股份有限公司，恩布瓜ç巴西圣保罗	-	用于在动物实验前进行麻醉  治疗和安乐死
发光二极管手柄（原型）	中国台湾 F研究所í西卡 de São Carlos，S大学ã圣保罗，São Carlos, SP, 巴西	-	使用LXHL-PR09型Luxeon III发光器（Lumileds Lighting，美国加利福尼亚州圣何塞）制备
醋酸甲泼尼龙 40 mg	DEPO-MEDROL，辉瑞，纽约	-	用作免疫抑制剂
切片机	Leica Microsystems，美国伊利诺伊州班诺克本	SM2500	用于切割舌组织的连续切片
丙烯箱（笼具 housing）H13 × L20 × D30 cm	邦瑟设备，里贝朗ão 巴西普雷图	-	用于在整个实验过程中饲养动物  实验周期
含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂	HiMedia，孟买，印度	MM1067-500G	用于酵母生长的培养基（琼脂）
分光光度计	分光光度计 Kasvi K37-VIS, São José 巴西多斯皮尼亚伊斯	K37-VIS	用于标准化接种物浓度
盐酸四环素	巴西圣保罗州阿拉拉夸拉的药房配制	-	用于诱导口腔菌群失调的抗生素
木屑	J.R. 木屑，Comerce of Sawdust Ltda. 公司，Conchal，Sã巴西圣保罗州	-	用于 housing boxes 内部的地面覆盖
2% 赛拉嗪	Calmiun, União Quí米卡制药ê乌蒂卡国家股份有限公司，恩布瓜ç巴西圣保罗	-	与氯胺酮联合用于麻醉
酵母氮源肉汤	Difco，InterLab，底特律，密歇根州，美国	DF0919-07-3	酵母生长培养基（液体）
酵母提取物蛋白胨葡萄糖肉汤	NutriSelect Basic，Sigma Aldrich	Y1375	用于在 -80 保存菌株的培养基°C 和生长