在细胞周期的 G1 期可视化单链 DNA 病灶

为了维持生命，细胞不断调查和修复DNA，以保持其基因组完整性。由于DNA应激源的内源性（例如氧化、烷基化、脱氨化、复制错误）和外源性（例如紫外线、电离照射）来源，细胞可能会积累各种类型的DNA损伤。未能修复这些病变会导致细胞凋亡、细胞周期停滞或衰老，并可能导致疾病¹。DNA损伤可以通过以下任何一种主要的DNA修复途径来解决:DR（直接逆转修复），主要修复烷基化碱基²;BER（碱基切除修复），针对非大块 DNA 碱基错误和单链 DNA 断裂 （SSB）³;NER（核苷酸切除修复）矫正体积庞大、螺旋扭曲的 DNA 损伤⁴;MMR（错配修复）主要针对 DNA 错配、插入/缺失环 （IDL） 和某些碱基损伤⁵;NHEJ（非同源末端连接）和 HRR（同源重组修复）在双链 DNA 断裂 （DSB） 处均具有活性⁶;TLS（跨病变合成），这是一种DNA病变旁路机制⁷。尽管这些途径具有不同的底物特异性，但它们之间存在某些重叠，以确保冗余以实现有效修复。了解不同 DNA 修复途径在不同细胞周期阶段的作用至关重要，因为这些 DNA 修复因子可以作为治疗癌症、衰老和神经系统疾病的治疗方法的重要靶标 ^8,9。

单链 DNA （ssDNA） 是由于内源性和外源性 DNA 损伤剂产生的 DNA 损伤的修复而在整个细胞周期中产生的。在遗传毒性应激下，ssDNA 在 HRR 和 MMR 活性最高的 S 期和 G2 期大量生成，当遇到 DNA 损伤时复制机制停滞或崩溃时 ^6,10,11。其他 DNA 修复途径（例如，NHEJ/微同源介导的末端连接 （MMEJ）/单链退火 [SSA]）也在 DSB 修复过程中产生 ssDNA¹²。这些 ssDNA 轨迹通常来自 DNA 切除，由 HR 和 MMR 期间的 EXO1、DNA2 和 CtIP 等核酸外切酶、NER 期间的 XPF 和 XPG 等核酸内切酶或 BER^{4、13、14、15、16、17、18、19} 期间的 POLB 和 FEN1 的联合作用进行.由于复制机制的工作，当DNA解旋酶在PCNA结合的复制聚合酶²⁰前面展开DNA时，也会产生ssDNA轨迹。相反，在 G1 期，HRR 和 DNA 复制的缺乏以及 MMR 的有限活性降低了生成的 ssDNA 轨迹的范围，因此检测更具挑战性 10,11,21。

细胞 ssDNA 轨道是高度敏感的结构，必须加以保护以避免 DSB 的形成。这是通过用 RPA 涂覆 ssDNA 轨道来实现的。RPA 是一种丰富的异源三聚体蛋白复合物，由多个亚基（RPA1、RPA2 和 RPA3，也称为 RPA70、RPA32 和 RPA14）组成，它们在整个细胞周期中普遍表达²²。每个 RPA 亚基都包含一个 DNA 结合域 （DBD），能够与 4-6 个核苷酸相互作用，组合后的亚基形成稳定的三聚体化核心。RPA 总共与大约 20-30 个核苷酸结合，具有亚纳摩尔亲和力^23,24。

常规方法使用免疫荧光 （IF） 显微镜，通过使用 BrdU 抗体标记掺入基因组 DNA 中的 5-溴-2'-脱氧尿苷 （BrdU） 来可视化 ssDNA 病灶²⁵。这种方法依赖于这样一个事实，即 BrdU 抗体只能检测暴露的 ssDNA²⁵ 中的 BrdU。尽管这种方法很简单，但它也显示出某些局限性。例如，在实验开始前对细胞进行预处理以掺入BrdU，这很耗时，并且会干扰下游效应器。因此，基于BrdU的ssDNA检测仅限于复制细胞，不能用于静止细胞。这不包括该方法在非复制细胞中研究DNA修复的应用，尽管它在癌症和神经退行性变等多种疾病中很重要^5,26。此外，由于 BrdU 和 EdU 的结构非常相似，大多数 BrdU 抗体对 EdU 表现出交叉反应性，这在进行双标记实验时必须考虑²⁷。RPA染色以前主要用于显示S期细胞中的ssDNA病灶;然而，一些论文也成功地在S阶段28,29,30,31,32,33,34,35之外使用它。以下方案有效地利用了RPA的特性，允许在细胞周期的G1期（尽管它可用于所有细胞周期阶段）中DNA损伤后的ssDNA病灶的可视化。

1. 维持 hTERT 永生化视网膜色素上皮细胞 （RPE1）

1. 将 RPE1 细胞系维持在补充有 10% 热灭活胎牛血清 （Hi-FBS） 和 100 μg/mL 青霉素-链霉素（从现在开始称为培养基）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，在 37 °C 下含有 5% CO₂ 的加湿培养箱中。 对于常规培养，在 15 cm 组织培养处理的培养皿中培养 RPE1 细胞，并在达到 80-90% 汇合度时分裂（~16-18 ×每 15 cm 培养皿^{10 6} 个细胞）。
2. 分裂时，取出培养基并用 10 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗细胞。
3. 加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 以覆盖培养皿的整个表面。用胰蛋白酶将细胞保持在37°C，直至它们分离。
4. 胰蛋白酶消化后，用培养基重悬细胞，并在室温（RT，22-25°C）下以150× g 旋转5分钟。除去上清液，将细胞轻轻重悬于10mL培养基中。
5. 将 1.6-1.8 ×^{10 6} 个细胞接种到新的 15 cm 培养皿（~1 mL 细胞悬液）中。
   注意:所有组织培养工作均应在 BSL-2 安全水平下进行。胰蛋白酶消化的孵育时间取决于细胞汇合度。通常，对于 90% 汇合板，该过程需要 2-3 分钟才能完成。应使用市售试剂盒定期筛查细胞 是否存在支原体 污染（参见 材料表中的示例）。

2. 目的基因 （GOI） 的 siRNA 敲低

1. 在转染前一天，将 1.0 ×^{10 6} 个 RPE1 细胞接种到 10 cm 组织培养处理的培养板中，加入 10 mL 培养基。
2. 在转染当天，复合siRNA。对于 10 cm 板，在 500 μL 低血清转染培养基中使用终浓度为 20 nM siRPA2 和 12 μL 脂质转染试剂。轻弹试管轻轻混合所有组分，并在室温（22-25°C）下孵育5分钟。
3. 将复合的siRNA混合物滴加到细胞中，并将细胞与siRNA一起孵育48小时。

3. RPE1细胞同步进入G0期

1. 如第 1 节所述，从步骤 2.3 开始胰蛋白酶消化 RPE1 细胞（~2 × 10⁶ 个细胞）。
2. 将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，并以 150 × g、室温 （22-25 °C） 离心 5 分钟。
3. 除去上清液并将细胞重悬于 12 mL PBS 中。在室温（22-25°C）下以150× g 离心细胞5分钟。重复除去上清液并离心两次。
4. 将细胞重悬于补充有 100 μg/mL 青霉素-链霉素、 1 mM 丙酮酸钠、15 mM HEPES 的 10 mL 无血清 DMEM 中，并将它们铺板到 10 cm 组织培养皿上。
   注意:如果细胞倾向于结块，请将它们重悬于仅 1 mL 无血清的 DMEM 中，并使用 P1000 吸头上下移液 5 次以去除团块，然后将悬浮液稀释至最终体积为 10 mL。
5. 血清饥饿 24 小时后，通过将复合的 siRNA 添加到血清饥饿细胞中，使用与第 2 节中描述的相同的程序引入第二轮沉默。
6. 在进行G1释放之前，将RPE1细胞保持在无血清DMEM中72小时。

4. 盖玻片涂层并将细胞释放到 G1 期

1. 用70%乙醇对镊子进行灭菌，并将单个玻璃盖玻片（直径12mm，#1.5厚度[0.17mm]）放入24孔板的孔中。
2. 用PBS稀释玻连蛋白包被基质，以获得10μg/mL的终浓度。将 500 μL 玻连蛋白溶液加入每个含有盖玻片的孔中，并在室温下孵育 1 小时。
3. 去除包衣溶液并用 1 mL PBS 洗涤盖玻片。
4. 在PBS在37°C下洗涤1分钟后，使用1mL0.05%胰蛋白酶从10cm组织培养的处理板中分离血清饥饿的RPE1细胞。
   注意:血清饥饿后细胞分离得更快。用PBS洗涤细胞时要小心，并使用较短的胰蛋白酶消化时间。
5. 为了灭活胰蛋白酶，将 RPE1 细胞重悬于总共 6 mL 的培养基中。通过在室温（22-25°C）下使用150× g 旋转细胞5分钟来除去灭活的胰蛋白酶。
6. 将细胞重悬于 1 mL 培养基中并测量细胞数量。
7. 将 4 ×^{10 4} 个 RPE1 细胞接种到包被的盖玻片上，在总共 500 μL 的培养基中。
   注意:在进行下游步骤之前，请确保细胞活力高于 90%。在细胞计数步骤中，可以通过台盼蓝染色快速评估细胞活力。
8. 将细胞接种到培养基中 6 小时后，G0 释放的细胞将处于早期 G1 期。在细胞开始进入S期之前，在G1中进行6-12小时的实验。
9. 在引入DNA损伤之前，用10μM5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）在37°C下脉冲细胞30分钟，在培养基中稀释。
10. 除去含有EdU的培养基，并在37°C下用10μM胸苷追逐细胞10分钟，以防止在DNA损伤诱导过程中剩余的EdU掺入。
11. 用胸苷除去培养基，并用250μM H_2O2处理细胞1小时，在培养基中稀释。

5. ssDNA的免疫荧光染色

1. 用 1 mL RT （22-25 °C） PBS 洗涤细胞一次，以除去培养基和血清成分。
   注意: 洗涤细胞时要轻柔，以免脱落和干燥。不要同时处理多个孔。
2. 提取前:将洗涤后的细胞在室温（22-25°C）下在1mL CSK提取缓冲液（表1）中孵育5分钟。
   注意:CSK预提取去除所有非染色质结合蛋白，包括可溶性RPA2。
   注意: Triton X-100 如果吞咽是有害的，可能会引起皮肤刺激和眼睛损伤。
3. 从细胞中除去CSK缓冲液，并通过在室温（22-25°C）下加入0.5mL含有0.05%Triton X-100的0.5mL含有0.05%Triton X-100的3.6%多聚甲醛溶液（在PBS中）直接固定它们。
   注意:从32%的PFA原料中制备3.6%的PFA是很重要的。多聚甲醛可能会引起严重的眼睛损伤、皮肤刺激和呼吸道刺激。
4. 用含有 0.05% Triton X-100 的 1 mL PBS 洗涤细胞一次以除去 PFA。
5. 在室温（22-25°C）下，使用含有0.5%Triton X-100的1mL PBS进一步透化细胞15分钟。
6. EdU click-IT 反应可视化复制细胞（S 期）
   1. 除去透化溶液，用1mL封闭缓冲液洗涤细胞2次（表1）。
      注意:牛血清白蛋白 （BSA） 可能会引起呼吸道刺激。
   2. 加入1mL封闭缓冲液（表1），并在室温（22-25°C）下轻轻摇晃含有盖玻片的板10分钟。
   3. 取出封闭缓冲液，加入500μL含有吡啶酰叠氮化物647的点击反应混合物（表1）。使用轻轻摇动将盖玻片在室温（22-25°C）下孵育30分钟，并在黑暗中进行下游孵育。
      注意:使用 BrdU 抗体时，按照制造商的建议，使用双倍的量 （1 mL） 和时间（60 分钟）进行点击反应，以确保反应饱和并标记掺入的 EdU。这限制了 BrdU 抗体的交叉反应性²⁷。
7. 除去点击反应混合物，并在室温（22-25°C）下用含有0.05%Triton X-100的PBS洗涤细胞2次10分钟（图1 和 图2）。
8. 加入 1 mL 封闭缓冲液，并在室温 （22-25 °C） 下孵育 30 分钟。或者，将细胞保持在4°C的封闭缓冲液中过夜。
9. 在室温（22-25°C）下在250-500μL封闭缓冲液中轻轻摇动，施加一抗（抗RPA2大鼠，1:1,000稀释度）2小时。
10. 用含有 0.05% Triton X-100 的 PBS 洗涤细胞 2 次，以快速除去大部分抗体溶液。
11. 在室温（22-25°C）下用封闭缓冲液继续洗涤细胞3×10分钟。
12. 在室温（22-25°C）下将二抗（抗大鼠Alexa-488,1:1,000稀释度）在250-500μL封闭缓冲液中轻轻摇晃2小时。
13. 用封闭缓冲液洗涤细胞 2x，以快速除去大部分二抗。在室温（22-25°C）下继续用含有0.05%Triton X-100的PBS洗涤细胞3×10分钟。
14. 为了对细胞核进行复染，用含有0.05%Triton X-100和1μg/ mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS在室温（22-25°C）下洗涤细胞10分钟。在室温（22-25°C）下用PBS洗涤细胞5分钟。
15. 使用 10 μL 封固剂/盖玻片将盖玻片安装到显微镜载玻片上。在安装之前将盖玻片浸入蒸馏水中以去除任何盐晶体。第二天对载玻片进行成像，并将其在4°C下储存数周（图3）。

6. 图像采集和定量

1. 要捕获图像，请使用任何配备常规滤光片组的可用落射荧光显微镜，以至少 60-63 倍的放大倍率、高数值孔径和油物镜对 DAPI、FITC 和 Cy5 通道进行成像，以可视化核病灶。
   注意:最佳DAPI激发为~359 nm;Alexa 488 激发波长为 ~488 nm;而 Alexa 647 激发为 ~647 nm。
2. 要进行图像分析，请在 Fiji/ImageJ 中打开图像文件。
   1. 使用DAPI染色制作核掩膜（图4A-F和补充视频S1）。
      1. 打开 DAPI 映像。
      2. 选择 "工艺"|"增强对比度 并将 饱和像素 设置为 0.35。
      3. 单击 "进程"|"二进制 |转换为蒙版。选择 二进制 |填充孔 洞，然后单击 分析 |分析颗粒。 将大小 设置为 10-Infinity。
      4. 在 ROI 管理器中，单击显示 全部。
   2. 在细胞核中寻找 RPA2 病灶（图 4G，H 和补充视频 S1）
      1. 打开 RPA2 映像。
      2. 选择 "流程"|"找到 Maxima.将 突出 显示 RPA2 焦点（介于 500 和 750 之间）的值，将其与背景分开。
      3. 最后，单击 Measure 按钮在 ROI 管理器。
      4. 通过将 RawinDen 列中的值除以 255 （每个焦点中像素强度的最大值）来计算核 ssDNA 病灶的总数。
   3. 使用首选的统计软件工具执行统计分析。
      注意:从分析中排除所有 EdU 阳性细胞和未正确分割的 DAPI 掩模。

为了克服在 G1 中检测 ssDNA 的局限性，我们使用了 RPA2，它增强了 ssDNA 病灶检测的特异性和强度35。为了实现精确的细胞同步，我们使用了可以有效血清饥饿并同步到 G0 期的 RPE1 细胞。然后可以通过在血清剥夺后添加血清来诱导它们重新进入细胞周期。为了确认同步效率，我们用EdU标记细胞，用碘丙啶标记其DNA含量。我们通过流式细胞术进一步收集了定性和定量结果（补充图S1A）。点图显示，血清饥饿 72 小时后，~98% 的细胞处于 G0 期。加入含血清培养基6小时后，细胞重新进入细胞周期（如图1A中p27水平的增加所示），G1中具有~97%的细胞，而S期只有<1%的细胞，G2期有<2%的细胞（补充图S1A）。将血清添加到细胞中20-28小时后，它们逐渐通过S期，如流式细胞术图所示（补充图S1A）。该细胞同步方案给出 ~97% 纯 G1 群体（血清饥饿 72 小时后血清添加后 6 小时）。为了进一步验证同步效率，我们使用蛋白质印迹法（图1A和补充图S1B）比较血清释放后细胞周期标志物的表达，并同时进行EdU掺入测定以可视化DNA复制。EdU染色还突出了同步效率和G1期DNA复制的缺乏（图1B，C）。

检测哺乳动物细胞中 ssDNA 的常规方法依赖于检测 ssDNA 中的 BrdU。 图2A 表明，在H2O2 和新卡嗪抑素（NCS）处理下，BrdU病灶仅在S期细胞中检测到，而在非S期细胞中未检测到ssDNA病灶。BrdU抗体染色还显示出明显的核仁背景染色，可以在所有细胞核中检测到，与细胞周期阶段或应用的处理无关。使用此处描述的 EdU 点击协议，我们无法检测到共定位的 EdU 和 BrdU 病灶，这在 图 2A 的未经处理的样品中很明显。为了完全排除任何由交叉反应性引起的BrdU信号，我们避免了EdU标记，而是使用细胞周期蛋白A2作为S-G2标记物。然而，细胞周期蛋白 A2 染色不允许 CSK 预提取，在这种情况下，即使在遗传毒性应激之后，我们也没有看到任何 BrdU 病灶（补充图 S2A）。这凸显了CSK预提取对于基于抗BrdU的ssDNA染色是必要的。作为对照，我们在变性条件下测试了BrdU抗体染色。这打开了 DNA 以暴露掺入的 BrdU，这表明 BrdU 被均匀掺入（补充图 S2B）。

相比之下，RPA2染色不仅在S期，而且在其他细胞周期期显示NCS和H2O2依赖性病灶形成（图2B）。作为对照，我们还用胡处理细胞，这仅导致ssDNA在经历复制的细胞中积累。正如预期的那样，我们仅在EdU阳性细胞中检测到使用RPA2抗体进行胡处理时信号增加，这突出了这种方法的特异性。在没有外源性遗传毒性应激的情况下，RPA2 抗体还可以检测复制过程中自然发生的 ssDNA 形成（图 2B）。RPA2 抗体的高灵敏度促使我们尝试在 G1 期使用它，在 G1 期，传统的 BrdU 染色无法检测到遗传毒性应激的任何信号（补充图 S2C）。 图 3A 显示，当使用抗 RPA2 抗体时，即使在 G1 中，也可以检测到 H2O2 处理后 ssDNA 病灶的形成。H2O2 处理后，这些细胞核中的RPA2病灶数量显着增加（图3B）。这些病灶是 RPA2 特异性的，因为 RPA2 的沉默消除了 IF 信号（图 3A、B）。 图3C 和 补充图S1C 显示了这些细胞中RPA2沉默的效率。与传统方法相比，基于RPA2的ssDNA检测具有高度的灵敏度，因此其应用可以扩展到G1期细胞。

图 1:血清饥饿后 RPE1 细胞的同步效率。 （A） 免疫印迹显示异步、G1 和 S 期同步 RPE1 细胞中指示的蛋白质水平。（B） 代表性图像显示异步、G1 和 S 期同步的 RPE1 细胞，这些细胞在固定前暴露于 10 μM EdU 30 分钟并通过 Click-IT 反应可视化。DAPI用于对核DNA进行复染。比例尺 = 50 μm。 （C） 图表显示了 EdU 阳性细胞占 DAPI 评估的总细胞群的百分比。误差线表示平均值的标准误差，分析的原子核数如下:AS n = 219，G1 n = 630，S n = 437。缩写:RPE1 = hTERT永生化的视网膜色素上皮细胞;AS = 异步;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:DNA 损伤时使用 BrdU 抗体或 RPA2 抗体进行 ssDNA 检测。 （A） 代表性图像使用 αBrdU（绿色）显示 ssDNA 病灶，S 期细胞由 EdU（紫色）突出显示，DAPI 用于对核 DNA 进行复染（蓝色）。在进行任何额外处理之前，将RPE1细胞保持在10μM BrdU中48小时。48 小时后，用 10 μM EdU 脉冲细胞 30 分钟，然后用 H2O2 （250 μM） 处理 1 小时或新卡齐诺抑素 （0.5 μg/mL） 4 小时。在CSK预提取后固定细胞。白色虚线表示每个原子核的边界。比例尺 = 5 μm。右侧的面板是指示的 S 相或非 S 相核的放大图像。（B） 代表性图像显示了使用 αRPA2 抗体（绿色）的 ssDNA 病灶。S期细胞由EdU（紫色）突出显示，DAPI用于对核DNA（蓝色）进行复染。用 10 μM EdU 脉冲 RPE1 细胞 30 分钟，然后用 1 小时 H2O2 （250 μM）、4 小时羟基脲 （2 mM） 或 4 小时 NCS （0.5 μg/mL）。在CSK预提取后固定细胞。白色虚线表示每个原子核的边界。比例尺 = 10 μm。右侧的面板是指示的 S 相或非 S 相核的放大图像。缩写:ssDNA = 单链 DNA;BrdU = 5-溴-2'-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;RPE1 = hTERT永生化的视网膜色素上皮细胞;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;NCS = 新卡齐诺他汀;胡 = 羟基脲。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:使用 RPA2 抗体检测 G1 期的 ssDNA 病灶。 （A） 用靶向 RPA2 或非靶向 siRNA 对照转染 RPE1 细胞，随后在 G1 中同步并用 10 μM EdU 脉冲标记 30 分钟，然后用 H2O2 （250 μM） 处理它们 1 小时。DAPI用于对核DNA进行复染。在CSK预提取后固定细胞。白色虚线表示每个原子核的边界。比例尺 = 5 μm。 （B） RPA2 病灶/细胞核数量的测量来自两个独立的实验。在分析过程中仅考虑了 EdU 阴性细胞。线表示图上的平均值。进行非参数方差分析（Kruskal-Wallis）进行统计分析。星星表示 P < 0.0001。分析的细胞核数如下:siNT no H2O2 n = 513，siNT H2O2 n = 603，siRPA2 no H2O2 n = 266，siRPA2 H2O2 n = 536。（C） siRNA 敲低的效率显示在免疫印迹中。缩写:siNT = 非靶向 siRNA 对照;BrdU = 5-溴-2'-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;RPE1 = hTERT永生化的视网膜色素上皮细胞;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。 请点击这里查看此图的较大版本.

图4:使用斐济对ssDNA病灶进行定量。斐济的详细步骤，展示了如何评估细胞核中的RPA2病灶数量。（A-E）使用 DAPI 通道创建核掩模。（F-H）阈值从背景信号中识别单个核 ssDNA 病灶。缩写:ssDNA = 单链 DNA;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:该协议中使用的缓冲液的组成。

补充图S1。 （A） 使用血清饥饿将 RPE1 细胞同步到 G0 期 72 小时，随后通过重新引入血清释放到不同的细胞周期阶段。点图显示处于 G0/G1、S 或 G2/M 期的细胞，其中小时表示血清饥饿后重新添加血清后的时间。右图显示了每种条件下 G0/G1、S 和 G2/M 细胞的百分比。根据制造商的建议，使用市售的 EdU 和碘化丙啶的细胞增殖试剂盒进行 FACS 分析。（B） 图 1 的未裁剪蛋白质印迹扫描。数字显示分子量标记，单位为kDa。PARP1 被用作上样对照，并通过切割膜上样到凝胶上，该凝胶也针对 CCNA2、p27（进一步剥离为 PCNA）和 pH3 （S10）（进一步剥离为 H3）开发。将CCNB1和RPA2上样到单独的凝胶上，使用相同量的蛋白质裂解物以确保可比性。（C） 图 3 的未裁剪蛋白质印迹扫描。数字显示分子量标记，单位为kDa。缩写:EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。 请点击此处下载此文件。

补充图S2:（A）使用BrdU抗体（绿色）的代表性图像显示了ssDNA病灶;S 期细胞由细胞周期蛋白 A2（红色）突出显示;DAPI用于对核DNA（蓝色）进行复染。在进一步治疗之前，将RPE1细胞保持在10μM BrdU中48小时。48小时后，用H2O2 （250μM）处理细胞1小时或新卡嗔他汀（0.5μg/ mL）4小时，然后固定。白色虚线表示每个原子核的边界。比例尺 = 5 μm。 （B） 有和没有变性条件的 RPE1 细胞的 BrdU 染色。异步 RPE1 细胞用 10 μM BrdU 预处理 48 小时。比例尺 = 10 μm。 （C） BrdU 病灶/细胞核数量的测量来自 G1 同步 RPE1 细胞中的两个独立实验。在分析过程中仅考虑了 EdU 阴性细胞。线表示图上的平均值。进行非参数方差分析（Kruskal-Wallis）进行统计分析。"ns"表示无显著差异。分析的原子核数如下:NT n = 52，NCS n = 105，H2O2 n = 82。缩写:siNT = 非靶向 siRNA 对照;BrdU = 5-溴-2'-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;RPE1 = hTERT永生化的视网膜色素上皮细胞;NCS = 新卡司他汀。 请点击此处下载此文件。

补充视频 S1:基于斐济的 RPA2 病灶分析的屏幕录制。请点击此处下载此文件。

作者没有要声明的竞争利益。