铜绿假单胞菌产铁载体的定性与定量分析

摘要

该方案可对总铁载体、绿脓菌素和嗜铁素进行定性和定量分析 铜绿假单胞菌.

摘要

Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）因其可产生多种毒力因子而在宿主体内引发感染。其中一种机制是通过产生铁载体来获取铁元素。P. aeruginosa 可产生两种不同的铁载体：嗜铁素（pyochelin），其结合铁的能力较弱；以及绿脓菌素（pyoverdine），其结合铁的能力较强。本报告表明，绿脓菌素可直接从细菌上清液中定量检测，而嗜铁素则需先从上清液中提取后再进行定量。

定性分析铁载体产生的主要方法是铬天青S（Chrome Azurol Sulfonate, CAS）琼脂平板实验。在该实验中，Fe³⁺-染料复合物释放CAS染料，导致颜色由蓝色变为橙色，表明有铁载体产生。为了定量总铁载体含量，将细菌上清液与CAS染料等比例混合后加入微孔板，随后在630 nm处进行分光光度分析。绿脓菌素（pyoverdine）的定量则通过将细菌上清液与50 mM Tris-HCl等比例混合后直接进行分光光度分析完成；在380 nm处出现吸收峰可确认其存在。至于嗜铁素（pyochelin），无法直接从细菌上清液中定量，因此需先进行提取，再经分光光度分析检测其存在，其特征吸收峰位于313 nm处。

引言

生物体需要铁来执行多种重要功能，例如电子传递和DNA复制¹。Pseudomonas aeruginosa是一种革兰氏阴性机会性病原菌，已知其具有多种毒力因子，可在宿主体内建立感染，其中一种机制是产生铁载体²。在缺铁条件下，P. aeruginosa会释放一类称为铁载体的特化分子，从周围环境中夺取铁。铁载体在细胞外螯合铁，形成的高铁-铁载体复合物被主动转运回细胞内³。

P. aeruginosa 能够产生两种铁载体：绿脓菌素和嗜铁素。绿脓菌素的铁螯合亲和力较高（1:1），而嗜铁素的铁螯合亲和力较低（2:1）⁴。由于嗜铁素的铁螯合亲和力较低，也被称为次要铁载体⁵。P. aeruginosa 中铁载体的产生和调控由群体感应（Quorum Sensing, QS）系统主动调控⁶。

除了铁淬灭作用外，铁载体还参与调控毒力因子，并在生物膜形成中发挥积极作用⁷。铁载体还具有其他关键功能，包括参与细胞信号传导、抵御氧化应激，以及促进微生物群落之间的相互作用⁸。铁载体通常根据其螯合铁的特定功能基团进行分类。在此分类中，三种主要的双齿配体为儿茶酚盐、羟肟酸盐和α-羟基羧酸盐³。绿脓菌素是荧光假单胞菌属（如 P. aeruginosa 和 P. fluorescens）的典型特征⁵。它由一种混合的绿色荧光发色团与一个含6-12个氨基酸的寡肽连接而成。其合成过程涉及多个非核糖体肽合成酶（NRPs）⁹。参与绿脓菌素合成与调控的四个基因为 pvdL、pvdI、pvdJ 和 pvdD¹⁰。绿脓菌素还在哺乳动物感染和致病性中起重要作用¹¹。P. aeruginosa 在中度缺铁条件下产生嗜铁素，而在严重缺铁环境中则产生绿脓菌素¹²。参与嗜铁素合成的两个操纵子为 pchDCBA 和 pchEFGHI¹³。研究表明，在吩嗪（pyocyanin）存在的情况下，嗜铁素（儿茶酚盐类）会诱导氧化损伤和炎症反应，并产生对宿主组织有害的羟基自由基¹¹。

铬天青 S（Chrome Azurol Sulfonate, CAS）法因其全面性、高灵敏度以及相比微生物检测法更高的便捷性而被广泛采用，尽管微生物检测法虽然灵敏，但可能过于特异¹⁴。CAS 法可在琼脂表面或溶液中进行，其原理基于三价铁离子从深蓝色复合物转变为橙色时发生的颜色变化。CAS 比色法通过测定 Fe-CAS-表面活性剂三元复合物中铁的消耗量来定量。该特定复合物由金属、有机染料和表面活性剂组成，呈蓝色，在 630 nm 处具有吸收峰。

本报告介绍了一种用于定性检测嗜铁素产生的方法，可在琼脂平板上检测嗜铁素的产生。同时提供了一种在微量滴定板中对总嗜铁素产量进行定量估算的方法，以及对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）产生的两种嗜铁素——绿脓菌素（pyoverdine）和嗜铁菌素（pyochelin）——进行检测和定量分析的方法。

方案

P. aeruginosa 的所有细菌分离株均来自印度瓦多达拉和斋浦尔的医学微生物学实验室。所有选定的临床分离株均在生物安全柜（BSL2）中操作，实验过程中处理细菌分离株时均采取了最严格的防护措施。材料表中提供了所有试剂/溶液的商业信息。

1. 铬天青S（CAS）染料和琼脂培养基的制备

1. 配制CAS染料（100 mL），其成分为：
   1. 将60 mg的CAS溶解于50 mL蒸馏水中（溶液1）。
   2. 将2.7 mg的FeCl₃·6H₂O溶解于10 mL的10 mM HCl中（溶液2）。
   3. 将73 mg的十六烷基三甲基溴化铵（HDTMA）溶解于40 mL蒸馏水中（溶液3）。
   4. 小心混合溶液1、溶液2和溶液3，储存于玻璃瓶中。
2. 按以下步骤配制CAS琼脂：
   1. 将100 mL MM9盐溶液加入750 mL蒸馏水中。
   2. 溶解32.24 g的哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)（PIPES）游离酸。
   3. 加入15 g琼脂粉，高压灭菌后冷却。
   4. 向混合物中加入30 mL无菌酪蛋白氨基酸溶液和10 mL无菌20%葡萄糖溶液。
   5. 加入100 mL CAS染料，混匀后在无菌条件下倒平板。
      注意：MM9培养基、酪蛋白氨基酸溶液和8-羟基喹啉的配制方法见补充文件1。PIPES缓冲液对pH敏感，只有在pH达到5.6时才会溶解。需持续监测pH，因为PIPES开始溶解时会进一步降低pH。用等体积的氯仿中含3%的8-羟基喹啉溶液萃取酪蛋白氨基酸，将不相溶的溶液在4 °C下静置约20分钟，并小心收集上层相，避免扰动下层相。

2. 铁载体产生的定性分析

1. 将培养24小时的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌液的OD₆₀₀ nm调至0.2。
2. 使用无菌接种环，将细菌培养物划线接种于CAS琼脂平板上。
3. 在30 °C下培养24小时。
   注意：可使用蛋白胨水培养基或0.8%生理盐水稀释菌液。若24小时后未观察到细菌生长，可将CAS平板继续培养48至72小时。

3. 总铁载体的定量估算

1. 将铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在蛋白胨水培养基中培养24小时后，调节其OD₆₀₀ nm至0.25，重新接种，并在30 °C下孵育48小时。
2. 孵育48小时后，在室温下以4650 × g离心细菌培养物10分钟。
3. 离心后，取100 µL无细胞上清液加入96孔微孔板中，再加入100 µL CAS染料。
4. 用铝箔覆盖微孔板，在室温下孵育20分钟。
5. 孵育结束后，在630 nm处进行分光光度读数。
6. 将测得的结果按总铁载体含量的百分比铁载体单位（PSU）进行计算。
   注：PSU的计算公式为：[(A_r  - A_s)/A_r] × 100
   其中，A_r 表示630 nm处对照组的吸光度，A_s 表示样品无细胞上清液的吸光度。对照组应将CAS染料加入未接种的蛋白胨水培养基中。所有玻璃器皿（如试管、烧瓶等）均需用6 M HCl浸泡2小时，并用蒸馏水冲洗两次，以去除其上残留的任何微量铁。

4. 绿脓菌素的定量估算

1. 将铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在蛋白胨水培养基中培养24小时后，调节其OD₆₀₀ nm至0.25，重新接种，并在30 °C下孵育48小时。
2. 孵育48小时后，在进行后续操作前，测定细菌生长的OD₆₀₀ nm值。
3. 在室温下，以4650 × g离心细菌培养物10分钟。
4. 离心后，取100 µL无细胞上清液加入96孔微孔板中，并加入100 µL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）。
5. 在OD₄₀₅ nm处进行分光光度读数。

5. 绿脓菌素的提取与分光光度法检测

1. 将铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在King's B培养基（补充文件1）中培养24小时后，调节OD₆₀₀ nm至0.25，重新接种，并在30 °C下孵育24小时。
2. 孵育24小时后，取100 mL培养物，在室温下以4650 × g离心10分钟。
3. 离心后，向上清液中加入5 mL 1 M柠檬酸，再用50 mL乙酸乙酯萃取两次。
4. 使用装有硫酸镁的注射器滤器过滤有机相，将过滤后的有机相储存于-20 °C。
5. 在320 nm处进行分光光度测定。
   注意：由于嗜铁素（pyochelin）在室温下极不稳定，萃取过程需在冰上操作。使用50 mL无菌注射器进行过滤分离，在注射器尖端放置棉花，并加入1 g硫酸镁。在注射器尖端安装无菌注射器滤器，将滤液收集至无菌试管中。

结果

在对临床分离株的铁载体进行定量分析之前，首先进行了铁载体产生的定性筛选，以确认其具有产铁载体能力。通过将细菌划线接种于CAS琼脂平板上，观察临床分离株中铁载体的定性检测结果。本研究选取了三种临床分离株MR1、TL7、J3以及参考菌株PAO1。所有三种临床分离株及PAO1均显示铁载体产生呈阳性，表现为蓝色琼脂表面菌落周围出现清晰的橙色晕圈（图1）。CAS琼脂上形成的晕圈（图1）可对临床分离株的铁载体产量进行粗略估计。因此，进一步采用CAS试剂结合液体培养基对铁载体产量进行了定量测定。

总铁载体的定量直接从无细胞上清液中进行。培养后观察到颜色变化，其中黄色表明CAS染料从铁复合物中被移除。此处以未接种的生长培养基中的CAS染料作为对照，用于铁载体的计算。分离株MR1和TL7在总铁载体产量上无显著差异，而与PAO1相比，J3的总铁载体产量显著增加（图2）。

接下来，直接从无细胞上清液中进行绿脓菌素的定量分析。绿脓菌素会释放到细胞环境中，因此使用无细胞上清液进行绿脓菌素的定量。同时利用分光光度计进行紫外光谱扫描，在380 nm处出现的吸收峰证实了绿脓菌素的存在（图3A）。在405 nm处进行分光光度读数，结果以OD₄₀₅/OD₆₀₀ nm表示。所有分离株均表现出绿脓菌素的产生能力，其中分离株MR1和J3的绿脓菌素产量显著低于PAO1，而TL7则未观察到显著差异（图3B）。

绿脓菌素无法直接从无细胞上清液中定量。从1 mL无细胞上清液中无法有效提取绿脓菌素，因此需从100 mL无细胞上清液中进行提取。提取时使用1 M柠檬酸酸化。由于绿脓菌素是一种高度不稳定的化合物，整个提取过程需在冰上操作。通过在300至600 nm波长范围内进行紫外扫描检测绿脓菌素，其中OD₃₂₀ nm处的吸收峰证实了绿脓菌素的存在（图4A）。绿脓菌素的定量通过在OD₃₂₀ nm处进行分光光度测定完成，计算方法为OD₃₂₀/OD₆₀₀的比值。分离株MR1、TL7和J3的绿脓菌素产量显著高于参考菌株PAO1（图4B）。

为检测不同培养基中细菌产生的总铁载体量，进行了多种细菌培养基中铁载体产量的比较研究。共选用四种不同培养基，其中LB培养基、King's B培养基和蛋白胨水均使用3% 8-羟基喹啉进行提取处理，而未提取的LB培养基也被选入本研究。在提取后的LB培养基、King's B培养基和蛋白胨水培养基之间，铁载体产量无显著差异；而在未提取的LB培养基中，铁载体产量表现出显著差异。

图1：在CAS琼脂上产铁载体的情况。 将培养24小时的P. aeruginosa菌液点种到CAS琼脂平板上，于30 °C培养24小时。菌落周围出现橙色晕圈表明有铁载体产生（PAO1、MR1、TL7和J3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：总铁载体产量。 对 PAO1 及三种临床分离株（MR1、TL7 和 J3）的总铁载体产量进行了评估。将 100 µL 无细胞上清液（来自在蛋白胨水培养基中培养 24 小时的 PAO1、MR1、TL7 和 J3）加入 96 孔微孔板中，随后加入 100 µL CAS 染料。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学显著性检验。误差线表示三次生物学重复之间的 ± 标准差（SD）。* 表示 p < 0.05；ns 表示 p > 0.05。请点击此处查看该图的放大版本。

图3绿脓菌素的产生 绿脓菌素的产生 P. aeruginosa 铜绿假单胞菌PAO1及临床分离株（MR1、TL7和J3）在胰蛋白胨水培养基中培养24小时后进行评估。将细菌培养物离心，取100 µL无细胞上清液加入96孔微孔板中，随后加入100 µL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）。采用紫外分光光度法在350 nm至600 nm波长范围内检测绿脓菌素，于380 nm处进行分光光度分析以测定绿脓菌素产量（A). 绿脓菌素产量的定量分析（B）。误差线表示三次重复实验的均值标准误。误差线代表三个生物学重复之间的±标准差（SD）。****对应于 p < 0.0001，**对应于 p < 0.01，而 ns 代表 p > 基于单因素方差分析（One-way ANOVA）检验，p < 0.05。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4：绿脓菌素的产生。 利用乙酸乙酯和硫酸镁提取法检测标准菌株PAO1（作为参照）及临床分离株（MR1、TL7 和 J3）产生绿脓菌素的情况。紫外-可见光谱分析范围为 230 nm 至 400 nm（A）。绿脓菌素的定量结果（B）。每种分离株均独立重复实验三次。误差线表示三次生物学重复之间的 ± 标准差（SD）。*** 表示基于单因素方差分析（One-way ANOVA）检验，p < 0.001。请点击此处查看该图的高清版本。

补充图1：不同细菌培养基中嗜铁素的比较产生情况。在四种不同的培养基中总嗜铁素的产生量，其中King's B培养基、蛋白胨水培养基和Luria肉汤均使用3% 8-羟基喹啉进行提取以去除其中的微量铁，而未提取的Luria肉汤也被选作对照。3% 8-羟基喹啉提取操作是通过向培养基中加入等体积的3% 8-羟基喹啉完成的。误差线表示三次生物学重复之间的±标准差（SD）。** 表示基于单因素方差分析（One-way ANOVA）检验，p < 0.001；ns 表示 p > 0.5。请点击此处查看该图的高清版本。

补充文件1：本研究中使用的培养基配方。请点击此处查看文件

讨论

本方案使研究人员能够定量分析铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）无菌培养上清液中的总铁载体以及两种不同类型的铁载体，即绿脓菌素（pyoverdine）和绿脓菌铁素（pyochelin）。在CAS琼脂平板实验中，CAS染料与Fe³⁺离子形成复合物。当细菌产生铁载体时，会从CAS-Fe³⁺复合物中螯合Fe³⁺离子，从而在菌落周围引起颜色变化。这种变化表现为菌落周围出现清晰的橙色晕圈^14,15。虽然可将细菌直接划线接种于CAS琼脂平板上，但整体结果可能受到影响：若接种的细菌细胞数量过多，可能导致菌落周围形成较宽的橙色晕圈；而接种细胞数量过少，则可能产生较窄的透明区域。为解决这一问题，我们通过调节OD₆₀₀使接种的细菌细胞数量保持一致。营养要求苛刻的细菌可能在24小时后即显现结果，而生长缓慢的细菌则可能需要超过72小时才能显示出铁载体的产生。

为了定量测定总铁载体，最初采用的是经典光谱法，该方法需要大量上清液才能检测铁载体，因此不具实用性。目前，总铁载体的定量检测已改用96孔板结合改良的CAS法进行。与传统的光谱法相比，该方法显著减少了试剂和细菌上清液的用量，节省了时间，并提高了准确性¹⁶。其他研究也报道了使用微量滴定板作为更省时且高效的检测手段¹⁷。利用微量滴定板定量总铁载体已被证实为一种高效的方法。本研究选取在无铁培养基中培养48小时的细菌培养物进行检测。同时开展了一项比较研究，以评估不同培养基中的铁载体产量，包括LB培养基、经3% 8-羟基喹啉萃取的LB培养基、经3% 8-羟基喹啉萃取的King's B培养基以及经3% 8-羟基喹啉萃取的蛋白胨水培养基。结果发现，蛋白胨水培养基中铁载体产量最高，因此被选用于后续实验。不同培养基中铁载体产量的对比图见补充图1。

绿脓菌素可通过荧光分光光度法进行检测和定量，但只有游离态的绿脓菌素具有荧光特性。绿脓菌素与 Fe³⁺ 离子形成的复合物不产生荧光^18,19。为检测和定量绿脓菌素，本研究选取培养48小时的细菌培养物进行分析。P. aeruginosa 在初始缺铁条件下可产生嗜铁素，而在经历严重缺铁应激后则转为产生绿脓菌素。已有研究表明，绿脓菌素可螯合其他金属阳离子，如铝、镓、锰和铬，但只有铁能够成功转运至细胞膜¹⁹。

与总铁载体和绿脓菌素类似，细胞游离上清液中的嗜铁素无法直接定量，必须使用二氯甲烷进行提取²⁰。二氯甲烷与细胞游离上清液不相混溶，会在底部形成独立的分层。本研究测试了多种营养培养基，包括LB肉汤、蛋白胨水和酪蛋白氨基酸培养基，但仅在King's B培养基中获得了较大量的嗜铁素。尽管Hoegy等人在其方案中使用了CAA培养基，但我们改用King's B培养基，因为CAA培养基不支持细菌生长²¹。此外，我们进一步改进了该方法，通过8-羟基喹啉对营养培养基进行提取，以去除培养基中的任何铁残留物，从而制备出缺铁培养基。另外，培养时间被发现显著影响嗜铁素的产生。Dumas等人证明，在严重缺铁条件下，P. aeruginosa会从产生嗜铁素转为产生绿脓菌素¹²。在本研究中，嗜铁素的提取与检测均采用培养24小时的细菌培养物进行，因为在48小时的培养物中未检测到嗜铁素。上清液体积也会影响嗜铁素的检测，因此每次提取均使用100 mL的细胞游离上清液。此外，MR1、TL7和J3分离株中的嗜铁素产量显著更高，这可能与这些菌株虽具有强效铁螯合能力却无法产生绿脓菌素有关²²。

Ji 等人提出了一种新型且灵敏的绿脓菌素定量方法，并使用液相色谱-串联质谱法（LC/MS/MS）对其进行了验证。然而，该方法仅适用于从囊性纤维化患者痰液中分离的P. aeruginosa菌株。由于 LC/MS/MS 设备成本较高，大多数实验室可能难以负担²³。Visaggio 等人开发了一种基于生物发光全细胞的生物传感器，可实现快速、灵敏且一步法的绿脓菌素定量。但该方法无法对总铁载体和绿脓菌荧光素进行定量²⁴。

铁载体铁摄取系统在耐多药细菌的药物递送中可能具有抗菌应用价值，因为它们在细菌的存活和毒力中发挥着关键作用。这种方法可能为对抗耐多药细菌提供一种新途径²⁵。无法穿透细菌细胞膜的药物可与铁载体连接，形成的铁-铁载体复合物可被转运至细菌膜内²⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂，I型	HIMEDIA	GRM666
8-羟基喹啉	Loba Chemie	4151
酪蛋白氨基酸	SRL Chemicals	68806
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）	HIMEDIA	RM4867-100G
氯仿	Merck	1070242521
铬天青S	HIMEDIA	RM336-10G
柠檬酸	Merck	100241
一水葡萄糖	Merck	108342
二氯甲烷	Merck	107020
六水合三氯化铁	HIMEDIA	GRM6353
玻璃烧瓶	Borosil	5100021
玻璃试管	Borosil	9820U05
盐酸	SDFCL	20125
King's medium B基础培养基	HIMEDIA	M1544-500G
M9最小培养基盐	HIMEDIA	G013-500G
硫酸镁	Qualigens	10034
MultiskanGO紫外分光光度计	Thermo Scientific	51119200
蛋白胨I型，细菌学级	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES游离酸	MP Biomedicals	190257
磷酸二氢钾	Merck	1048731000
蛋白䏡胨	HIMEDIA	RM005-500G
岛津UV-Vis分光光度计	Shimadzu	2072310058
Sigma实验室离心机	Sigma-Aldrich	3-18K
氯化钠	Qualigens	15915