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用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像

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DOI：

10.3791/66072

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2024年1月5日

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。

摘要

癌症患者来源类器官（PDO）模型是一种多功能研究体系，相较于癌细胞系，能更真实地模拟人类疾病。PDO模型可通过将患者肿瘤细胞在细胞外基底膜提取物（BME）中培养，并以三维半球状形式接种来建立。然而，市面上许多为单层培养中表型检测而优化的试剂通常与BME不兼容。本文介绍一种利用自动化活细胞成像系统接种PDO模型并评估药物效应的方法。此外，我们应用了适用于动力学检测的荧光染料，以同时定量细胞健康状态和细胞凋亡。图像采集可自定义为在数天内按固定时间间隔进行。用户可分析单个Z平面图像，或对多个焦平面连续图像生成的Z投影进行分析。通过掩膜（masking）技术，可计算特定感兴趣参数，如PDO数量、面积和荧光强度。我们提供了概念验证数据，展示了细胞毒性药物对细胞健康、凋亡及存活率的影响。该自动化动力学成像平台可进一步拓展至其他表型读出指标，以深入理解各类治疗手段在癌症PDO模型中的作用效果。

引言

患者来源的肿瘤类器官（PDOs）正迅速成为研究癌症发生发展及治疗反应的有力模型系统。PDOs 是一种三维（3D）细胞培养系统，能够重现原发肿瘤复杂的基因组特征和组织结构1,2。与传统的永生化癌细胞系二维（2D）培养相比，PDOs 能够捕捉并维持肿瘤内异质性3,4，使其成为机制研究和转化研究的重要工具。尽管 PDOs 正日益成为广受欢迎的模型系统，但目前可用于 PDO 培养体系、且与之兼容的商业化试剂和细胞效应分析方法仍十分有限。

目前缺乏用于分析治疗反应细微变化的可靠方法，这阻碍了临床转化。在三维培养中，细胞健康检测试剂的金标准——CellTiter-Glo 3D，利用ATP水平作为细胞活力的判断依据5,6。尽管该试剂适用于终点检测，但仍存在若干局限性，其中最显著的是检测完成后样本无法用于其他用途。

活细胞成像是一种复杂的动力学显微技术，当与荧光试剂结合使用时，能够在PDO模型中定量检测多种细胞健康指标，包括细胞凋亡7,8,9和细胞毒性10。事实上，活细胞成像在二维平台化合物高通量筛选中已发挥关键作用11,12。诸如Incucyte等系统使该技术成本降低，从而让各类研究团队均能获得使用机会。然而，将这些系统应用于分析三维培养物仍处于起步阶段。

本文介绍了一种利用多重活细胞成像技术评估癌症类器官（PDO）模型中药物反应的方法（图1）。通过分析明场图像，可对PDO 的大小和形态变化进行动力学监测。此外，还可使用荧光试剂同时随时间定量细胞过程，例如采用Annexin V Red Dye检测细胞凋亡，Cytotox Green Dye检测细胞毒性。所述方法已针对Cytation 5活细胞成像系统进行优化，但本方案亦可适配于其他不同的活细胞成像平台。

方案

本研究使用的人类肿瘤标本相关研究已通过爱荷华大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准（方案编号：201809807），并依照1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版所规定的伦理标准进行。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。纳入标准包括确诊为癌症且有可获取的肿瘤标本。

1. 在96孔板中接种完整的PDO

  1. 准备试剂。
    1. 将96孔板在37 °C预热过夜，并在4 °C下解冻基底膜提取物（BME）过夜。
    2. 配制适用于目标癌症类型培养的完整类器官培养基。本文所示实验所用的具体培养基详见补充表1。
      注意：不同肿瘤类型可能需要调整培养基成分。例如，妇科肿瘤的类器官培养基需添加100 nM雌二醇13。配制好的培养基在4 °C可稳定保存1个月。如需长期保存，将培养基分装至50 mL离心管中，于-20 °C储存。
  2. 分别准备4 °C和37 °C的两份类器官培养基。例如，若在96孔板中接种60个孔，则使用6 mL预热的类器官培养基和150 µL冰上预冷的类器官培养基。
  3. 配制类器官洗涤缓冲液：在1x PBS中添加10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA和10 µM Y-27632。4 °C保存。
  4. 收获在24孔板中培养的患者来源类器官（PDO）。除非另有说明，所有步骤均在冰上或4 °C进行。
    1. 使用真空系统吸除各孔中的培养基。
    2. 加入500 µL冰上预冷的类器官洗涤缓冲液，使用1000 µL移液器轻柔吹打2–3次。将板置于冰上孵育10分钟。
    3. 将每孔内容物转移至50 mL锥形离心管中。为确保所有PDO均处于悬浮状态，用额外300 µL类器官洗涤缓冲液冲洗每孔，并将冲洗液转移至50 mL锥形离心管中。在4 °C以350 × g离心5分钟。
    4. 使用真空系统吸除BME/类器官沉淀上的上清液，管中保留约5 mL液体。加入20 mL类器官洗涤缓冲液，使用10 mL血清移液管轻柔重悬沉淀。冰上孵育10分钟。
    5. 在4 °C以350 × g离心5分钟。使用真空系统小心吸除上清液，注意不要扰动PDO沉淀。
  5. 在96孔板中接种PDO：除非另有说明，所有步骤均在冰上进行。
    1. 用适量冰上预冷的类器官培养基重悬PDO沉淀，制备PDO悬液。 将PDO悬液转移至冰上预冷的1.5 mL微量离心管中。
      注意：为计算所需类器官培养基的体积，需确定将在96孔板中接种的孔数，注意PDO将以5 µL液滴形式接种，且类器官培养基与BME的体积比为1:1。例如，当接种一个96孔板且仅使用内部60个孔时，所需PDO悬液总体积为300 µL：150 µL类器官培养基和150 µL BME。对于在不同BME浓度下表现出最佳生长的模型，可在本步骤中调整BME与培养基的比例，但重要的是，在同一特定模型的所有实验中应保持该比例一致。为补偿移液误差，每种组分额外增加10%体积。
    2. 计数PDO数量。
      1. 取2.5 µL PDO悬液转移至冰上预冷的1.5 mL微量离心管中，与2.5 µL BME混合。将5 µL混合液滴加至洁净的玻璃显微镜载玻片上。无需加盖盖玻片。混合液将凝固成圆顶状。
      2. 在4倍明场显微镜下观察。计数5 µL混合液中的PDO数量；目标为每5 µL液滴中含有约25–50个PDO。
        注意：若测试混合液中未达到理想密度，可通过添加更多类器官培养基，或离心PDO悬液后用更少体积的冰上预冷类器官培养基重悬沉淀，来调整PDO悬液的最终体积。无论本步骤中如何调整PDO悬液，步骤1.5.3中的BME与PDO悬液的最终比例应保持1:1。
    3. 使用配有宽口吸头的200 µL移液器，小心地将PDO悬液与等体积的BME混合，使类器官培养基与BME的比例达到1:1。避免产生气泡，以免破坏液滴结构。 
    4. 使用20 µL移液器，将5 µL液滴接种至预热的96孔板各孔中央，仅接种内部60个孔。为确保PDO均匀分布，定期使用配有宽口吸头的200 µL移液器吹打1.5 mL离心管中的悬液。
    5. 所有孔接种完成后，盖上板盖并轻轻倒置。将倒置的板置于37 °C细胞培养箱中孵育20分钟，使液滴凝固。
      注意：倒置板可确保BME/类器官培养基液滴维持三维结构，为PDO形成提供充足空间。
    6. 将板翻转，使板盖朝上，于37 °C孵育5分钟。

2. 多重检测中处理步骤及荧光染料的添加

  1. 在96孔板中BME圆顶凝固的同时，配制荧光活细胞成像试剂的稀释液。本文提供了Annexin V Red Dye与Cytotox Green Dye多重检测的具体参数。
  2. 荧光试剂配制（第-1天）：根据待处理孔数计算所需类器官培养基的适当体积，假设每孔将加入100 µL含染料的培养基。将染料用预热的类器官培养基稀释至所需浓度。
    注意：所需培养基的总体积取决于具体实验。为弥补移液误差，最终体积应额外增加10%。例如，若处理96孔板内侧60个孔，则需配制6.6 mL含染料的培养基（表1）。
  3. 向每孔加入100 µL 2倍浓度的含染料类器官培养基。向板的外周空孔中加入200 µL无菌1x PBS。于37 °C过夜孵育。
    注意：外周孔中的PBS可减少内孔培养基的蒸发。
  4. 添加药物/处理剂（第0天）：将药物用预热的类器官培养基配制成每孔100 µL、浓度为2倍的工作液。
    注意：DMSO在高浓度下对细胞具有毒性。本研究中所有实验的DMSO终浓度均未超过0.1%。此外，除药物外，某些荧光试剂也以DMSO溶液形式提供。使用此类试剂时，必须考虑总体DMSO浓度。
  5. 向每孔加入100 µL 2倍浓度的含染料培养基；避免产生气泡。

3. 设置成像参数

  1. 将培养板放入 Cytation 5 中。 打开 Gen5 软件。点击 新任务 > 成像仪手动模式选择 立即捕获 并输入以下设置： 目标 （选择所需放大倍数）； 过滤 （选择微孔板）； 微孔板格式 （选择孔的数量）；以及 血管类型 （选择培养皿类型）。点击 使用盖子 和 使用较慢的载物台移动速度. 点击 好的.
    注意：容器类型：选择关于培养板的信息时，应尽可能具体，因为软件针对每种培养板类型及其塑料厚度，已校准物镜到培养板底部的特定距离。
    ​较慢的载板移动速度：选中此选项可在加载/卸载板时避免扰动凝胶圆顶结构。
  2. 创建一个Z轴层扫，以对整个BME圆顶进行成像。
    1. 选择感兴趣的孔进行查看（直方图下方左侧面板）。
    2. 选择 明场通道 （左侧面板，顶部）。点击 自动曝光 并调整 设置 根据需要。
    3. 设置Z轴层扫的底部和顶部：展开 成像模式 标签（左侧面板，中部）。检查 Z轴层扫 使用粗调箭头（左侧面板，中间），点击向下调节，直至所有类器官进入视野后又移出焦点，变得模糊。将此位置设为Z轴层扫的底部。然后使用粗调箭头沿相反方向重复操作，设定Z轴层扫的顶部。
    4. 为确保Z-栈设置适用于其他目标孔，请选择另一个孔（直方图下方的左侧面板），并观察Z-栈的顶部和底部。
    5. 要手动输入焦平面位置，请点击精细调节旁的三个点（左侧面板，顶部）。此时将打开一个窗口；在其中输入Z轴层扫的顶部值（位于左侧面板中部下方） 成像模式）。对底部Z轴层扫描值重复上述操作。根据需要重复步骤3.2.3，以调整并获取所需的Z轴范围。若进行了调整，应选择另一个孔以验证设置。
  3. 设置荧光通道的曝光参数。以下针对两个荧光通道（GFP）描述设置方法。 & TRITC)。荧光通道的具体数量取决于实验需求以及活细胞成像系统中安装的荧光滤光片组。
    注意：如果预计实验结束时信号强度会显著增强，建议用户先进行预实验，以确定实验结束时的最佳曝光参数，随后在设定初始参数时应用这些优化条件。
    1. 展开 成像模式 选项卡（左侧面板，中间）并打开 编辑成像步骤将出现一个弹出窗口。
    2. 在下方 通道，点击所需通道数量的气泡。指定一个通道用于 明场及每个荧光通道对应的附加通道。在此示例中 通道 1 明场 通道 2 = GFP 通道 3 = TRITC。使用下拉菜单 颜色 菜单中，为每个通道选择合适的设置。通过点击关闭编辑窗口 好的.
    3. 设置每个荧光通道。
      1. 切换至GFP通道（左侧面板，顶部）。
      2. 点击 自动曝光 （左侧面板，顶部）。展开 暴露 点击（左侧面板，中间），调整曝光设置以最小化背景信号。
      3. 将曝光设置复制到 图像模式 参照步骤 3.3.3.3-3.3.3.6
      4. 点击 复制 图标旁边的 编辑成像步骤 盒。点击 编辑成像步骤，这将打开另一个窗口。
      5. 在GFP通道下，单击 剪贴板 图标在 暴露 添加的行 光照, 积分时间，以及 相机增益 通道设置。
      6. 对TRITC通道重复步骤3.3.3.4-3.3.3.5。点击 好的 关闭窗口。
  4. 设置图像预处理和Z轴投影步骤，以实现图像预处理的自动化。
    1. 点击 相机 图标（左侧面板，底部角落）。新窗口将打开。
    2. 下方 添加处理步骤 （左侧面板，底部），单击 图像预处理将打开一个新窗口。
    3. 在 明场 标签，取消选择 应用图像预处理.
    4. 对于每一个 荧光通道 标签，确保 应用图像预处理 被选中。取消选择 使用与通道1相同的选项 并点击 好的窗口将关闭。
    5. 下 添加处理步骤，点击 Z 投影将打开一个新窗口。如有需要，可调整切片范围（例如，缩小Z轴范围）。通过选择关闭该窗口 好的.
  5. 创建实验方案
    1. 点击 图像集 在工具栏中。在下拉菜单中，点击 从该图像集创建实验。该 成像窗口 将关闭，且 操作窗口 将打开。
      注意：所选参数在 成像仪手动模式 将自动加载到新窗口中，从而可创建实验方案。
    2. 设置温度和梯度：点击 设置温度 在……之下 操作 标题（左侧）。新窗口将打开。选择 培养箱开启 并在下方手动输入所需温度 温度接下来，在……下方 梯度，手动输入 1. 通过选择关闭窗口 好的.
      注意：设置1 °C的温度梯度可防止冷凝液在培养板盖上形成。
    3. 将孔位指定到图像。
      1. 双击 图像步骤 下 描述. 点击 全板 （右上角）。这将打开 板布局 窗口
      2. 使用光标高亮标记感兴趣的孔。点击 好的如需要，可进行检查 自动对焦像素合并 和 捕获分箱 盒子。点击 好的 关闭窗口。
        注意：如上文步骤 3.3.3.2 所述，合并像素（binning）需要调整曝光参数。有关此功能可能适用的具体情况，请参见讨论部分。
    4. 设置动力学成像的时间间隔。
      1. 点击 选项 在……之下 其他 标题（左侧）。检查 不连续动力学程序 盒子
      2. 下 预计总时长，输入实验的运行时间（例如，5 天）。在下方 估计间隔，输入对培养板进行成像的时间间隔（例如，每6 h）。
      3. 点击 每次运行后暂停 以留出足够时间将培养板转移至培养箱。通过选择关闭窗口 好的.
    5. 更新数据约简步骤。
      1. 点击 好的 关闭 操作窗口将打开一个选项卡以更新数据处理步骤。选择 是. 双击 图像预处理. 依次点击不同通道以确认设置，然后点击 好的.
      2. 双击 Z 投影. 依次点击不同通道以确认设置。点击 好的然后，单击 好的 再次关闭 数据缩减窗口.
    6. 设计酶标板布局。
      1. 打开 平板布局向导 并按照步骤 3.6.2-3.6.3 指定孔板类型。
      2. 点击 板布局 工具栏左上角的图标以打开 平板布局向导.
      3. 勾选实验中使用过的孔类型。在下方 检测对照，使用箭头输入不同类型对照的数量。点击 下一步 打开 检测对照 #1 窗口。
      4. 按照步骤 3.6.5-3.6.8 设置检测对照孔条件。
      5. 在 检测对照 #1 窗口中，输入控制标签 板布局编号 框中。如有需要，可在相邻框中输入全名。使用箭头选择相应对照条件的重复次数。
      6. 如果在对照中使用多个浓度或浓度梯度系列，请点击 定义稀释度/浓度 并使用下拉菜单选择 类型在表格中输入每个浓度/稀释度的数值。
        注意：如果浓度以恒定增量变化，可使用自动功能。
      7. 选择 颜色 工具栏中的标签。在下拉菜单中选择控件所需的文字颜色和背景颜色。单击 下一步.
      8. 根据需要使用额外的对照重复操作。
      9. 按照 3.6.10–3.6.12 设置样品孔条件。
      10. 在 样品设置 页面中输入样本编号前缀（例如，SPL）。使用箭头选择重复次数。若使用不同处理浓度的样本，请选择 浓度或稀释 在 类型 下拉菜单。在表格中输入稀释度/浓度，并在单位栏中输入单位 单位 盒子
      11. 选择 鉴定区域 在工具栏中。输入所需的 类别名称 （例如，样本编号、药物）在表格中。
      12. 选择 颜色 工具栏中的标签。为每个处理组/样本选择不同的颜色。点击 完成这将打开“板布局”页面。
        注意：左侧的数字与不同的样本编号相对应。
      13. 按照步骤 3.6.14–3.6.16 分配样本编号。
      14. 选择 左侧面板中的 SPL1。使用光标选择孔位。
        注意：可在序列分配框中调整自动选择工具。可预先指定重复次数和布局方向。
      15. 用其他样品重复上述步骤，完成整块板的布局。确认无误后， 点击 好的。
      16. 在 文件 工具栏，选择 样本编号填充 样本编号 为每个样本输入相应的信息列（例如，药物类型）。点击“确定”。
    7. 保存实验方案。
      1. 在工具栏中，单击 文件 > 保存 方案 as. 选择 保存文件的位置。输入文件名。点击 保存 关闭窗口。
      2. 点击 文件 > 退出 在工具栏中。将打开一个标签页以保存更改到 成像仪手动模式 选择 无.
      3. 将打开一个标签页以保存对实验1的更改。请选择 无将打开一个标签页以更新协议定义。选择 更新关闭软件。
  6. 将方案导入 BioSpa OnDemand 并完成实验设置。
    1. 打开 BioSpa OnDemand（调度软件）。
    2. 在软件中选择一个可用的插槽。
    3. 从活细胞成像系统中取出培养板。点击 打开抽屉 进入调度软件中的相应槽位并插入培养板。点击 关闭侧边栏.
      注意：此步骤可在上述 3.5.7 步骤创建方案后的任意时间执行。然而，必须将培养板置于 Cytation 5 中，才能在下文的步骤 3.6.4.3 中进行定时运行。
    4. 导入实验方案。
      1. 在……之下 操作信息 标签，选择 用户 在下拉菜单中。接下来，位于 实验方案 槽，点击 选择 > 添加新条目.
      2. 在“方案”插槽旁，点击 选择这将打开一个新窗口，以便在文件架构中导航至所需的方案。单击 开放 将方案导入排程软件。
      3. 输入成像所需时间。点击 好的 关闭 Gen5 实验方案列表 窗口。
        注意：当同时进行多个实验时，此步骤尤为重要。要确定成像所需时间，请单击 现在执行一次计时运行点击 好的.
    5. 设置成像时间间隔并安排实验计划。
      1. 下方 间隔，输入步骤 3.5.4 中指定的成像时间间隔。
      2. 下 开始时间选项，选择 当可用时. 在 持续时间, 选择固定 或 连续的.
        注意：可指定特定的开始时间，而非在下一个可用时间运行方案。选择 固定时长 将为实验设定一个特定的终点，并要求用户指定实验的时间范围。 持续时间 将允许实验持续运行而无终点，只能由用户手动停止实验来结束。
      3. 点击 安排培养板/容器。这将打开板验证序列。一个包含建议的首次读取时间的新标签页将会打开。点击 是 接受此时间安排。

4. 使用 Gen5 软件进行图像分析（图 2）

  1. 打开图像分析模块。
    1. 打开 Gen5。在 任务管理器 中，选择 实验 > 打开。选择要打开的实验文件。在工具栏中点击 板 > 查看。
    2. 将 数据 下拉菜单更改为 Z 投影。双击感兴趣的孔。选择 分析 > 我要设置一个新的图像分析数据缩减步骤。点击 确定。
  2. 细胞分析
    1. 主掩膜
      1. 在 分析设置 下，选择 类型：细胞分析，检测通道：ZProj[Tsf[Bright Field]] （左侧面板，中间）。
      2. 点击 选项，将打开 主掩膜与计数 页面。在 阈值 框中，勾选 自动 并点击 应用。勾选 高亮对象 框（右侧面板，底部），以显示指定阈值范围内的对象。根据需要进行调整，以包含感兴趣的对象。
        注：阈值设置基于像素强度。例如，若阈值设为 5000，则强度大于 5000 的像素将被纳入分析。
      3. 在 对象选择 下，设定最小和最大对象尺寸（µm）。根据需要进行调整，以排除细胞碎片或单个细胞。
        注：PDO 的大小在不同模型和类型之间可能存在显著差异。使用 Gen5 软件中的测量工具确定每种模型的最小和最大 PDO 尺寸阈值。用户可选择比测量工具提供的数值更小的最小 PDO 尺寸阈值，以防止在药物处理后的后期时间点排除 PDO 片段。
      4. 若要将分析限制在孔的特定区域，请取消勾选 分析整幅图像 并点击 插件。在 图像插件 窗口中，使用下拉菜单选择 插件 形状。根据需要调整大小和位置参数，以适配感兴趣区域。
        注：应尽可能在插件内包含更多的 PDO，同时排除无 PDO 区域，以最小化背景干扰。设定的插件尺寸应能在重复实验中稳定捕获大多数感兴趣对象。生成插件时还应排除穹顶边缘区域，因为边缘处极端曲率引起的光折射可能导致对象形变。也可取消勾选 包含主边缘对象 ，以仅捕获插件内部的完整 PDO。
    2. 亚群分析。图 3 提供了亚群划分的示例。
      1. 在 细胞分析 工具栏中点击 计算指标 。点击 选择或创建感兴趣的对象层级指标 （右下角）。在 可用对象 指标下，选择感兴趣的指标（例如，圆形度），然后点击 插入 按钮。点击 确定。
        注：每种 PDO 模型的形态和密度将决定用于区分亚群的最佳指标。
      2. 在 细胞分析 工具栏中点击 亚群分析 。点击 添加 以创建新的亚群，弹出窗口将打开。
      3. 如有需要，为该亚群输入名称。在 对象指标 下，选择一个感兴趣的指标并点击 添加条件。在 编辑条件 窗口中，输入所选 对象指标 的参数。根据需要重复添加其他指标。
        注：参数可手动调整，或使用查找工具设定。例如，为排除碎片，用户可将 面积 作为 对象指标，并选择小于 800 的对象。通常使用 圆形度 作为 对象指标，根据模型不同，通常包含圆形度大于 0.2–0.5 的对象。
      4. 在窗口底部的表格中，勾选希望显示的结果。点击 确定 > 应用。
      5. 要查看亚群内的对象，使用 对象详情 下拉菜单（右侧面板，中间）选择该亚群。符合参数条件的对象将在图像中被高亮显示。
        注：如需更改主掩膜和亚群的高亮颜色，请点击 设置 （右侧面板，底部）。
      6. 如需调整亚群参数，从 细胞分析 工具栏重新打开 亚群分析 窗口。选择亚群并点击 编辑。点击 添加步骤。
        ​注：此操作将对实验中所有时间点的所有孔应用相同的分析。在矩阵页面的下拉菜单中，可选择不同指标进行单独查看。

5. 将数据从 Gen5 导出至 Excel

  1. 要自定义数据文件以导出，请在工具栏中选择 报告/导出构建器 图标。在弹出窗口中，点击 新建导出至 Excel。
  2. 在弹出窗口的 属性 页面中，选择 范围 > 板和内容 > 自定义。点击工具栏中的 内容 选项，然后点击 编辑模板，这将打开 Excel 程序。
  3. 在电子表格中，选择 加载项 > 表格 > 孔数据。将鼠标悬停在各个选项上以查看导出选项。选择感兴趣的指标（例如，Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]）。
    注意：可通过选择 加载项 > 协议摘要 > 布局 将板布局添加到电子表格分析模板中。
  4. 将打开一个 编辑 窗口。在 孔 框中，通过孔编号（Well-ID）或孔号（Well #）指定要导出的孔。选择 确定。模板将被加载到电子表格文件中。关闭电子表格，模板将自动保存。
  5. 在 新建导出至 Excel 窗口中点击 确定，然后关闭 报告/导出构建器 窗口。
  6. 点击 Gen5 工具栏中的 导出 图标。勾选所需导出文件旁边的复选框，然后点击 确定。Gen5 将自动填充电子表格模板并在 Excel 中打开该文件。

6. 外部数据分析

  1. 在 Excel 中打开导出文件（.xlsx）。
  2. 对于每个孔，将其每个单独的数值除以该孔在 0:00 时间点的数值。这将使时间点 0 的值等于 1，之后每个数值均相对于初始读数进行归一化。
  3. 在数据分析软件中新建一个文件，选择 XY 布局 选项。
    注意：本实验方案中使用的是 GraphPad Prism（版本 9.5.1）。
  4. 输入每组数据的标签，将各处理组的时间点及相应的归一化数值复制粘贴至 Prism 表格中。数据图表将自动生成，并可在 图表 下查看。

结果

我们的目标是证明利用多重活细胞成像评估类器官药物治疗反应的可行性。概念验证实验在两个独立的子宫内膜癌类器官（PDO）模型ONC-10817和ONC-10811中进行（见 补充图1 和 补充图2 对于ONC-10811数据）。在凋亡诱导剂星形孢菌素处理下，通过动力学方法监测细胞凋亡（annexin V染色）和细胞毒性（Cytotox Green摄取）。具体而言，将PDO细胞接种于96孔板中，加入Annexin V Red和Cytotox Green染料进行处理，随后置于 37 °C 孵育器中过夜，如图所示 图1. 我们在两个独立的PDO模型中证实，Annexin V和Cytotox Green染料处理无毒性（补充图2）。次日，使用浓度递增的星形孢菌素（0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、500 nM）处理PDO。随后，在Gen5软件中建立实验方案，设定实验持续5天，每6小时成像一次。数据采用Gen5软件中的细胞分析功能进行分析，具体方法见方案第4节。主掩模（Primary Mask）通过自动阈值（Auto threshold）功能设定，取消勾选“分离接触对象”（Split touching objects），尺寸参数设定为最小值： 30 µm 和最大值： 1000 µmPDO亚群由圆形度定义 > 0.25. 在指定的 PDO 亚群中，TRITC（annexin V，凋亡）和 GFP 通道（Cytotox Green，细胞毒性）的物体平均荧光强度被导出为 .xlsx 文件以供进一步分析。每个时间点各孔在 GFP 和 TRITC 通道中的物体平均荧光强度均以零时点为基准进行归一化处理。归一化后的荧光数据随后导入 Prism 文件，并以折线图形式呈现。

与溶剂对照组相比，经星形孢菌素处理后，随着时间推移，细胞凋亡显著增加且细胞健康状况下降，这体现在TRITC（annexin V）和GFP（Cytotox）通道中目标物平均荧光强度的升高（图4、图5、补充视频1、补充视频2、补充视频3、补充视频4、补充视频5、补充视频6 和 补充视频7）。星形孢菌素在500 nM、100 nM和10 nM剂量下均随时间推移导致细胞凋亡和细胞毒性出现具有统计学意义的显著升高（图5A-C），并在实验结束时仍保持显著差异（图5E、F）。此外，在这些浓度下，星形孢菌素有效抑制了PDO的生长和形成，表现为总PDO面积整体减少，而对照孔则显示出总PDO面积的增加（图4 和 图5D）。

由于活细胞成像的一个主要优势是能够校正铺板过程中的变异性，我们设计了一个实验，以细胞活力作为终点指标进行评估。概念验证的终点检测数据使用一种来源于前列腺癌患者来源异种移植瘤的PDO模型获得。在处理开始时（第0天）采集明场图像，随后加入一种双染料试剂，用于同时检测细胞活力（吖啶橙，AO）和细胞死亡（碘化丙啶，PI）。AO组分在结合双链DNA后发出绿色荧光信号，指示细胞具有活力。PI组分可对死亡的有核细胞进行染色，可用于量化处理引起的细胞死亡。为了校正PDO铺板过程中的变异性，我们设计了一种方法，通过将明场图像转换为数字相差图像来确定0时间点每孔中的PDO数量（补充图3和补充文件1）。

前列腺癌类器官（PDO）用柔红霉素（一种可诱导细胞死亡的化疗药物）处理7天。实验结束后，按照补充文件1所述方法，使用AOPI对样本进行染色，随后在Gen5中分析荧光图像。图6A展示了第7天AOPI终点检测的一组图像。与对照溶剂处理的PDO（第一行）相比，经10 µM柔红霉素处理的PDO（第二行）中，绿色荧光明显减少（活力检测指标，第二列），红色荧光显著增强（细胞死亡检测指标，第三列）。这些结果在图6B中进行了定量分析，展示了AOPI终点染色技术可实现的多种检测读数。左上方图表显示了基于AO染色获得的活力检测值，并以第0天通过数字相差图像分析确定的每孔PDO数量进行归一化处理。这些数据与图6A的视觉结果一致：随着柔红霉素浓度的增加，细胞活力显著下降。右上方图表进一步验证了这一趋势，显示PI染色检测到的红色荧光增强，表明细胞死亡增加。

随后将PI数据与活力读数（AO）结合，计算活细胞与死细胞比率（图6B，左下图）。该比率可用于判断药物是细胞抑制性还是细胞毒性。具体而言，由于细胞抑制性药物仅抑制细胞生长而未必诱导细胞死亡，因此细胞毒性药物的比率会远接近于0。最后，即使类器官正在发生细胞死亡和出泡现象，仍可利用AO染料的绿色荧光准确计算类器官（PDO）的面积。右下图显示了平均PDO面积，其计算方法为亚群分析中标注的总面积除以PDO数量。对面积的分析可进一步提示治疗手段是仅仅抑制PDO生长，还是实际导致PDO退缩。需要注意的是，平均PDO面积的分析使用的是GFP通道和细胞分析功能，而与之相对的图5D则是利用明场图像计算PDO总面积。这些数据表明，分析流程具有灵活性，可根据数据可获得性和用户需求进行调整。

最后，我们将细胞活力检测的金标准方法 CellTiter-Glo 3D 与基于 AOPI 的荧光活力检测进行了比较（图 6C）。请注意，本图中数据未归一化至初始时间点（time 0）的 PDO 数量，因为使用 CellTiter-Glo 3D 试剂盒的实验室通常不进行此类归一化处理。我们在两种检测方法中均观察到相同的药物效应趋势，即随着柔红霉素浓度的增加，PDO 的活力逐渐下降。两种检测结果之间唯一的视觉差异在于，CellTiter-Glo 3D 分析比 AOPI 分析更早达到 IC50，并且活力值几乎完全降至 0。这一结果可能与柔红霉素的作用机制有关。柔红霉素是一种拓扑异构酶 II 抑制剂，可引起双链 DNA 断裂，导致细胞周期阻滞并最终引发细胞凋亡14。在细胞周期阻滞过程中，可能发生 ATP 耗竭15。鉴于 CellTiter-Glo 3D 检测依赖于 ATP-荧光素酶反应产生发光信号，我们推测在较高浓度柔红霉素处理下细胞活力显著降低的原因可能是 ATP 耗竭，而非完全的细胞死亡。支持这一观点的是，图 6A 中的图像显示培养物中仍存在具有活力的 PDO 群体，表现为绿色荧光。

类器官成像示意图：铺板类器官，用荧光试剂处理，图像采集，分析。
图1：铺板、成像与分析流程概览。 将患者来源的类器官（PDOs）接种于96孔板中，并用荧光染料和药物处理。在Gen5软件中设置实验的成像参数（如曝光时间、Z轴层扫）。使用Cytation 5进行图像采集，并在Gen5中进行图像处理，随后导出数据以进行进一步分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜图像分析工作流程：类器官分割过程示意图，包括微孔指定、掩膜设置和亚群定义。
图 2：细胞分析功能概览。 1：指定微孔：指定微孔以包含感兴趣区域。2：设置主掩膜：主掩膜根据所选通道中的大小和像素强度来定义感兴趣对象。在此代表性图像中，主掩膜包含的对象以紫色轮廓标出。3：定义亚群：可进一步定义额外的亚群，以更精确地筛选用于分析的目标群体。示例图像中的亚群（以黄色轮廓标出）基于圆形度（>0.25）和面积（>800）进行定义。图像使用 4x 物镜采集。 请点击此处查看此图的放大版本。

荧光显微镜、细胞成像比较、蛋白质研究中TRITC与GFP通道的合并图像。
图3：使用细胞分析功能进行亚群掩膜的示例。亚群在明场通道中定义。示例图像中的亚群（以黄色轮廓标出）基于圆形度（>0.25）和面积（>800）进行定义。图像使用4倍物镜采集。请点击此处查看该图的放大版本。

星形孢菌素有效性图表；药物浓度与时间关系；细胞生长抑制分析。
图 4：星形孢菌素处理导致细胞凋亡和细胞毒性的剂量依赖性增加。 显示了在三个时间点（0 h、54 h、114 h）下，使用500 nM、10 nM和0.1 nM浓度的星形孢菌素处理后的明场图像（4倍物镜）以及GFP与TRITC荧光叠加图像。红色荧光信号表示细胞凋亡（annexin V），绿色荧光信号表示细胞毒性（Cytotox）。请点击此处查看该图的放大版本。

药物测试中随时间变化的GFP和TRITC强度显示细胞毒性和凋亡检测结果。
图5：多重荧光活细胞成像评估PDO反应。 将PDO模型ONC-10817接种于96孔板中，加入Annexin V Red（1:400）和Cytotox Green（200 nM）染料，在37 °C条件下孵育过夜。次日，用浓度递增的星形孢菌素（staurosporine）处理PDO，并每隔6小时成像一次，持续约5天。(A,B) 星形孢菌素诱导的(A)细胞毒性或(B)凋亡呈现时间和剂量依赖性增加。数据以GFP或TRITC通道中的“对象平均强度”（Object Mean Intensity）表示。(C) 比较100 nM或500 nM星形孢菌素处理下凋亡与细胞毒性的动力学变化。数据以GFP和TRITC通道中的“对象平均强度”值表示。(D) 星形孢菌素抑制PDO的生长。数据以PDO的平均总面积表示。A-D图中的数据均以各孔0小时的PDO数量进行归一化，并以均值及均值标准误（SEM）表示。每种处理设5个技术重复。**** p < 0.0001，与溶剂对照组相比，采用双因素方差分析（2-way ANOVA）。(E) 实验结束时（114小时），经500 nM星形孢菌素处理与溶剂对照的PDO的代表性明场、GFP和TRITC图像。图像使用4倍物镜采集。(F) 在114小时时间点对细胞毒性、凋亡和存活率的定量分析。GFP“对象平均强度”（左）和TRITC“对象平均强度”（中）根据A-C图结果在114小时时间点计算得出。存活率（右）按照制造商说明书使用CellTiter-Glo 3D试剂进行评估。原始发光值（RLU）以0小时的PDO总面积归一化，并以相对于设为1.0的溶剂对照组的倍数存活率表示。** p<0.01，***p<0.001，**** p<0.0001，与溶剂对照组相比，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett's事后检验。每种处理设5个技术重复。 请点击此处查看该图的放大版本。

柔红霉素对类器官活力的影响；荧光显微镜，活力，死亡比例，药物浓度图。
图 6：利用活细胞成像辅助终点检测数据的标准化。 PDO 经不同浓度的拓扑异构酶 II 抑制剂柔红霉素处理 7 天。PDO 暴露于 AOPI 染色液中，并按 补充文件 1 所述进行成像。AO = 吖啶橙，用于评估细胞活力（GFP 通道）；PI = 碘化丙啶，用于评估细胞死亡（Texas Red 通道）。(A) 经 10 µM 柔红霉素或溶剂对照（0.1% DMSO）处理 7 天后，使用 AOPI 染色获得的代表性图像。(B) 使用 AOPI 荧光作为终点检测方法评估细胞活力/细胞死亡的多种读数。分析方法的详细描述见 补充文件 1。左上图：根据 AO 染色结果测定处理 7 天后 PDO 的活力。右上图：通过 PI 染色分析细胞死亡。AO 和 PI 染色数据均标准化至 0 h 时的 PDO 数量，再以溶剂对照组（设为 1.0）进行归一化，结果以均值 ± 标准差表示。左下图：利用 AO 和 PI 染色的平均目标积分值计算活细胞与死细胞的比例。右下图：根据 AO 染色测定的 PDO 面积。细胞分析在 GFP 通道中进行。(C) 两种检测 PDO 活力方法的比较。成像后，按照制造商方案使用 CellTiter-Glo 3D 试剂评估细胞活力。相对于溶剂对照组的存活倍数在柔红霉素浓度梯度下作图。数据表示每种处理条件下 N = 6 次技术重复的均值 ± 标准差；图 C 中的数据未对 0 h 时间点进行归一化。请点击此处查看该图的放大版本。

处理孔数培养基体积Annexin100 µM Cytotox
稀释倍数体积稀释倍数体积
多重检测606.6 mL1:40016.5 µL200 nM13.2 µL

表1：多重实验示例。 Annexin V Red 结合并标记凋亡细胞膜外层暴露的磷脂酰丝氨酸。Cytotox Green 进入细胞膜完整性受损的细胞，并与DNA结合。

补充图 1：ONC-10811 的多重活细胞成像。 将 PDO 接种于 96 孔板中，并在 37 °C 下与 Annexin V Red（1:400）和 Cytotox Green（200 nM）染料共孵育过夜。次日，用不同浓度的星形孢菌素（staurosporine）处理 PDO，并每隔 6 小时成像一次，持续 5 天。（A）星形孢菌素诱导的细胞毒性随时间和剂量增加而升高。数据以 GFP 通道中的“对象平均强度”（Object Mean Intensity）表示。（B）114 小时时星形孢菌素的剂量反应曲线。数据以 114 小时时点 GFP 通道中的“对象平均强度”值表示。（C）星形孢菌素诱导的凋亡随时间和剂量增加而升高。数据以 TRITC 通道中的“对象平均强度”表示。（D）114 小时时星形孢菌素的剂量反应曲线。数据以 114 小时时点 TRITC 通道中的“对象平均强度”值表示。A 和 C 中的数据在孔水平上以 0 小时的 PDO 数量进行归一化。每种模型中每种处理设有 5 个技术重复。**** p < 0.0001，与溶剂对照组相比，采用双因素方差分析（2-way ANOVA）。请点击此处下载该文件。

补充图2：Annexin V和Cytotox处理不影响PDO的存活率。 将PDO接种于96孔板中，并在37 °C下与Annexin V Red（1:400）和Cytotox Green（200 nM）染料共孵育过夜。24小时孵育后，按照制造商的说明书，使用CellTiter-Glo 3D检测法评估细胞存活率。（A）在24小时时间点，经染料处理与未处理PDO的存活率。图中同时展示了相对光单位（RLU）值以及归一化至PDO总面积的数值。具体而言，每个孔的CellTiter-Glo3D RLU值被归一化至该孔在接种时（即染料加入后立即）的PDO面积总和。PDO总面积通过“细胞分析”中的“对象面积总和”计算获得。N = 10。（B）在114小时时间点，经染料处理与未处理PDO的存活率。图中同时展示了原始发光值以及归一化至PDO总面积的数值。每个孔的CellTiter-Glo3D RLU值被归一化至接种后24小时的PDO总面积，该时间点对应于动力学成像实验中的0小时。N = 5。A和B中的显著性差异采用非配对t检验进行评估；p值标注于图中。请点击此处下载该文件。

补充图3：使用数字相差成像对PDO进行无标记分析。 本图包含代表性图像（2.5倍物镜），展示如补充文件1中所述的无标记分析方法：在Gen5软件中设置单焦平面成像参数（明场/数字相差图像）以及数字相差图像分析。（A）前列腺癌PDXO模型在单个焦平面的明场图像示例。（B）将A中的明场图像转换为数字相差图像。明场图像中的暗色物体在数字相差图像中呈现为亮色，反之亦然。（C）使用数字相差图像进行PDO掩膜分析的示例。请注意，与明场图像相比，目标物体的边缘在数字相差图像中更加清晰。在此代表性图像中，主掩膜中的物体以黄色轮廓标出。子群（C）中以粉色轮廓标出的部分是基于以下参数定义的：圆形度（>0.3）、面积（>1000）、Mean[Dig.Ph.Con] > 2000、StdDev[Dig.Ph.Con] > 5000 且 < 13500，以及 Peak[Dig.Ph.Con] > 12500。本代表性图中使用的参数被应用于图6的数据，以归一化至第0天的细胞数量。请点击此处下载该文件。

补充图4：PDO模型在形态和铺板一致性方面可能存在差异。 上图：PDO在BME凝胶滴中的分散性差异示例。下图：分散型与圆形PDO的代表性图像。所有图像均使用EVOS显微镜采集，放大倍数已注明。请点击此处下载该文件。

补充图5：使用细胞分析与图像统计量化荧光的示例图像。 使用细胞分析功能，用户可以在图像中定义特定的细胞群体，并测量这些区域中的荧光强度。图像统计也可用于通过设定阈值排除背景信号来测量图像中的荧光。有关使用图像统计的局限性，请参见讨论部分。图像放大倍数为4倍。请点击此处下载该文件。

补充表 1：类器官培养基成分。请注意，试剂已针对妇科癌症患者来源的类器官（PDO）培养进行了优化。请点击此处下载该文件。

补充视频 1：500 nM 星形孢菌素处理的延时视频，每 6 小时采集一次图像。 请点击此处下载该文件。

补充视频 2：每 6 小时采集一次图像的 100 nM 星形孢菌素处理的延时视频。 请点击此处下载该文件。

补充视频 3：每 6 小时采集一次图像的 10 nM 佛波酯处理时间延时视频。 请点击此处下载该文件。

补充视频 4：每 6 小时采集一次图像的 1 nM 星形孢菌素处理的延时视频。 请点击此处下载该文件。

补充视频 5：0.1 nM 星形孢菌素处理的延时视频，每 6 小时采集一次图像。 请点击此处下载该文件。

补充视频 6：每 6 小时采集一次图像的 0.01 nM 星形孢菌素处理的延时视频。 请点击此处下载此文件。

补充视频 7：对照组（0.06% DMSO）的时间推移视频，每 6 小时采集一次图像。 请点击此处下载该文件。

补充文件1：补充实验方案。 请点击此处下载该文件。

讨论

由于能够反映细胞的响应和行为，PDO 培养物正成为一种日益流行的体外模型系统2。在 PDO 的生成、培养和扩增技术方面已取得显著进展，但针对治疗反应的分析方法却相对滞后。市面上可获得的三维细胞活力检测试剂盒均为裂解终点法检测，无法获取潜在的重要动力学响应数据，并且限制了后续采用其他方法进行的分析8。近期研究开始应用活细胞成像技术来评估 PDO 模型中的药物反应。本文中，我们提出一种利用多重荧光活细胞成像技术随时间评估 PDO 治疗反应的方法。通过荧光染料的多重标记，可同时定量多种不同的细胞反应。除了细胞凋亡和细胞毒性外，我们预计该方法在未来的研究中还可进一步拓展，用于检测 PDO 中的其他表型效应。

本方案旨在获取在96孔板中以穹顶状接种的PDO（类器官）的动力学明场和荧光图像。关键步骤包括：1）接种，2）加入染料和药物处理，3）设定成像参数，4）动力学图像采集完成后进行图像预处理与分析，以及5）将数据导出至其他统计软件进行进一步分析（图1）。完整的PDO以5 µL BME穹顶形式接种于96孔板中，BME与类器官培养基按预设比例混合（通常为1:1）。本方案采用UltiMatrix作为BME，因其批次间差异极小且成像光学性能优异。若使用其他BME（如Matrigel）培养的PDO，或对于成团且难以解离的模型，可能需要相应调整收获方法（参见示例 补充图4）。接下来，在接种时（第-1天），将荧光染料以2倍浓度加入100 µL类器官培养基中，随后过夜孵育，以确定基础细胞死亡水平。次日（第0天），将药物或其他处理物以2倍浓度加入100 µL类器官培养基中，再添加至各孔，最终体积为200 µL。200 µL的终体积有助于减少成像时的弯月面效应。动力学图像通过Cytation 5酶标仪与BioSpa台式培养箱联用系统获取。BioSpa培养箱可将实验板维持在恒定的37 °C温度和5% CO2环境中。BioSpa最多可容纳8块板，因此可同时开展8个实验。每块板的成像参数在Gen5软件中通过"成像仪手动模式"进行设置，并保存为一个协议。该协议随后载入调度软件（BioSpa OnDemand）。BioSpa OnDemand软件可自动执行动力学图像采集的工作流程，包括将板从BioSpa培养箱物理转移至Cytation 5，并指定Gen5中运行的数据采集协议。图像使用Gen5软件中的“细胞分析”功能进行分析（图2）。我们描述了具体分析荧光和明场图像Z投影的方法。有关分析单个Z平面和/或仅明场图像的具体方法，请参见 补充文件1。最后，用户可自定义导出特定数据特征，如PDO面积、数量和平均荧光强度，以Excel表格形式导出，用于后续药物效应的统计分析。

鉴于类器官（PDO）模型作为一种相对较新的用于研究药物效应的模型系统，针对其培养条件（特别是在基底膜提取物BME中生长）的实验方法仍在不断发展16。目前大多数评估PDO对药物处理反应的研究依赖于基于ATP的终点检测法，以细胞活力作为细胞健康状况的替代指标（CellTiter-Glo 3D）。该方法需要裂解细胞，因而无法进行后续的下游分析。其他替代性终点检测方法，如荧光染色、单时间点成像和形态学追踪，提供了可用于表征药物反应的多种指标，同时允许样本用于其他用途。例如，已建立的板内终点固定方案已被用于药物效应的高通量分析17,18。该方法的优势在于避免了常规免疫组织化学和免疫荧光成像所需的复杂处理步骤19，在样本量有限的情况下尤为适用，而这正是PDO模型的典型情况。该方法也适用于共聚焦显微镜的高分辨率成像。另一种无需细胞裂解的终点检测方法是使用碘化丙啶（propidium iodide）或吖啶橙（acridine orange）等试剂进行活细胞成像。我们对CellTiter-Glo 3D与AOPI（后者无需细胞裂解）在评估细胞活力与死亡方面的比较分析（图6C）突显了在PDO模型中使用活细胞成像染料的优势。该方法已被包括我们团队在内的多个研究组应用于实验结束时对表型效应的评估18,19,20。然而，无论是采用孔内固定还是终点活细胞成像方法获取动力学数据，均需要大量样本。通过无标记的形态学评估对PDO进行长期动态监测可在一定程度上克服这一限制，并可利用多种成像方式实现8,10,17,18，但形态学变化可能无法全面反映药物作用的全部谱系，例如细胞凋亡和细胞活力变化等。我们观察到不同PDO模型在药物刺激下形态学变化存在显著差异。例如，某些PDO在发生凋亡时面积增大，而其他模型则可能缩小。目前仅有少数研究将动力学形态学评估与固定或活细胞荧光终点检测方法联用18,20。本文所介绍的方法是首批在高通量系统中通过多重荧光染料同时评估多种细胞效应的方法之一。

活细胞动力学成像技术最重要的改进之一在于克服了终点检测方法所存在的关键局限性。例如，由于大多数自动细胞计数仪对小于60 µm的物体设有检测门限，因此在每个孔中接种相同数量的PDOs 在技术上具有挑战性。活细胞成像技术可在0小时对每个孔中的PDOs数量或面积进行归一化处理，从而用于校正不同孔之间接种量的差异。目前PDOs的金标准终点检测方法是CellTiter-Glo 3D试剂盒，该方法通过检测ATP水平来间接反映细胞活力。我们在妇科肿瘤和前列腺癌PDOs的研究中已广泛使用该检测方法13,21,22,23,24。除了需要裂解细胞以检测ATP外，药物 及其他治疗手段也可能改变ATP水平，从而可能导致对治疗反应的评估不准确。使用活细胞成像染料可量化更广泛的特异性细胞反应，例如细胞凋亡和细胞毒性。重要的是，这些试剂不会影响细胞活力或引起DNA损伤（与碘化丙啶不同），因此可实现对PDOs反应的多次连续评估。尽管我们尚未探索吖啶橙（AO）在动力学检测中的应用，但其作用机制并不排除未来将其用于此类检测的可能性。

肿瘤由多个具有不同基因组特征和形态的细胞群体组成。由于类器官（PDO）模型具有复杂的异质性，各个PDO 的反应可能存在差异，追踪这些反应具有挑战性。我们的实验方案提供了一种以孔为单位评估多种PDO反应指标的方法。然而，活细胞成像仍需考虑若干技术因素。将类器官接种至96孔板所需的24孔板孔数，取决于每种PDO模型的密度和生长速率。由于细胞团块可能干扰图像分析（补充图4），PDO模型在接种前可能需要额外的处理步骤。如有必要，可在处理过程中使用非宽口的p200枪头剧烈吹打，以机械剪切类器官。接种前也可使用TrypLE Express进行酶消化，促进类器官解离并减少团块形成。根据我们的经验，TrypLE孵育时间因模型而异，差异较大。因此，应针对每种模型优化TrypLE的孵育条件，尤其是在研究人员希望获得单细胞悬液的情况下。对于特别敏感于酶消化的PDO模型，在开始处理前可能需要一定的恢复时间。

我们介绍了用于特异性活细胞成像试剂的方法。本方法广泛应用的一个限制因素是，目前可用于BME的试剂种类有限。对于尚未在PDO中优化使用的其他染料或试剂，可能需要进一步的故障排查，以确定最佳浓度并最小化溶剂效应。根据感兴趣的检测指标（例如细胞凋亡或细胞毒性），应使用已知可诱导细胞死亡的化合物（如staurosporine或daunorubicin13）进行处理，以优化试剂条件。另一个需要考虑的因素是染料整合入BME半球结构的最佳时间。在我们的实验中，我们在处理前进行过夜孵育，以确保染料完全被半球结构吸收，并评估细胞的基础健康状态。由于信号强度会随时间增强，研究人员应通过预实验确定实验结束时的理想曝光时间，以避免图像过度曝光。最后，所用试剂不应干扰细胞的正常生理过程。例如，能够插入DNA的染料不适用于动力学成像。然而，活细胞成像可用于终点检测中的数据归一化。事实上，我们提供了一种补充方法，利用AOPI定量细胞活力以及活细胞与死细胞的比例。在本实验中，每个孔的荧光信号均根据第0天（处理当天）活细胞成像所确定的PDO数量进行归一化（图6）。

本方法学论文的另一个局限性在于实验依赖手动移液操作，这可能导致技术重复之间的变异性增大。通过将自动化技术引入实验流程的其他步骤，例如使用自动化液体处理系统进行铺板和药物分配，可进一步提高数据的可重复性，已有其他研究对此进行了验证8,10。然而，这一改进需要额外的研究基础设施投入，并非所有研究人员均可获得。鉴于每个模型中PDO面积存在异质性，在自动化接种条件下，仍将结果标准化至0小时初始PDO数量或面积，仍是一种有效的处理方法。

与其它活细胞成像平台相比，Cytation 5 的一个关键优势在于能够自定义图像采集和分析功能。然而，Cytation 5/Gen5 软件的学习曲线较为陡峭，且默认用户已具备成像技术的基础知识。本方法学论文的目标之一是提供逐步操作指南，以降低其他研究人员在其类器官（PDO）研究项目中引入复杂活细胞成像技术的门槛。尽管本文所展示的具体分析步骤针对某一特定系统，用户仍可将多重成像原理应用于其他平台，但需注意后续分析可能需要借助第三方软件（如 NIH ImageJ）来完成。

分析指标的选择应基于实验目标和铺板条件。例如，如果实验使用荧光染料来定量细胞死亡，则荧光强度是一种有效的检测信号。最合适的荧光指标（总荧光强度与对象平均荧光强度）取决于铺板条件（补充图4）。如果类器官（PDO）分布均匀且形态更接近圆形、结构紧密，则可在定义的PDO亚群中测定荧光信号。在Gen5软件中，该功能为“细胞分析”（Cellular Analysis），输出结果为“对象平均荧光强度”（Object Mean Intensity）。然而，如果PDO模型呈团块状或结构松散，则建议在图像层面定量荧光信号；该功能位于“图像统计”（Image Statistics）下，输出结果为“总荧光强度”（Total Fluorescence Intensity）。尽管该方法适用于观察单个孔在实验过程中的变化，但该指标并非特异性针对目标对象，若PDO在实验期间移出指定区域，则可能导致结果出现偏差。在存在大量碎片或死亡的单个细胞的情况下，建议使用“细胞分析”功能，以排除与PDO无关的荧光信号。使用“细胞分析”与“图像统计”所得结果差异的示例见于补充图5。

为了确定图像统计功能的最佳阈值，可以使用线条工具。通过线条工具，用户能够确定图像内荧光强度的范围。我们将图像中峰值强度的25%值设定为下限阈值。要查看包含在指定阈值范围内的荧光区域，请勾选"阈值异常值"复选框。可能需要进一步微调下限阈值数值。

活细胞成像中的一个重大挑战是存储每次实验产生的大量数据。这一点在类器官（PDO）培养中尤为突出，因为通常需要使用Z轴层扫技术对多个焦平面进行成像，并生成Z投影图像。有多种方法可以解决这一问题。首先，应确保具备充足的存储容量。我们安装了三块固态硬盘，总容量达17 TB。其他选择包括将实验文件传输至外接硬盘或网络存储设备。不建议直接将文件写入基于云的存储系统。若需分析存储在外接驱动器上的数据，只需将实验文件和图像文件传输至配备Gen5软件的计算机即可（注意：大文件可能需要较长时间才能完成传输）。在分析前，必须将图像重新链接到实验文件。打开实验文件后，点击工具栏中的“Protocol”，选择“Protocol Options”，然后点击“Image Save Options”，再点击“Select new image folder”。找到图像文件所在文件夹后，点击“Select Folder”以完成重新链接。

根据实验目的，也可考虑在Gen5软件中使用像素合并（binning）功能。像素合并通过降低像素数量来减小文件大小，但会降低图像分辨率（参见步骤3.5.3.2）。因此，若需要高分辨率图像，则不建议使用该功能。使用像素合并功能时，需调整曝光参数。创建实验文件后，双击“图像”部分，然后点击显微镜图标以重新打开成像仪手动模式。可根据需要使用自动曝光功能或手动调节曝光参数。

综上所述，我们介绍了评估类器官（PDO）在细胞毒性药物作用下发生凋亡及细胞健康状况的方法。未来的研究需要进一步优化这些方法，并开发针对类器官动力学成像的其他分析策略，例如针对其他表型或非细胞毒性而是细胞抑制性药物效应的分析。目前面临的主要障碍是市场上缺乏与基底膜提取物（BME）兼容的染料和试剂。要充分挖掘此类模型的动力学活细胞成像潜力并获取最丰富的数据，仍需开展更多研究工作。

披露

KWT 是 Immortagen 公司的共同所有人。CJD 是安捷伦（Agilent）的员工。JSdB 曾在阿斯利康（Astra Zeneca）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Bioxcel Therapeutics、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、卫材（Eisai）、基因泰克/罗氏（Genentech/Roche）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、Harpoon、ImCheck Therapeutics、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（Merck Sharp & Dohme）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、辉瑞（Pfizer）、凯杰（Qiagen）、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、泰尔茂（Terumo）和 Vertex Pharmaceuticals 的顾问委员会任职并收取费用；是英国癌症研究所（Institute of Cancer Research, ICR）的员工，该机构已从阿斯利康（AZ）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、基因泰克（Genentech）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（MSD）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、辉瑞（Pfizer）和 Vertex 等公司获得其研究工作的资助或其他支持，且该机构在阿比特龙、DNA 修复缺陷型癌症中的 PARP 抑制以及 PI3K/AKT 信号通路抑制剂方面拥有商业利益（JSdB 本人无个人收入）；被列为强生公司提交的专利 8 822 438 的发明人之一，该专利涉及醋酸阿比特龙与皮质类固醇联合使用的方案，但本人无经济利益；曾担任多项由企业资助的临床试验的首席研究员（CI/PI）；同时是英国国家卫生研究所（National Institute for Health Research, NIHR）高级研究员。其他作者均无潜在利益冲突需披露。

致谢

我们感谢爱荷华大学组织采集核心实验室及Kristen Coleman博士提供患者肿瘤标本，同时感谢妇产科的Sofia Gabrilovich博士在PDO模型构建过程中提供的协助。我们还感谢Agilent公司（美国）的Valerie Salvatico博士对本文稿的审阅与关键性分析。本研究得到以下基金支持：NIH/NCI CA263783和DOD CDMRP CA220729P1（资助KWT）；癌症研究英国（Cancer Research UK）、前列腺癌英国（Prostate Cancer UK）、前列腺癌基金会（Prostate Cancer Foundation）以及医学研究理事会（Medical Research Council）（资助JSdB）。资助方未参与实验设计、数据分析或发表决定。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Dot Scientific Inc1008113
15 mL 圆锥形离心管Sarstedt62.554.100
554 NM LED 模块Agilent1225012
96 孔板Corning Costar3596预热至 37 °C
96 孔板Agilent204626-100预热至 37 °C
A83-01Tocris2939终浓度为 500 nM（类器官培养基组分）
Advanced DMEM/F-12Gibco12634-010类器官培养基组分
B27 补充剂Gibco17504044终浓度为 1x（类器官培养基组分）
BioTek BioSpa 8 自动化培养箱AgilentBIOSPAG-SN台式培养箱；BioSpa OnDemand 调度软件与 Gen5 通信，用于在 BioSpa 与 Cytation 5 之间转移培养板以进行成像（本方案使用版本 1.01.10）
BioTek Cytation 5 细胞成像多功能读板仪AgilentCYT5PW-SN读板仪；本设备使用 Gen5 软件（本方案使用版本 3.12.08）
Cultrex UltiMatrix 低生长因子基底膜提取物R&D SystemsBME001-10
盐酸柔红霉素Sigma-AldrichS3035用 DMSO 重悬
二甲基亚砜Sigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
福斯科林Tocris1099终浓度为 10 µM（类器官培养基组分）
GlutamaxGibco35050-061终浓度为 1x（类器官培养基组分）
HEPESGibco15630-080终浓度为 10 mM（类器官培养基组分）
人 EGF，无动物源重组蛋白GibcoAF-100-15-1MG终浓度为 0.5 ng/mL（类器官培养基组分）
人 FGF-10 重组蛋白Gibco100-26-1MG终浓度为 10 ng/mL（类器官培养基组分）
人 R-Spondin 1 重组蛋白Gibco120-38-5UG终浓度为 250 ng/mL（类器官培养基组分）
氢化可的松储备液StemCell Technologies7926终浓度为 500 ng/mL（类器官培养基组分）
成像滤光模块 - GFPAgilent1225101
成像滤光模块 - TRITCAgilent1225125
成像 LED GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V 红色染料Sartorius4641用类器官培养基重悬
Incucyte Cytotox 绿色染料Sartorius4633DMSO 溶液
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma-AldrichA7250终浓度为 1.25 mM（类器官培养基组分）
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 染色液Fisher-Scientific13366169按 1:50 体积添加
烟酰胺Sigma-AldrichN0636终浓度为 10 mM（类器官培养基组分）
NogginR&D Systems6057-NG终浓度为 100 ng/mL（类器官培养基组分）
青霉素-链霉素Gibco15140122终浓度为 10 单位/mL（类器官培养基组分）
磷酸盐缓冲液 (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05终浓度为 100 µg/mL（类器官培养基组分）
重组人 Heregulinβ-1Pepro Tech100-03终浓度为 37.5 ng/mL（类器官培养基组分）
链霉菌来源的星形孢菌素溶液Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632，CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000终浓度为 5 µM（类器官培养基组分）
β-雌二醇Sigma-AldrichE2758终浓度为 100 nM（类器官培养基组分）

参考文献

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用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像
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