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方法文章

用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像

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DOI：

10.3791/66072

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2024年1月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。

摘要

癌症患者来源类器官（PDO）模型是一种多功能研究体系，相较于癌细胞系，能更真实地模拟人类疾病。PDO模型可通过将患者肿瘤细胞在细胞外基底膜提取物（BME）中培养，并以三维半球状形式接种来建立。然而，市面上许多为单层培养中表型检测而优化的试剂通常与BME不兼容。本文介绍一种利用自动化活细胞成像系统接种PDO模型并评估药物效应的方法。此外，我们应用了适用于动力学检测的荧光染料，以同时定量细胞健康状态和细胞凋亡。图像采集可自定义为在数天内按固定时间间隔进行。用户可分析单个Z平面图像，或对多个焦平面连续图像生成的Z投影进行分析。通过掩膜（masking）技术，可计算特定感兴趣参数，如PDO数量、面积和荧光强度。我们提供了概念验证数据，展示了细胞毒性药物对细胞健康、凋亡及存活率的影响。该自动化动力学成像平台可进一步拓展至其他表型读出指标，以深入理解各类治疗手段在癌症PDO模型中的作用效果。

引言

患者来源的肿瘤类器官（PDOs）正迅速成为研究癌症发生发展及治疗反应的有力模型系统。PDOs 是一种三维（3D）细胞培养系统，能够重现原发肿瘤复杂的基因组特征和组织结构1,2。与传统的永生化癌细胞系二维（2D）培养相比，PDOs 能够捕捉并维持肿瘤内异质性3,4，使其成为机制研究和转化研究的重要工具。尽管 PDOs 正日益成为广受欢迎的模型系统，但目前可用于 PDO 培养体系、且与之兼容的商业化试剂和细胞效应分析方法仍十分有限。

目前缺乏用于分析治疗反应细微变化的可靠方法，这阻碍了临床转化。在三维培养中，细胞健康检测试剂的金标准——CellTiter-Glo 3D，利用ATP水平作为细胞活力的判断依据5,6。尽管该试剂适用于终点检测，但仍存在若干局限性，其中最显著的是检测完成后样本无法用于其他用途。

活细胞成像是一种复杂的动力学显微技术，当与荧光试剂结合使用时，能够在PDO模型中定量检测多种细胞健康指标，包括细胞凋亡7,8,9和细胞毒性10。事实上，活细胞成像在二维平台化合物高通量筛选中已发挥关键作用11,12。诸如Incucyte等系统使该技术成本降低，从而让各类研究团队均能获得使用机会。然而，将这些系统应用于分析三维培养物仍处于起步阶段。

本文介绍了一种利用多重活细胞成像技术评估癌症类器官（PDO）模型中药物反应的方法（图1）。通过分析明场图像，可对PDO 的大小和形态变化进行动力学监测。此外，还可使用荧光试剂同时随时间定量细胞过程，例如采用Annexin V Red Dye检测细胞凋亡，Cytotox Green Dye检测细胞毒性。所述方法已针对Cytation 5活细胞成像系统进行优化，但本方案亦可适配于其他不同的活细胞成像平台。

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方案

本研究使用的人类肿瘤标本相关研究已通过爱荷华大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准（方案编号：201809807），并依照1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版所规定的伦理标准进行。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。纳入标准包括确诊为癌症且有可获取的肿瘤标本。

1. 在96孔板中接种完整的PDO

  1. 准备试剂。
    1. 将96孔板在37 °C预热过夜，并在4 °C下解冻基底膜提取物（BME）过夜。
    2. 配制适用于目标癌症类型培养的完整类器官培养基。本文所示实验所用的具体培养基详见补充表1。
      注意：不同肿瘤类型可能需要调整培养基成分。例如，妇科肿瘤的类器官培养基需添加100 nM雌二醇13。配制好的培养基在4 °C可稳定保存1个月。如需长期保存，将培养基分装至50 mL离心管中，于-20 °C储存。
  2. 分别准备4 °C和37 °C的两份类器官培养基。例如，若在96孔板中接种60个孔，则使用6 mL预热的类器官培养基和150 µL冰上预冷的类器官培养基。
  3. 配制类器官洗涤缓冲液：在1x PBS中添加10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA和10 µM Y-27632。4 °C保存。
  4. 收获在24孔板中培养的患者来源类器官（PDO）。除非另有说明，所有步骤均在冰上或4 °C进行。
    1. 使用真空系统吸除各孔中的培养基。
    2. 加入500 µL冰上预冷的类器官洗涤缓冲液，使用1000 µL移液器轻柔吹打2–3次。将板置于冰上孵育10分钟。
    3. 将每孔内容物转移至50 mL锥形离心管中。为确保所有PDO均处于悬浮状态，用额外300 µL类器官洗涤缓冲液冲洗每孔，并将冲洗液转移至50 mL锥形离心管中。在4 °C以350 × g离心5分钟。
    4. 使用真空系统吸除BME/类器官沉淀上的上清液，管中保留约5 mL液体。加入20 mL类器官洗涤缓冲液，使用10 mL血清移液管轻柔重悬沉淀。冰上孵育10分钟。
    5. 在4 °C以350 × g离心5分钟。使用真空系统小心吸除上清液，注意不要扰动PDO沉淀。
  5. 在96孔板中接种PDO：除非另有说明，所有步骤均在冰上进行。
    1. 用适量冰上预冷的类器官培养基重悬PDO沉淀，制备PDO悬液。 将PDO悬液转移至冰上预冷的1.5 mL微量离心管中。
      注意：为计算所需类器官培养基的体积，需确定将在96孔板中接种的孔数，注意PDO将以5 µL液滴形式接种，且类器官培养基与BME的体积比为1:1。例如，当接种一个96孔板且仅使用内部60个孔时，所需PDO悬液总体积为300 µL：150 µL类器官培养基和150 µL BME。对于在不同BME浓度下表现出最佳生长的模型，可在本步骤中调整BME与培养基的比例，但重要的是，在同一特定模型的所有实验中应保持该比例一致。为补偿移液误差，每种组分额外增加10%体积。
    2. 计数PDO数量。
      1. 取2.5 µL PDO悬液转移至冰上预冷的1.5 mL微量离心管中，与2.5 µL BME混合。将5 µL混合液滴加至洁净的玻璃显微镜载玻片上。无需加盖盖玻片。混合液将凝固成圆顶状。
      2. 在4倍明场显微镜下观察。计数5 µL混合液中的PDO数量；目标为每5 µL液滴中含有约25–50个PDO。
        注意：若测试混合液中未达到理想密度，可通过添加更多类器官培养基，或离心PDO悬液后用更少体积的冰上预冷类器官培养基重悬沉淀，来调整PDO悬液的最终体积。无论本步骤中如何调整PDO悬液，步骤1.5.3中的BME与PDO悬液的最终比例应保持1:1。
    3. 使用配有宽口吸头的200 µL移液器，小心地将PDO悬液与等体积的BME混合，使类器官培养基与BME的比例达到1:1。避免产生气泡，以免破坏液滴结构。 
    4. 使用20 µL移液器，将5 µL液滴接种至预热的96孔板各孔中央，仅接种内部60个孔。为确保PDO均匀分布，定期使用配有宽口吸头的200 µL移液器吹打1.5 mL离心管中的悬液。
    5. 所有孔接种完成后，盖上板盖并轻轻倒置。将倒置的板置于37 °C细胞培养箱中孵育20分钟，使液滴凝固。
      注意：倒置板可确保BME/类器官培养基液滴维持三维结构，为PDO形成提供充足空间。
    6. 将板翻转，使板盖朝上，于37 °C孵育5分钟。

2. 多重检测中处理步骤及荧光染料的添加

  1. 在96孔板中BME圆顶凝固的同时，配制荧光活细胞成像试剂的稀释液。本文提供了Annexin V Red Dye与Cytotox Green Dye多重检测的具体参数。
  2. 荧光试剂配制（第-1天）：根据待处理孔数计算所需类器官培养基的适当体积，假设每孔将加入100 µL含染料的培养基。将染料用预热的类器官培养基稀释至所需浓度。
    注意：所需培养基的总体积取决于具体实验。为弥补移液误差，最终体积应额外增加10%。例如，若处理96孔板内侧60个孔，则需配制6.6 mL含染料的培养基（表1）。
  3. 向每孔加入100 µL 2倍浓度的含染料类器官培养基。向板的外周空孔中加入200 µL无菌1x PBS。于37 °C过夜孵育。
    注意：外周孔中的PBS可减少内孔培养基的蒸发。
  4. 添加药物/处理剂（第0天）：将药物用预热的类器官培养基配制成每孔100 µL、浓度为2倍的工作液。
    注意：DMSO在高浓度下对细胞具有毒性。本研究中所有实验的DMSO终浓度均未超过0.1%。此外，除药物外，某些荧光试剂也以DMSO溶液形式提供。使用此类试剂时，必须考虑总体DMSO浓度。
  5. 向每孔加入100 µL 2倍浓度的含染料培养基；避免产生气泡。

3. 设置成像参数

  1. 将培养板放入 Cytation 5 中。 打开 Gen5 软件。点击 新任务 > 成像仪手动模式选择 立即捕获 并输入以下设置： 目标 （选择所需放大倍数）； 过滤 （选择微孔板）； 微孔板格式 （选择孔的数量）；以及 血管类型 （选择培养皿类型）。点击 使用盖子 和 使用较慢的载物台移动速度. 点击 好的.
    注意：容器类型：选择关于培养板的信息时，应尽可能具体，因为软件针对每种培养板类型及其塑料厚度，已校准物镜到培养板底部的特定距离。
    ​较慢的载板移动速度：选中此选项可在加载/卸载板时避免扰动凝胶圆顶结构。
  2. 创建一个Z轴层扫，以对整个BME圆顶进行成像。
    1. 选择感兴趣的孔进行查看（直方图下方左侧面板）。
    2. 选择 明场通道 （左侧面板，顶部）。点击 自动曝光 并调整 设置 根据需要。
    3. 设置Z轴层扫的底部和顶部：展开 成像模式 标签（左侧面板，中部）。检查 Z轴层扫 使用粗调箭头（左侧面板，中间），点击向下调节，直至所有类器官进入视野后又移出焦点，变得模糊。将此位置设为Z轴层扫的底部。然后使用粗调箭头沿相反方向重复操作，设定Z轴层扫的顶部。
    4. 为确保Z-栈设置适用于其他目标孔，请选择另一个孔（直方图下方的左侧面板），并观察Z-栈的顶部和底部。
    5. 要手动输入焦平面位置，请点击精细调节旁的三个点（左侧面板，顶部）。此时将打开一个窗口；在其中输入Z轴层扫的顶部值（位于左侧面板中部下方） 成像模式）。对底部Z轴层扫描值重复上述操作。根据需要重复步骤3.2.3，以调整并获取所需的Z轴范围。若进行了调整，应选择另一个孔以验证设置。
  3. 设置荧光通道的曝光参数。以下针对两个荧光通道（GFP）描述设置方法。 & TRITC)。荧光通道的具体数量取决于实验需求以及活细胞成像系统中安装的荧光滤光片组。
    注意：如果预计实验结束时信号强度会显著增强，建议用户先进行预实验，以确定实验结束时的最佳曝光参数，随后在设定初始参数时应用这些优化条件。
    1. 展开 成像模式 选项卡（左侧面板，中间）并打开 编辑成像步骤将出现一个弹出窗口。
    2. 在下方 通道，点击所需通道数量的气泡。指定一个通道用于 明场及每个荧光通道对应的附加通道。在此示例中 通道 1 明场 通道 2 = GFP 通道 3 = TRITC。使用下拉菜单 颜色 菜单中，为每个通道选择合适的设置。通过点击关闭编辑窗口 好的.
    3. 设置每个荧光通道。
      1. 切换至GFP通道（左侧面板，顶部）。
      2. 点击 自动曝光 （左侧面板，顶部）。展开 暴露 点击（左侧面板，中间），调整曝光设置以最小化背景信号。
      3. 将曝光设置复制到 图像模式 参照步骤 3.3.3.3-3.3.3.6
      4. 点击 复制 图标旁边的 编辑成像步骤 盒。点击 编辑成像步骤，这将打开另一个窗口。
      5. 在GFP通道下，单击 剪贴板 图标在 暴露 添加的行 光照, 积分时间，以及 相机增益 通道设置。
      6. 对TRITC通道重复步骤3.3.3.4-3.3.3.5。点击 好的 关闭窗口。
  4. 设置图像预处理和Z轴投影步骤，以实现图像预处理的自动化。
    1. 点击 相机 图标（左侧面板，底部角落）。新窗口将打开。
    2. 下方 添加处理步骤 （左侧面板，底部），单击 图像预处理将打开一个新窗口。
    3. 在 明场 标签，取消选择 应用图像预处理.
    4. 对于每一个 荧光通道 标签，确保 应用图像预处理 被选中。取消选择 使用与通道1相同的选项 并点击 好的窗口将关闭。
    5. 下 添加处理步骤，点击 Z 投影将打开一个新窗口。如有需要，可调整切片范围（例如，缩小Z轴范围）。通过选择关闭该窗口 好的.
  5. 创建实验方案
    1. 点击 图像集 在工具栏中。在下拉菜单中，点击 从该图像集创建实验。该 成像窗口 将关闭，且 操作窗口 将打开。
      注意：所选参数在 成像仪手动模式 将自动加载到新窗口中，从而可创建实验方案。
    2. 设置温度和梯度：点击 设置温度 在……之下 操作 标题（左侧）。新窗口将打开。选择 培养箱开启 并在下方手动输入所需温度 温度接下来，在……下方 梯度，手动输入 1. 通过选择关闭窗口 好的.
      注意：设置1 °C的温度梯度可防止冷凝液在培养板盖上形成。
    3. 将孔位指定到图像。
      1. 双击 图像步骤 下 描述. 点击 全板 （右上角）。这将打开 板布局 窗口
      2. 使用光标高亮标记感兴趣的孔。点击 好的如需要，可进行检查 自动对焦像素合并 和 捕获分箱 盒子。点击 好的 关闭窗口。
        注意：如上文步骤 3.3.3.2 所述，合并像素（binning）需要调整曝光参数。有关此功能可能适用的具体情况，请参见讨论部分。
    4. 设置动力学成像的时间间隔。
      1. 点击 选项 在……之下 其他 标题（左侧）。检查 不连续动力学程序 盒子
      2. 下 预计总时长，输入实验的运行时间（例如，5 天）。在下方 估计间隔，输入对培养板进行成像的时间间隔（例如，每6 h）。
      3. 点击 每次运行后暂停 以留出足够时间将培养板转移至培养箱。通过选择关闭窗口 好的.
    5. 更新数据约简步骤。
      1. 点击 好的 关闭 操作窗口将打开一个选项卡以更新数据处理步骤。选择 是. 双击 图像预处理. 依次点击不同通道以确认设置，然后点击 好的.
      2. 双击 Z 投影. 依次点击不同通道以确认设置。点击 好的然后，单击 好的 再次关闭 数据缩减窗口.
    6. 设计酶标板布局。
      1. 打开 平板布局向导 并按照步骤 3.6.2-3.6.3 指定孔板类型。
      2. 点击 板布局 工具栏左上角的图标以打开 平板布局向导.
      3. 勾选实验中使用过的孔类型。在下方 检测对照，使用箭头输入不同类型对照的数量。点击 下一步 打开 检测对照 #1 窗口。
      4. 按照步骤 3.6.5-3.6.8 设置检测对照孔条件。
      5. 在 检测对照 #1 窗口中，输入控制标签 板布局编号 框中。如有需要，可在相邻框中输入全名。使用箭头选择相应对照条件的重复次数。
      6. 如果在对照中使用多个浓度或浓度梯度系列，请点击 定义稀释度/浓度 并使用下拉菜单选择 类型在表格中输入每个浓度/稀释度的数值。
        注意：如果浓度以恒定增量变化，可使用自动功能。
      7. 选择 颜色 工具栏中的标签。在下拉菜单中选择控件所需的文字颜色和背景颜色。单击 下一步.
      8. 根据需要使用额外的对照重复操作。
      9. 按照 3.6.10–3.6.12 设置样品孔条件。
      10. 在 样品设置 页面中输入样本编号前缀（例如，SPL）。使用箭头选择重复次数。若使用不同处理浓度的样本，请选择 浓度或稀释 在 类型 下拉菜单。在表格中输入稀释度/浓度，并在单位栏中输入单位 单位 盒子
      11. 选择 鉴定区域 在工具栏中。输入所需的 类别名称 （例如，样本编号、药物）在表格中。
      12. 选择 颜色 工具栏中的标签。为每个处理组/样本选择不同的颜色。点击 完成这将打开“板布局”页面。
        注意：左侧的数字与不同的样本编号相对应。
      13. 按照步骤 3.6.14–3.6.16 分配样本编号。
      14. 选择 左侧面板中的 SPL1。使用光标选择孔位。
        注意：可在序列分配框中调整自动选择工具。可预先指定重复次数和布局方向。
      15. 用其他样品重复上述步骤，完成整块板的布局。确认无误后， 点击 好的。
      16. 在 文件 工具栏，选择 样本编号填充 样本编号 为每个样本输入相应的信息列（例如，药物类型）。点击“确定”。
    7. 保存实验方案。
      1. 在工具栏中，单击 文件 > 保存 方案 as. 选择 保存文件的位置。输入文件名。点击 保存 关闭窗口。
      2. 点击 文件 > 退出 在工具栏中。将打开一个标签页以保存更改到 成像仪手动模式 选择 无.
      3. 将打开一个标签页以保存对实验1的更改。请选择 无将打开一个标签页以更新协议定义。选择 更新关闭软件。
  6. 将方案导入 BioSpa OnDemand 并完成实验设置。
    1. 打开 BioSpa OnDemand（调度软件）。
    2. 在软件中选择一个可用的插槽。
    3. 从活细胞成像系统中取出培养板。点击 打开抽屉 进入调度软件中的相应槽位并插入培养板。点击 关闭侧边栏.
      注意：此步骤可在上述 3.5.7 步骤创建方案后的任意时间执行。然而，必须将培养板置于 Cytation 5 中，才能在下文的步骤 3.6.4.3 中进行定时运行。
    4. 导入实验方案。
      1. 在……之下 操作信息 标签，选择 用户 在下拉菜单中。接下来，位于 实验方案 槽，点击 选择 > 添加新条目.
      2. 在“方案”插槽旁，点击 选择这将打开一个新窗口，以便在文件架构中导航至所需的方案。单击 开放 将方案导入排程软件。
      3. 输入成像所需时间。点击 好的 关闭 Gen5 实验方案列表 窗口。
        注意：当同时进行多个实验时，此步骤尤为重要。要确定成像所需时间，请单击 现在执行一次计时运行点击 好的.
    5. 设置成像时间间隔并安排实验计划。
      1. 下方 间隔，输入步骤 3.5.4 中指定的成像时间间隔。
      2. 下 开始时间选项，选择 当可用时. 在 持续时间, 选择固定 或 连续的.
        注意：可指定特定的开始时间，而非在下一个可用时间运行方案。选择 固定时长 将为实验设定一个特定的终点，并要求用户指定实验的时间范围。 持续时间 将允许实验持续运行而无终点，只能由用户手动停止实验来结束。
      3. 点击 安排培养板/容器。这将打开板验证序列。一个包含建议的首次读取时间的新标签页将会打开。点击 是 接受此时间安排。

4. 使用 Gen5 软件进行图像分析（图 2）

  1. 打开图像分析模块。
    1. 打开 Gen5。在 任务管理器 中，选择 实验 > 打开。选择要打开的实验文件。在工具栏中点击 板 > 查看。
    2. 将 数据 下拉菜单更改为 Z 投影。双击感兴趣的孔。选择 分析 > 我要设置一个新的图像分析数据缩减步骤。点击 确定。
  2. 细胞分析
    1. 主掩膜
      1. 在 分析设置 下，选择 类型：细胞分析，检测通道：ZProj[Tsf[Bright Field]] （左侧面板，中间）。
      2. 点击 选项，将打开 主掩膜与计数 页面。在 阈值 框中，勾选 自动 并点击 应用。勾选 高亮对象 框（右侧面板，底部），以显示指定阈值范围内的对象。根据需要进行调整，以包含感兴趣的对象。
        注：阈值设置基于像素强度。例如，若阈值设为 5000，则强度大于 5000 的像素将被纳入分析。
      3. 在 对象选择 下，设定最小和最大对象尺寸（µm）。根据需要进行调整，以排除细胞碎片或单个细胞。
        注：PDO 的大小在不同模型和类型之间可能存在显著差异。使用 Gen5 软件中的测量工具确定每种模型的最小和最大 PDO 尺寸阈值。用户可选择比测量工具提供的数值更小的最小 PDO 尺寸阈值，以防止在药物处理后的后期时间点排除 PDO 片段。
      4. 若要将分析限制在孔的特定区域，请取消勾选 分析整幅图像 并点击 插件。在 图像插件 窗口中，使用下拉菜单选择 插件 形状。根据需要调整大小和位置参数，以适配感兴趣区域。
        注：应尽可能在插件内包含更多的 PDO，同时排除无 PDO 区域，以最小化背景干扰。设定的插件尺寸应能在重复实验中稳定捕获大多数感兴趣对象。生成插件时还应排除穹顶边缘区域，因为边缘处极端曲率引起的光折射可能导致对象形变。也可取消勾选 包含主边缘对象 ，以仅捕获插件内部的完整 PDO。
    2. 亚群分析。图 3 提供了亚群划分的示例。
      1. 在 细胞分析 工具栏中点击 计算指标 。点击 选择或创建感兴趣的对象层级指标 （右下角）。在 可用对象 指标下，选择感兴趣的指标（例如，圆形度），然后点击 插入 按钮。点击 确定。
        注：每种 PDO 模型的形态和密度将决定用于区分亚群的最佳指标。
      2. 在 细胞分析 工具栏中点击 亚群分析 。点击 添加 以创建新的亚群，弹出窗口将打开。
      3. 如有需要，为该亚群输入名称。在 对象指标 下，选择一个感兴趣的指标并点击 添加条件。在 编辑条件 窗口中，输入所选 对象指标 的参数。根据需要重复添加其他指标。
        注：参数可手动调整，或使用查找工具设定。例如，为排除碎片，用户可将 面积 作为 对象指标，并选择小于 800 的对象。通常使用 圆形度 作为 对象指标，根据模型不同，通常包含圆形度大于 0.2–0.5 的对象。
      4. 在窗口底部的表格中，勾选希望显示的结果。点击 确定 > 应用。
      5. 要查看亚群内的对象，使用 对象详情 下拉菜单（右侧面板，中间）选择该亚群。符合参数条件的对象将在图像中被高亮显示。
        注：如需更改主掩膜和亚群的高亮颜色，请点击 设置 （右侧面板，底部）。
      6. 如需调整亚群参数，从 细胞分析 工具栏重新打开 亚群分析 窗口。选择亚群并点击 编辑。点击 添加步骤。
        ​注：此操作将对实验中所有时间点的所有孔应用相同的分析。在矩阵页面的下拉菜单中，可选择不同指标进行单独查看。

5. 将数据从 Gen5 导出至 Excel

  1. 要自定义数据文件以导出，请在工具栏中选择 报告/导出构建器 图标。在弹出窗口中，点击 新建导出至 Excel。
  2. 在弹出窗口的 属性 页面中，选择 范围 > 板和内容 > 自定义。点击工具栏中的 内容 选项，然后点击 编辑模板，这将打开 Excel 程序。
  3. 在电子表格中，选择 加载项 > 表格 > 孔数据。将鼠标悬停在各个选项上以查看导出选项。选择感兴趣的指标（例如，Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]）。
    注意：可通过选择 加载项 > 协议摘要 > 布局 将板布局添加到电子表格分析模板中。
  4. 将打开一个 编辑 窗口。在 孔 框中，通过孔编号（Well-ID）或孔号（Well #）指定要导出的孔。选择 确定。模板将被加载到电子表格文件中。关闭电子表格，模板将自动保存。
  5. 在 新建导出至 Excel 窗口中点击 确定，然后关闭 报告/导出构建器 窗口。
  6. 点击 Gen5 工具栏中的 导出 图标。勾选所需导出文件旁边的复选框，然后点击 确定。Gen5 将自动填充电子表格模板并在 Excel 中打开该文件。

6. 外部数据分析

  1. 在 Excel 中打开导出文件（.xlsx）。
  2. 对于每个孔，将其每个单独的数值除以该孔在 0:00 时间点的数值。这将使时间点 0 的值等于 1，之后每个数值均相对于初始读数进行归一化。
  3. 在数据分析软件中新建一个文件，选择 XY 布局 选项。
    注意：本实验方案中使用的是 GraphPad Prism（版本 9.5.1）。
  4. 输入每组数据的标签，将各处理组的时间点及相应的归一化数值复制粘贴至 Prism 表格中。数据图表将自动生成，并可在 图表 下查看。

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结果

我们的目标是证明利用多重活细胞成像评估类器官药物治疗反应的可行性。概念验证实验在两个独立的子宫内膜癌类器官（PDO）模型ONC-10817和ONC-10811中进行（见 补充图1 和 补充图2 对于ONC-10811数据）。在凋亡诱导剂星形孢菌素处理下，通过动力学方法监测细胞凋亡（annexin V染色）和细胞毒性（Cytotox Green摄取）。具体而言，将PDO细胞接种于96孔板中，加入Annexin V Red和Cytotox Green染料进行处理，随后置于 37 °C 孵育器中过夜，如图所示 图1. 我们在两个独立的PDO模型中证实，Annexin V和Cytotox Green染料处理无毒性（补充图2）。次日，使用浓度递增的星形孢菌素（0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、500 nM）处理PDO。随后，在Gen5软件中建立实验方案，设定实验持续5天，每6小时成像一次。数据采用Gen5软件中的细胞分析功能进行分析，具体方法见方案第4节。...

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讨论

由于能够反映细胞的响应和行为，PDO 培养物正成为一种日益流行的体外模型系统2。在 PDO 的生成、培养和扩增技术方面已取得显著进展，但针对治疗反应的分析方法却相对滞后。市面上可获得的三维细胞活力检测试剂盒均为裂解终点法检测，无法获取潜在的重要动力学响应数据，并且限制了后续采用其他方法进行的分析8。近期研究开始应用活细胞成像技术来评估 PDO 模型中的药物反应。本文中，我们提出一种利用多重荧光活细胞成像技术随时间评估 PDO 治疗反应的方法。通过荧光染料的多重标记，可同时定量多种不同的细胞反应。除了细胞凋亡和细胞毒性外，我们预计该方法在未来的研究中还可进一步拓展，用于检测 PDO 中的其他表型效应。

本方案旨在获取在96孔板中以穹顶状接种的PDO（类器官）的动力学明场和荧光图像。关键步骤包括：1）接种，2）加入染料和药物处理，3）设定成像参数，4）动力学图像采集完成后进行图像预处理与分析，以及5）将数据导出至其他统计软件进行进一步分析（图1

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披露

KWT 是 Immortagen 公司的共同所有人。CJD 是安捷伦（Agilent）的员工。JSdB 曾在阿斯利康（Astra Zeneca）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Bioxcel Therapeutics、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、卫材（Eisai）、基因泰克/罗氏（Genentech/Roche）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、Harpoon、ImCheck Therapeutics、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（Merck Sharp & Dohme）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、辉瑞（Pfizer）、凯杰（Qiagen）、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、泰尔茂（Terumo）和 Vertex Pharmaceuticals 的顾问委员会任职并收取费用；是英国癌症研究所（Institute of Cancer Research, ICR）的员工，该机构已从阿斯利康（AZ）、安斯泰来（Astellas）、拜耳（Bayer）、Cellcentric、第一三共（Daiichi）、基因泰克（Genentech）、Genmab、葛兰素史克（GSK）、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck Serono）、默克（MSD）、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、赛诺菲（Sanofi Aventis）、Sierra Oncology、大鹏制药（Taiho）、辉瑞（Pfizer）和 Vertex 等公司获得其研究工作的资助或其他支持，且该机构在阿比特龙、DNA 修复缺陷型癌症中的 PARP 抑制以及 PI3K/AKT 信号通路抑制剂方面拥有商业利益（JSdB 本人无个人收入）；被列为强生公司提交的专利 8 822 438 的发明人之一，该专利涉及醋酸阿比特龙与皮质类固醇联合使用的方案，但本人无经济利益；曾担任多项由企业资助的临床试验的首席研究员（CI/PI）；同时是英国国家卫生研究所（National Institute for Health Research, NIHR）高级研究员。其他作者均无潜在利益冲突需披露。

致谢

我们感谢爱荷华大学组织采集核心实验室及Kristen Coleman博士提供患者肿瘤标本，同时感谢妇产科的Sofia Gabrilovich博士在PDO模型构建过程中提供的协助。我们还感谢Agilent公司（美国）的Valerie Salvatico博士对本文稿的审阅与关键性分析。本研究得到以下基金支持：NIH/NCI CA263783和DOD CDMRP CA220729P1（资助KWT）；癌症研究英国（Cancer Research UK）、前列腺癌英国（Prostate Cancer UK）、前列腺癌基金会（Prostate Cancer Foundation）以及医学研究理事会（Medical Research Council）（资助JSdB）。资助方未参与实验设计、数据分析或发表决定。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Dot Scientific Inc1008113
15 mL 圆锥形离心管Sarstedt62.554.100
554 NM LED 模块Agilent1225012
96 孔板Corning Costar3596预热至 37 °C
96 孔板Agilent204626-100预热至 37 °C
A83-01Tocris2939终浓度为 500 nM（类器官培养基组分）
Advanced DMEM/F-12Gibco12634-010类器官培养基组分
B27 补充剂Gibco17504044终浓度为 1x（类器官培养基组分）
BioTek BioSpa 8 自动化培养箱AgilentBIOSPAG-SN台式培养箱；BioSpa OnDemand 调度软件与 Gen5 通信，用于在 BioSpa 与 Cytation 5 之间转移培养板以进行成像（本方案使用版本 1.01.10）
BioTek Cytation 5 细胞成像多功能读板仪AgilentCYT5PW-SN读板仪；本设备使用 Gen5 软件（本方案使用版本 3.12.08）
Cultrex UltiMatrix 低生长因子基底膜提取物R&D SystemsBME001-10
盐酸柔红霉素Sigma-AldrichS3035用 DMSO 重悬
二甲基亚砜Sigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
福斯科林Tocris1099终浓度为 10 µM（类器官培养基组分）
GlutamaxGibco35050-061终浓度为 1x（类器官培养基组分）
HEPESGibco15630-080终浓度为 10 mM（类器官培养基组分）
人 EGF，无动物源重组蛋白GibcoAF-100-15-1MG终浓度为 0.5 ng/mL（类器官培养基组分）
人 FGF-10 重组蛋白Gibco100-26-1MG终浓度为 10 ng/mL（类器官培养基组分）
人 R-Spondin 1 重组蛋白Gibco120-38-5UG终浓度为 250 ng/mL（类器官培养基组分）
氢化可的松储备液StemCell Technologies7926终浓度为 500 ng/mL（类器官培养基组分）
成像滤光模块 - GFPAgilent1225101
成像滤光模块 - TRITCAgilent1225125
成像 LED GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V 红色染料Sartorius4641用类器官培养基重悬
Incucyte Cytotox 绿色染料Sartorius4633DMSO 溶液
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma-AldrichA7250终浓度为 1.25 mM（类器官培养基组分）
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 染色液Fisher-Scientific13366169按 1:50 体积添加
烟酰胺Sigma-AldrichN0636终浓度为 10 mM（类器官培养基组分）
NogginR&D Systems6057-NG终浓度为 100 ng/mL（类器官培养基组分）
青霉素-链霉素Gibco15140122终浓度为 10 单位/mL（类器官培养基组分）
磷酸盐缓冲液 (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05终浓度为 100 µg/mL（类器官培养基组分）
重组人 Heregulinβ-1Pepro Tech100-03终浓度为 37.5 ng/mL（类器官培养基组分）
链霉菌来源的星形孢菌素溶液Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632，CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000终浓度为 5 µM（类器官培养基组分）
β-雌二醇Sigma-AldrichE2758终浓度为 100 nM（类器官培养基组分）

参考文献

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