采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

摘要

本文介绍了一种通过经颅电凝法在C57BL/6J小鼠中建立远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型的实验方案，并对随后的神经行为学表现及组织病理学特征进行评估。

摘要

缺血性脑卒中仍是全球成年人群中导致死亡和功能障碍的主要原因。仅有少数缺血性脑卒中患者能够在最佳时间窗内接受血管内溶栓或机械取栓治疗。在这些脑卒中幸存者中，约有三分之二在较长时间内存在神经功能障碍。建立稳定且可重复的实验性缺血性脑卒中模型，对于深入研究其病理生理机制以及开发有效的治疗策略具有重要意义。大脑中动脉（MCA）是人类缺血性脑卒中最常见的发病部位，MCA闭塞是局灶性脑缺血常用的模型。在本实验方案中，我们描述了通过经颅电凝法在C57BL/6小鼠中建立远端MCA闭塞（dMCAO）模型的方法。由于闭塞部位位于MCA的皮质分支，该模型产生的梗死病灶范围适中，且局限于大脑皮层。神经行为学和组织病理学特征分析表明，该模型可出现明显的运动功能障碍、神经元变性，以及小胶质细胞和星形胶质细胞的显著活化。因此，该dMCAO小鼠模型为研究缺血性脑卒中提供了有价值的工具，具有推广价值。

引言

脑卒中是一种常见的急性脑血管疾病，具有高致残率和高致死率的特点¹。在所有脑卒中病例中，近80%属于缺血性脑卒中²。迄今为止，静脉溶栓仍是治疗急性缺血性脑卒中为数不多的有效方法之一。然而，溶栓治疗的效果受限于狭窄的有效时间窗以及出血性转化的发生³。在缺血性脑卒中后的长期康复阶段，大量患者可能出现持久的神经功能障碍⁴。迫切需要进一步研究以阐明缺血性脑卒中的潜在病理生理机制，并推动针对缺血性脑卒中的新型治疗策略的开发。建立可靠且可重复的缺血性脑卒中模型，对于缺血性脑卒中领域的基础研究及后续的转化研究至关重要。

1981年，Tamura 等人通过在大脑中动脉（MCA）近端部位采用经颅电凝法，建立了局灶性脑缺血模型⁵。自那时以来，众多研究人员已采用结扎、压迫或夹闭等多种方法诱导远端大脑中动脉闭塞（dMCAO），以建立短暂性或永久性缺血性卒中模型^6,7,8。与线栓模型相比，dMCAO 模型具有梗死体积更小、存活率更高的显著优势，因此更适合用于研究缺血性卒中后的长期功能恢复⁹。此外，dMCAO 模型在老年啮齿类动物中的存活率高于线栓模型，使其成为研究老年及合并症动物模型中缺血性卒中的有利工具¹⁰。光化学法（PT）卒中模型已被证明具有手术创伤小、死亡率显著较低的特点。然而，与 dMCAO 模型相比，PT 模型表现出更明显的细胞坏死和组织水肿，导致侧支循环缺失¹¹。此外，值得注意的是，PT 模型中观察到的缺血性病灶主要源于微血管闭塞，这与 dMCAO 模型中由大血管栓塞引起的脑缺血存在显著差异¹²。

本文介绍了通过小骨窗开颅术凝闭远端大脑中动脉以建立小鼠dMCAO模型的方法学。此外，我们进行了组织学检查和行为学评估，以全面表征该实验模型中的缺血性损伤及脑卒中结局。本研究旨在帮助研究人员熟悉该模型，并推动对缺血性脑卒中病理机制的进一步探索。

方案

实验方案经江汉大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南进行。本实验使用10周龄、体重24–26 g的成年雄性C57BL/6J小鼠。所有小鼠均饲养于12小时光照/12小时黑暗循环控制的环境中，并自由获取食物和水 随意摄取

1. 术前准备

注意：本方案所需的关键仪器和设备如图1所示。

1. 手术前，通过高压灭菌法对手术器械进行灭菌。
2. 术前60分钟，皮下注射美洛昔康（meloxicam），剂量为5 mg/kg，用于镇痛。
3. 在诱导舱中使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉。
4. 用75%乙醇擦拭加热手术板，并打开加热开关，将温度设定为37 °C。然后将小鼠置于手术板上，呈左侧卧位，头部远离术者，尾部朝向术者。
5. 将麻醉面罩固定于小鼠面部，持续供给2%异氟烷和0.3 L/min氧气以维持麻醉。在角膜上涂抹眼膏，防止手术过程中角膜干燥。
6. 使用剃毛器从左侧眼眶至左耳道区域剃除毛发。再使用脱毛膏清除残留毛发，以便消毒。
7. 使用聚维酮碘消毒剂和75%乙醇重复三次，对手术区域进行准备。

2. 远端大脑中动脉阻塞模型

1. 通过脚趾夹捏法检查小鼠的反射，以确认其是否已进入深度麻醉状态。
2. 使用无菌手术刀片在左侧眼眶与左耳道之间做一垂直切口。
3. 使用拉钩将皮肤软组织向后牵开，暴露颞肌。
4. 使用直型显微镊将颞肌的尖部和背部节段从颅骨上分离。
5. 识别大脑中动脉（MCA）的分叉处，该分叉呈 "Y" 颞骨下方朝向颅底偏斜的形态图 2A).
   注意：如果大脑中动脉（MCA）的分叉处因解剖学上的正常变异而无法清晰辨认，应确定最靠前的血管。
6. 使用电动颅骨钻磨薄颅骨，制作一个直径为4 mm的骨窗，直至露出具有半透明质地的硬脑膜。
   注意：在此过程中，需间歇性地向颅骨滴加生理盐水，以防止过热。
7. 使用弯头显微镊子去除动脉上方的硬脑膜，以暴露大脑中动脉分支。
8. 将电凝仪功率设置为 7 W。使用电凝镊在大脑中动脉（MCA）分叉的近端和远端位置对动脉进行电凝。图2A当由于解剖变异导致分叉处不可见时，应在已准确辨认的MCA分支（如上所述）上，于相距约1 mm的两个不同位置进行凝固。¹³.
9. 利用激光散斑血流仪监测左侧大脑中动脉皮层支的血流。
   注意：在电凝后血流减少低于基线值40%的小鼠被排除在研究之外。
10. 分别使用5-0聚乙醇酸缝线缝合肌肉和皮肤。用无菌棉签将双氯芬酸钠凝胶和莫匹罗星软膏涂抹于皮肤切口处。
11. 将小鼠放入复苏箱中，监测所有小鼠直至完全清醒。每24小时皮下注射美洛昔康（5 mg/kg）以镇痛。 长达 72 小时。

3. 假手术操作

1. 重复上述相同步骤，但不包括动脉凝固过程。

4. 行为学实验

注意：在进行dMCAO手术前，小鼠每日接受两次行为学训练，持续3天。在第3天^rd dMCAO术后第d，将小鼠转移至行为学测试室，适应环境2 h后再进行测试。

1. 握力测试¹⁴
   ​注意：握力计包含一个推拉式应变仪和一根金属水平杆。
   1. 抓住小鼠尾部的基部，缓慢将其 lowered 向金属握杆，直至小鼠用两只前爪抓住水平杆（图 2B）。
   2. 以约 2 cm/s 的恒定速度向后拉动小鼠，并保持其身体呈水平状态。
   3. 记录小鼠前爪脱离杆时的最大拉力（单位：克，g）。
2. 转杆测试¹⁵
   1. 将小鼠放置于一根垂直木杆的顶端（高 50 cm，直径 1 cm），使其头部朝上，允许其自行向下爬行（图 2B）。
   2. 记录小鼠转身所需时间（T-turn）以及完全爬下杆所需的总时间（T-total），设定上限时间为 60 秒。
3. 胶带剥离测试¹⁶
   1. 握住小鼠，将一块粘性胶带（2 × 2 mm）贴在其右前爪上（图 2B）。
   2. 将小鼠放回饲养笼中，使其自由活动。
   3. 记录小鼠去除胶带所需的时间，上限为 60 秒。
4. 圆筒测试¹⁷
   1. 将小鼠放入一个顶部开放的透明玻璃圆筒中（直径：14 cm；高度：20 cm），使用摄像机记录其 3 分钟内的自发直立探索行为（图 2B）。
      注意：在实验过程中，圆筒两侧放置两面镜子，以确保前肢运动被充分记录。
   2. 在测试下一只小鼠前，用 75% 乙醇擦拭圆筒，以消除残留的嗅觉线索。
   3. 将视频回放速度降低至实际速度的 1/5，统计小鼠使用左前爪（L）、右前爪（R）或双前爪同时（B）接触筒壁的次数。计算右前爪使用率，公式为 (L - R) / (L + R + B) × 100%。

5. 灌注与样品制备

1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥（300 mg/kg）处死小鼠。将小鼠仰卧位固定，固定四肢。
2. 在皮肤上做一正中切口，从腹部中段开始，向上延伸至胸部上区。
3. 使用手术剪打开胸腔，用止血钳将剑突向上翻起。小心移除肺和膈肌，以暴露心脏。
4. 将灌注针头插入左心室，并用剪刀穿刺右心房。通过左心室以20 mL生理盐水灌注心脏。
5. 将小鼠断头，沿两眼之间的正中线切开头皮。从颅底开始，沿两侧颅骨剪开，直至眼眶。
6. 抬起颅骨穹窿，用镊子轻轻将脑组织从颅底剥离。
   注：一半小鼠的脑组织用于2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，另一半小鼠的脑组织进行组织学检查。
7. 将脑组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中过夜，以备后续组织学分析。

6. 梗死体积的鉴定

1. 将脑组织置于冰箱的 -20 °C 冷冻室中，冷冻 20 分钟。
2. 将脑组织放入 1 mm 脑切片模具中，使用切片刀将其切成厚度为 2 mm 的冠状切片。
3. 将脑切片转移至 24 孔细胞培养板中，加入 2% TTC 溶液以完全覆盖脑组织。将 24 孔板置于恒温培养箱中，在 37 °C 条件下孵育 30 分钟。
4. 小心取出脑切片，置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 15 分钟。
5. 使用扫描仪以 1200 × 1200 dpi 的分辨率对这些脑切片进行光学扫描。
6. 使用 Image J 软件（https://imagej.net/software/imagej/index）¹⁸，通过累加每一切片的梗死面积（右侧半球面积减去左侧未受损区域面积）来测量脑梗死体积。以梗死体积与右侧半球体积的比值乘以 100%，计算梗死体积百分比。

7. 组织病理学与免疫荧光染色分析

1. 从多聚甲醛溶液中取出脑组织样本，用流水冲洗 1 小时。
2. 将脑组织样本转移至自动组织脱水机中，启动预设程序进行脱水、透明和浸蜡处理。将脱水后的脑组织样本包埋于石蜡中，并用切片机切成 5-µm 厚的切片。
3. 苏木精-伊红（H&E）染色
   1. 用二甲苯对切片脱蜡，每次 8 分钟，共 3 次。
   2. 依次将切片浸入梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）及蒸馏水中，每次 5 分钟，进行再水化。
   3. 用苏木精染液对切片染色 5 分钟。
   4. 用蒸馏水冲洗切片以去除残留的苏木精，随后将切片浸入 5% 盐酸乙醇中分化 5 秒。再用蒸馏水洗涤 2 分钟。
   5. 用伊红染液对切片染色 30 秒，然后用蒸馏水洗去多余的染液。
   6. 依次将切片浸入 90% 乙醇、95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯（2 次）中，每次 5 分钟。最后用中性树胶封片剂封片。
4. 免疫荧光染色
   1. 用二甲苯对切片脱蜡，每次 8 分钟，共 3 次。
   2. 依次将切片浸入梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）及蒸馏水中，每次 5 分钟，进行再水化。
   3. 将柠檬酸抗原修复液放入微波炉中加热至沸腾。将切片浸入抗原修复液中，再以低功率（20 W）继续加热修复液 20 分钟。
   4. 关闭微波炉，使抗原修复液冷却至室温（RT）。
   5. 用 0.1 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
   6. 在室温下用封闭液（5% 牛血清白蛋白）孵育切片 1 小时，以阻断免疫球蛋白的非特异性结合。
   7. 在 4˚C 下用兔抗 NeuN 抗体（1:300）、兔抗 Iba-1 抗体（1:500）和小鼠抗 GFAP 抗体（1:500）孵育切片过夜。
   8. 用 0.1 mM PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
   9. 在室温下用 Alexa 594 标记的山羊抗兔 IgG（1:500）或 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:500）孵育切片 1 小时。
   10. 用 0.1 mM PBS 洗涤切片，并用含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂封片。
   11. 使用荧光显微镜分别在 594 nm 和 488 nm 波长下，采集缺血半暗带区域内三个显微视野（300 µm × 300 µm）的图像。
   12. 使用 ImageJ 软件（https://imagej.net/software/imagej/index），通过计算缺血半暗带区域内阳性染色细胞数量的平均值，估算细胞密度¹⁹。

结果

进行远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）实验所使用的关键仪器包括显微外科器械套装、异氟烷麻醉蒸发器以及单极显微外科电凝发生器，如图1所示。本研究的实验流程如图2所示。简而言之，通过制作小骨窗开颅术暴露远端大脑中动脉（MCA），随后对其进行电凝以在C57BL/6小鼠中诱导永久性局灶性脑缺血。此外，在dMCAO术后3天，通过TTC染色、组织学检查和行为学评估来评价缺血性损伤及卒中结局。在手术过程中，仅1只小鼠因手术出血死亡，其余所有小鼠均在术后3天观察期内存活。

大体观察显示，远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）导致皮层出现明显的充血和水肿（图3A，底部）。假手术组未观察到明显的大体改变（图3A，顶部）。此外，通过TTC染色也证实了dMCAO诱导的皮层梗死（图3B）。dMCAO组术后3天的梗死体积为...

讨论

在当前的开颅电凝法远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型方案中，手术操作具有最小侵入性，仅需分离部分颞肌，以减轻对咀嚼功能的不良影响。所有小鼠术后恢复良好，未观察到进食困难的情况。小鼠颞骨区域的大脑中动脉（MCA）易于辨识，从而有助于精确确定合适的开颅位置。该dMCAO模型所诱导的缺血性病灶局限于大脑皮层外侧区域，与Llovera G等先前报道的结果一致¹³。此外，该模型产生的梗死体积约为16%，与大多数人类缺血性脑卒中病例中观察到的梗死体积相近²⁰。

多个实验室已采用开颅电凝法远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型来研究缺血性脑卒中的病理生理机制及其药物干预。值得注意的是，上述大多数实验研究仅采用多种评分量表来评估脑卒中后小鼠的基本反射和肢体运动功能。^6,21从我们的角度来看，这些估计值似乎缺乏精确性，因而不足以用于评估卒中后的神经功能损伤。为解决这一问题，我们设计了一系列...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基四氮唑 氯化物（TTC）	Sigma-Aldrich	108380	TTC 染色用染料
24 孔培养板	Corning (USA)	CLS3527	TTC 染色用容器
4% 多聚甲醛	武汉赛维尔生物科技 有限公司	G1101	组织固定
5% 牛血清白蛋白	武汉博士德生物工程有限公司	AR004	非特异性抗原封闭
5-0 聚乙醇酸缝合线	金环医疗有限公司	KCR531	手术材料
麻醉机	Midmark Corporation	VMR	动物麻醉
抗荧光淬灭封片剂	碧云天生物技术	P0131	免疫荧光染色封片
全自动组织脱水  机	Leica Biosystems (德国)	TP1020	组织脱水
脱毛膏	Veet (法国)	20220328	手术材料
双氯芬酸 钠 凝胶	武汉马应龙药业  股份有限公司	H10950214	动物镇痛
钻头（0.8 mm）	Rwd Life Science Co., Ltd.		手术设备
伊红染色液	武汉赛维尔生物科技 有限公司	G1001	H&E 染色用染料
眼膏	广州医药有限公司	H44023098	手术材料
荧光显微镜	Olympus (日本)	BX51	图像采集
GFAP 小鼠单克隆抗体	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	免疫荧光染色一抗
山羊抗小鼠 Alexa 488 标记 IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	免疫荧光染色二抗
山羊抗兔 Alexa 594 标记 IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	免疫荧光染色二抗
握力计	上海欣软信息科技有限公司	XR501	行为学实验设备
苏木精染色液	武汉赛维尔生物科技 有限公司	G1004	H&E 染色用染料
Iba1 兔单克隆抗体	Abcam	ab178846	免疫荧光染色一抗
异氟烷	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	动物麻醉
激光多普勒血流仪	Moor Instruments (英国)	moorVMS	血流监测
美洛昔康	勃林格殷格翰	J20160020	动物镇痛
微型钻机	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	手术设备
显微外科器械套装	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	手术设备
切片机	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	组织切片制备
切片机刀片	Leica Biosystems (德国)	819	组织切片制备
单极电凝发生器	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	手术设备
莫匹罗星软膏	天津史克& 弗朗实验室有限公司	H10930064	动物抗感染
NeuN 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	免疫荧光染色一抗
中性树胶	Absin 生物科学	abs9177	H&E 染色封片剂
石蜡包埋中心	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	制备石蜡包埋块
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761	动物安乐死
磷酸盐缓冲液	上海碧云天生物科技有限公司	C0221A	组织切片洗涤
剃毛器	深圳科多士电器 有限公司	CP-9200	手术设备
柠檬酸钠溶液	上海碧云天生物科技有限公司	P0083	免疫荧光染色抗原修复