使用远端中动脉闭塞技术诱导小鼠急性缺血性卒中

中风是一种常见的急性脑血管疾病，其特征是残疾和死亡率高¹。在所有中风病例中，近 80% 属于缺血性中风²。到目前为止，静脉溶栓仍然是治疗急性缺血性卒中的少数有效方法之一。然而，溶栓治疗的有效性受到有效时间窗窄和出血转化发生的限制³。在缺血性中风后的长期康复阶段，相当多的患者可能会出现持久的神经功能障碍⁴。迫切需要进一步研究以揭示缺血性中风的潜在病理生理机制，并促进针对缺血性中风的新型治疗策略的开发。建立可靠且可复制的缺血性中风模型对于缺血性中风领域的基础研究以及随后的转化研究至关重要。

1981 年，Tamura 等人通过在大脑中动脉 （MCA） 近端部位采用经颅电凝术开发了局灶性脑缺血模型⁵。从那时起，许多研究人员利用各种方法，如结扎、压迫或夹闭来诱导远端 MCA 闭塞 （dMCAO），以建立短暂性或永久性缺血性卒中模型 ^6,7,8。与细丝模型相比，dMCAO 模型表现出明显的优势，例如更小的梗死面积和更高的生存率，使其更适合研究缺血性中风后的长期功能恢复⁹。此外，与细丝模型相比，dMCAO 模型在老年啮齿动物中的存活率更高，使其成为研究老年和合并症动物模型中缺血性中风的有利工具¹⁰。光血栓形成 （PT） 卒中模型已被证明具有手术侵入性小和死亡率显着低的特点。然而，与 dMCAO 模型相比，PT 模型表现出更大程度的细胞坏死和组织水肿，导致没有侧支循环¹¹。此外，值得注意的是，在 PT 模型中观察到的缺血病变主要由微血管闭塞引起，这与 dMCAO 模型中大血管栓塞诱导的脑缺血有很大不同¹²。

在本文中，我们提出了通过小骨窗开颅手术凝固远端 MCA 来诱导小鼠 dMCAO 模型的方法。此外，我们进行了组织学检查和行为评估，以全面表征该实验模型中的缺血性损伤和中风结局。我们的目标是让研究人员熟悉该模型，并促进对缺血性中风病理机制的进一步研究。

该实验方案由江汉大学机构动物护理和使用委员会批准，并按照中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南进行。该方案使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，10 周龄，体重 24-26 g。将所有小鼠饲养在 12 小时的光照/黑暗循环受控环境中，随意进食和水 。

1. 术前准备

注意:该协议所需的关键仪器和设备如图 1 所示。

1. 手术前，通过高压灭菌对手术器械进行消毒。
2. 手术前 60 分钟以 5 mg/kg 的剂量皮下注射美洛昔康用于镇痛。
3. 在诱导室中用 5% 异氟醚麻醉小鼠。
4. 用 75% 乙醇擦拭加热手术板，并激活加热开关，温度设置为 37 °C。 然后，将鼠标放置在板上的左侧位置，使头部远离外科医生，尾部面向外科医生。
5. 将面罩贴在小鼠脸上，提供 2% 异氟醚和 0.3 L/min 氧气的恒定供应，用于维持麻醉。将眼膏涂抹在角膜上，以防止它们在手术过程中干燥。
6. 用剃须刀剃掉从左眼眶到左耳道的毛发。使用脱毛霜去除剩余的皮毛进行消毒。
7. 通过涂抹聚维酮碘消毒剂和 75% 乙醇 3 次来准备手术区域。

2. 远端 MCAO 模型

1. 通过评估脚趾捏合的反射来检查鼠标是否被深度麻醉。
2. 使用无菌手术刀刀片在左眼眶和左耳道之间做一个垂直切口。
3. 用牵开器收缩皮肤的软组织，露出颞肌。
4. 使用直的显微镊子将颞肌的顶端和背段与颅骨分开。
5. 确定 MCA 的分叉，它在颞骨下方呈"Y"形，偏向颅底（图 2A）。
   注意:如果 MCA 的分叉在视觉上无法辨别（由于解剖学上正常的变化），请确定最喙部的血管。
6. 使用电动颅钻将颅骨变薄，形成骨窗（直径 4 毫米），直到看到具有半透明质地的硬脑膜。
   注意:间歇性地向颅骨中滴入生理盐水，以防止在此过程中过热。
7. 用弯曲的微镊子去除动脉上方的硬脑膜，露出 MCA 分支。
8. 将电烙术设置为 7 W。使用 电凝钳在 MCA 分叉的近端和远端部位凝固动脉（图 2A）。当由于解剖学变化而看不到分叉时，在相距约 1 毫米的两个不同位置对准确识别的 MCA 分支（如上所述）进行凝血¹³。
9. 使用激光散斑血流计监测左侧 MCA 皮质分支的血流。
   注意:电凝后血流减少少于基线值 40% 的小鼠被排除在研究之外。
10. 使用 5-0 聚乙醇酸缝合线分别缝合肌肉和皮肤。使用无菌棉签将双氯芬酸钠凝胶和莫匹罗星软膏涂抹在皮肤切口上。
11. 将鼠标放入恢复室中。监测所有小鼠，直到它们完全清醒。每 24 小时提供美洛昔康 （5 mg/kg， SC） 用于镇痛，最长 72 小时。

3. 假操作

1. 重现与上述相同的程序，不包括动脉凝血过程。

4. 行为测试

注意:在 dMCAO 之前，小鼠每天接受两次行为训练，持续 3 天。在 dMCAO 后第^{3 天，} 将小鼠移至行为测试室进行 2 小时的环境适应，然后再进行测试。

1. 握力测试¹⁴
   注意: 握力计包括一个推拉式应变计和一个金属水平杆。
   1. 抓住鼠标尾巴的底部。逐渐将鼠标向金属握杆降低，直到它用双前爪抓住水平杆（图 2B）。
   2. 以约 2 cm/s 的恒定速度向后拉鼠标，并保持其身体水平。
   3. 记录鼠标从杆上松开前爪时的峰值力，以克 （g） 为单位。
2. 极测试¹⁵
   1. 将鼠标放在垂直木杆（50 厘米高，直径 1 厘米）的顶部，头部朝上，让它们爬下杆子（图 2B）。
   2. 记录鼠标转身 （T 形转弯） 所花费的时间和爬下杆子的总时间 （T-total），截止时间为 60 秒。
3. 胶带去除试验¹⁶
   1. 握住鼠标并将一块胶带（2 × 2 毫米）贴在鼠标的右前爪上（图 2B）。
   2. 将鼠标放回饲养笼中，让它自由移动。
   3. 记录鼠标去除胶粘剂所花费的时间，限制为 60 秒。
4. 气缸测试¹⁷
   1. 将鼠标放在一个敞开的顶部透明玻璃圆柱体（直径:14 厘米;高度:20 厘米）中，并使用相机记录其自发的站立探索行为 3 分钟（图 2B）。
      注意:在实验过程中，两个镜子位于圆柱体旁边，以确保前肢运动的最佳记录。
   2. 在测试后续鼠标之前，用 75% 乙醇擦拭圆筒以消除残留的嗅觉线索。
   3. 将视频的播放速度降低到实际速度的 1/5，并计算用左 （L） 或右前爪 （R） 或同时使用双前爪 （B） 触墙的次数。将右前爪的使用率计算为 （L-R）/（L + R + B） × 100%。

5. 灌注和样品制备

1. 通过腹膜注射过量的戊巴比妥 （300 mg/kg） 对小鼠实施安乐死。将鼠标仰卧放置并固定四肢。
2. 在皮肤上做一个中线切口，从腹中腔开始，向胸部上部区域延伸。
3. 用手术剪刀打开胸部，然后用止血钳将剑突向上折叠。小心地取出肺和横膈膜，露出心脏。
4. 将灌注针尖插入左心室，用剪刀刺穿右心房。通过左心室用 20 mL 生理盐水灌注心脏。
5. 将鼠标斩首，沿着眼睛之间的中线切开头皮。沿两侧切骨，从颅底开始，一直到眼窝。
6. 提起颅骨，用镊子轻轻地将大脑从颅底分离。
   注:一半小鼠的大脑进行 2,3,5-三苯基四唑氯化物 （TTC） 染色，而另一半小鼠的大脑进行组织学检查。
7. 将大脑浸泡在 4% 多聚甲醛溶液中过夜，以进行后续组织学分析。

6. 梗死体积的识别

1. 将大脑置于冰箱的 -20 °C 冷冻室中 20 分钟。
2. 将大脑放入 1 毫米的脑基质中，并使用切片机刀片将大脑切成厚度为 2 毫米的冠状动脉切片。
3. 将脑切片转移到 24 孔培养板中，并添加 2% TTC 以覆盖脑组织。将 24 孔培养板放入恒温烘箱中 30 分钟，温度设置为 37 °C。
4. 小心地取出脑切片，并在 4% 多聚甲醛溶液中固定 15 分钟。
5. 扫描仪以 1200 x 1200 dpi 的分辨率对这些脑切片进行光学扫描。
6. 通过使用 Image J 软件 （https://imagej.net/software/imagej/index）¹⁸ 将每个切片的梗塞面积（右半球的面积减去左半球的未受伤面积）相加来测量脑梗死体积。将梗塞体积百分比计算为梗塞体积/右半球体积 × 100%。

7. 组织病理学和免疫荧光染色分析

1. 从多聚甲醛溶液中取出脑样品，用流水冲洗 1 小时。
2. 将大脑样本转移到自动化组织脱水机中。启动脱水、玻璃化和蜡浸泡的预设程序。将脱水的脑样品包埋在石蜡中，并通过切片机将其切成 5 μm 厚的切片。
3. 苏木精和伊红 （H&E） 染色
   1. 用二甲苯脱蜡切片 3 次，每次 8 分钟。
   2. 通过连续浸入梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）和蒸馏水中每次 5 分钟来再水化切片。
   3. 用苏木精溶液对切片染色 5 分钟。
   4. 用蒸馏水冲洗切片以洗涤残留的苏木精，然后将它们浸入 5% 盐酸醇中以进行 5 秒区分。用蒸馏水清洗切片 2 分钟。
   5. 用伊红溶液对切片染色 30 秒，然后用蒸馏水冲洗掉多余的染色液。
   6. 将切片连续浸入 90% 乙醇、95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯（2 次）中，每次 5 分钟。用中性香脂封固剂安装切片。
4. 免疫荧光染色
   1. 用二甲苯脱蜡 3 次，每次 8 分钟。
   2. 通过连续浸入梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）和蒸馏水中每次 5 分钟来再水化切片。
   3. 将柠檬酸盐抗原修复溶液预热至在微波炉中煮沸。将切片浸入抗原修复溶液中。以低功率 （20 W） 重新加热抗原修复缓冲液 20 分钟。
   4. 关闭微波炉，让抗原修复缓冲液冷却至室温 （RT）。
   5. 用 0.1 mM 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
   6. 将切片与封闭溶液（5% 牛血清白蛋白）在 RT 下孵育 1 小时，以阻断免疫球蛋白的非特异性结合。
   7. 将切片与兔抗 NeuN 抗体 （1:300）、兔抗 Iba-1 抗体 （1:500） 和小鼠抗 GFAP 抗体 （1:500） 在 4°C 下孵育过夜。
   8. 用 0.1 mM PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
   9. 在室温下，将切片与山羊抗兔 Alexa 594 偶联的 IgG （1:500） 或山羊抗小鼠 Alexa 488 偶联的 IgG （1:500） 孵育 1 小时。
   10. 用 0.1 mM PBS 洗涤切片，并用含有 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的抗淬灭封固剂封固。
   11. 使用 594 nm 和 488 nm 的荧光显微镜分别拍摄缺血半影内三个微观视野（300 μm × 300 μm）的图像。
   12. 使用 ImageJ 软件 （https://imagej.net/software/imagej/index），通过平均缺血半影¹⁹ 中的计数来估计阳性染色的细胞密度。

用于执行 dMCAO 的关键器械是显微外科器械组、异氟醚蒸发器和单极显微外科电凝发生器， 如图 1 所示。本研究的实验过程如图 2 所示。简而言之，采用小骨窗开颅手术暴露远端 MCA，随后凝固以诱导 C57BL/6 小鼠永久性局灶性脑缺血。此外，在 dMCAO 后 3 天通过 TTC 染色、组织学检查和行为评估评估缺血性损伤和卒中结局。在手术过程中，只有 1 只小鼠死于手术出血。此外，所有剩余的小鼠在手术后 3 天的观察期内存活。

宏观观察显示，dMCAO 在皮层中产生可见的充血和水肿（图 3A，底部）。在假手术组中未观察到明显的宏观改变（图 3A，顶部）。此外，还使用 TTC 染色验证了 dMCAO 诱导的皮质梗死（图 3B）。dMCAO 组术后 3 天的梗死体积为 16.6% ± 0.8%，证明了这种脑缺血模型的稳定性和可重复性（图 3C）。

进行了几项行为测试以评估 dMCAO 后第 3 天的神经功能缺损。如图 4A 所示，与假手术组相比，dMCAO 组的前肢握力显着降低 （70.8 g ± 4.2 g vs. 114.0 g ± 6.2 g，P < 0.001）。与假手术组相比，dMCAO 组小鼠在杆试验期间转身和下降到地面的潜伏期延长 （15.8 s ± 1.7 s vs. 8.7 s ± 1.3 s，P < 0.01,45.1 s ± 3.3 s vs. 29.2 s ± 2.1 s，P < 0.001）（图 4B，C）。对于粘合剂去除测试，与假手术组相比，dMCAO 组观察到去除时间显着增加 （20.5 ± 2.5 s vs. 7.8 s ± 1.1 s，P < 0.001）（图 4D）。圆柱体测试数据的统计分析表明，与假手术组相比，dMCAO 组的对侧前爪使用率显着降低（35.2% ± 2.6% 对 48.7% ± 2.2%，P < 0.001）（图 4E）。

图 5A 中的黑色方块说明了免疫荧光染色的分析区域。H&E 染色结果显示 dMCAO 组梗死周围区域神经元细胞排列无序，特征为明显的 pyknosis、空泡化和核高染色（图 5B，底部）。然而，假手术组在神经元形态上没有表现出任何明显的改变（图 5B，顶部）。图 5C 表明 dMCAO 导致梗死周围区域内 NeuN 阳性细胞的密度显着降低 （319.6 ± 19.0 vs. 765.0 ± 26.0，P < 0.001）。 图 5D，E 表明，与假手术组相比，dMCAO 组的小胶质细胞 （665.8 ± 30.6 vs. 207.4 ± 16.2，P < 0.001） 和星形胶质细胞 （305.2 ± 17.2 vs. 17.2 vs. 17.2 ± 2.1，P<0.001） 的密度大大增加。 这些发现提供了令人信服的证据，支持 dMCAO 后第3 天存在神经元丢失以及小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活。

图 1:用于建立 dMCAO 模型的关键器械。 （A） 基本手术器械。罗马数字 I-VII 是指电凝钳、弯曲的微型镊子、微型剪刀、直的微型镊子、牵开器、持针器和手术剪刀。（B） 异氟醚蒸发器。（C） 电外科发生器。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:实验程序示意图。 （A） 手术窗位于眼眶和耳道之间。远端 MCA 通过颞下开颅手术暴露，然后在分叉附近的三个部位凝血 （用黑色方块表示）。（B） 本研究使用了神经行为评估范式。完成神经行为测试后，收集脑样本进行 （C） TTC 染色和 （D） 组织病理学检查。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:dMCAO 后第 3 天大脑的宏观评估。 （A） 对假手术组和 dMCAO 组大脑的粗略观察。（B） 假手术组 （上） 和 dMCAO 组 （下） 的代表性 TTC 染色脑冠状动脉切片。黑线划定了同侧大脑的非梗死（未染色）皮层。（C） 梗死体积的定量。比例尺 = 5 毫米。数据以平均值 ± SEM 表示。N = 5，***P < 0.001 与假手术组相比，配对 t 检验。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:dMCAO 后第 3 天的神经行为测试。 （A） 前肢握力的量化。（B，C）在杆测试中量化转身和下降到地面的时间延迟。（D） 在胶粘剂去除试验中去除胶带所需时间的量化。（E） 气瓶测试的量化表示为右前爪的使用率。数据表示为均值 ± SEM，N = 10，**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术组相比，配对 t 检验。请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:dMCAO 后第 3 天大脑的组织学分析。 （A） 来自缺血半影中选定三个视野的皮层的免疫荧光测量。（B） 来自假手术组和 dMCAO 组的 H&E 染色脑切片的代表性图像。未染色的部分周围有虚线，表明梗死病变。（H&E 40x，比例尺 = 200 μm;H&E 200x，比例尺 = 50 μm）。（C） NeuN（神经元标志物）、（D） Iba-1（小胶质细胞标志物）和 （E） GFAP（星形胶质细胞标志物）的免疫荧光染色和定量分析的代表性图像。比例尺 = 50 μm。数据表示为均值 ± SEM，N = 5，***P < 0.001 与假手术组相比，配对 t 检验。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有利益冲突需要披露。