方法文章

采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

DOI：

10.3791/66134

⸱

2023年12月15日

 ,  ,  , 
1Wuhan Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种通过经颅电凝法在C57BL/6J小鼠中建立远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型的实验方案，并对随后的神经行为学表现及组织病理学特征进行评估。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缺血性脑卒中仍是全球成年人群中导致死亡和功能障碍的主要原因。仅有少数缺血性脑卒中患者能够在最佳时间窗内接受血管内溶栓或机械取栓治疗。在这些脑卒中幸存者中，约有三分之二在较长时间内存在神经功能障碍。建立稳定且可重复的实验性缺血性脑卒中模型，对于深入研究其病理生理机制以及开发有效的治疗策略具有重要意义。大脑中动脉（MCA）是人类缺血性脑卒中最常见的发病部位，MCA闭塞是局灶性脑缺血常用的模型。在本实验方案中，我们描述了通过经颅电凝法在C57BL/6小鼠中建立远端MCA闭塞（dMCAO）模型的方法。由于闭塞部位位于MCA的皮质分支，该模型产生的梗死病灶范围适中，且局限于大脑皮层。神经行为学和组织病理学特征分析表明，该模型可出现明显的运动功能障碍、神经元变性，以及小胶质细胞和星形胶质细胞的显著活化。因此，该dMCAO小鼠模型为研究缺血性脑卒中提供了有价值的工具，具有推广价值。

引言

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脑卒中是一种常见的急性脑血管疾病，具有高致残率和高致死率的特点1。在所有脑卒中病例中，近80%属于缺血性脑卒中2。迄今为止，静脉溶栓仍是治疗急性缺血性脑卒中为数不多的有效方法之一。然而，溶栓治疗的效果受限于狭窄的有效时间窗以及出血性转化的发生3。在缺血性脑卒中后的长期康复阶段，大量患者可能出现持久的神经功能障碍4。迫切需要进一步研究以阐明缺血性脑卒中的潜在病理生理机制，并推动针对缺血性脑卒中的新型治疗策略的开发。建立可靠且可重复的缺血性脑卒中模型，对于缺血性脑卒中领域的基础研究及后续的转化研究至关重要。

1981年，Tamura 等人通过在大脑中动脉（MCA）近端部位采用经颅电凝法，建立了局灶性脑缺血模型5。自那时以来，众多研究人员已采用结扎、压迫或夹闭等多种方法诱导远端大脑中动脉闭塞（dMCAO），以建立短暂性或永久性缺血性卒中模型6,7,8。与线栓模型相比，dMCAO 模型具有梗死体积更小、存活率更高的显著优势，因此更适合用于研究缺血性卒中后的长期功能....

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方案

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实验方案经江汉大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南进行。本实验使用10周龄、体重24–26 g的成年雄性C57BL/6J小鼠。所有小鼠均饲养于12小时光照/12小时黑暗循环控制的环境中，并自由获取食物和水 随意摄取

1. 术前准备

注意：本方案所需的关键仪器和设备如图1所示。

  1. 手术前，通过高压灭菌法对手术器械进行灭菌。
  2. 术前60分钟，皮下注射美洛昔康（meloxicam），剂量为5 mg/kg，用于镇痛。
  3. 在诱导舱中使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉。
  4. 用75%乙醇擦拭加热手术板，并打开加热开关，将温度设定为37 °C。然后将小鼠置于手术板上，呈左侧卧位，头部远离术者，尾部朝向术者。
  5. 将麻醉面罩固定于小鼠面部，持续供给2%异氟烷和0.3 L/min氧气以维持麻醉。在角膜上涂抹眼膏，防止手术过程中角膜干燥。
  6. 使用剃毛器从左侧眼眶至左耳道区域剃除毛发。再使用脱毛膏清除残留毛发，以便消毒。
  7. 使用聚维酮碘消毒剂和75%乙醇重复三次，对手术区域进行准备。

2.....

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结果

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进行远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）实验所使用的关键仪器包括显微外科器械套装、异氟烷麻醉蒸发器以及单极显微外科电凝发生器，如图1所示。本研究的实验流程如图2所示。简而言之，通过制作小骨窗开颅术暴露远端大脑中动脉（MCA），随后对其进行电凝以在C57BL/6小鼠中诱导永久性局灶性脑缺血。此外，在dMCAO术后3天，通过TTC染色、组织学检查和行为学评估来评价缺血性损伤及卒中结局。在手术过程中，仅1只小鼠因手术出血死亡，其余所有小鼠均在术后3天观察期内存活。

大体观察显示，远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）导致皮层出现明显的充血和水肿（图3A，底部）。假手术组未观察到明显的大体改变（图3A，顶部）。此外，通过TTC染色也证实了dMCAO诱导的皮层梗死（图3B）。dMCAO组术后3天的梗死体积为.......

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讨论

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在当前的开颅电凝法远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型方案中，手术操作具有最小侵入性，仅需分离部分颞肌，以减轻对咀嚼功能的不良影响。所有小鼠术后恢复良好，未观察到进食困难的情况。小鼠颞骨区域的大脑中动脉（MCA）易于辨识，从而有助于精确确定合适的开颅位置。该dMCAO模型所诱导的缺血性病灶局限于大脑皮层外侧区域，与Llovera G等先前报道的结果一致13。此外，该模型产生的梗死体积约为16%，与大多数人类缺血性脑卒中病例中观察到的梗死体积相近20。

多个实验室已采用开颅电凝法远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型来研究缺血性脑卒中的病理生理机制及其药物干预。值得注意的是，上述大多数实验研究仅采用多种评分量表来评估脑卒中后小鼠的基本反射和肢体运动功能。6,21从我们的角度来看，这些估计值似乎缺乏精确性，因而不足以用于评估卒中后的神经功能损伤。为解决这一问题，我们设计了一系列.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由湖北省自然科学基金（2022CFC057）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,3,5-三苯基四氮唑
氯化物（TTC）		Sigma-Aldrich108380TTC 染色用染料
24 孔培养板Corning (USA)CLS3527TTC 染色用容器
4% 多聚甲醛武汉赛维尔生物科技
有限公司		G1101组织固定
5% 牛血清白蛋白武汉博士德生物工程有限公司AR004非特异性抗原封闭
5-0 聚乙醇酸缝合线金环医疗有限公司KCR531手术材料
麻醉机Midmark CorporationVMR动物麻醉
抗荧光淬灭封片剂碧云天生物技术P0131免疫荧光染色封片
全自动组织脱水 
机		Leica Biosystems (德国)TP1020组织脱水
脱毛膏Veet (法国)20220328手术材料
双氯芬酸 钠 凝胶武汉马应龙药业
 股份有限公司		H10950214动物镇痛
钻头（0.8 mm）Rwd Life Science Co., Ltd.手术设备
伊红染色液武汉赛维尔生物科技
有限公司		G1001H&E 染色用染料
眼膏广州医药有限公司H44023098手术材料
荧光显微镜Olympus (日本)BX51图像采集
GFAP 小鼠单克隆抗体Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		3670免疫荧光染色一抗
山羊抗小鼠 Alexa
488 标记 IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		4408免疫荧光染色二抗
山羊抗兔 Alexa
594 标记 IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		8889免疫荧光染色二抗
握力计上海欣软信息科技有限公司XR501行为学实验设备
苏木精染色液武汉赛维尔生物科技
有限公司		G1004H&E 染色用染料
Iba1 兔单克隆抗体Abcamab178846免疫荧光染色一抗
异氟烷Rwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10动物麻醉
激光多普勒血流仪Moor Instruments (英国)moorVMS血流监测
美洛昔康勃林格殷格翰J20160020动物镇痛
微型钻机Rwd Life Science Co., Ltd.78001手术设备
显微外科器械套装Rwd Life Science Co., Ltd.SP0009-R手术设备
切片机Thermo Fisher Scientific (USA)HM325组织切片制备
切片机刀片Leica Biosystems (德国)819组织切片制备
单极电凝发生器Spring Scenery Medical Instrument
Co., Ltd.		CZ0001手术设备
莫匹罗星软膏天津史克&
弗朗实验室有限公司		H10930064动物抗感染
NeuN 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		24307免疫荧光染色一抗
中性树胶Absin 生物科学abs9177H&E 染色封片剂
石蜡包埋中心Thermo Fisher Scientific (USA)EC 350制备石蜡包埋块
戊巴比妥钠Sigma-AldrichP3761动物安乐死
磷酸盐缓冲液上海碧云天生物科技有限公司C0221A组织切片洗涤
剃毛器深圳科多士电器
有限公司		CP-9200手术设备
柠檬酸钠溶液上海碧云天生物科技有限公司P0083免疫荧光染色抗原修复

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burde....

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