Method Article

脑类器官中单细胞和单核转录组的生成和下游分析

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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在这里，我们介绍了一种使用单细胞和单核RNA测序生成和下游分析人脑类器官的综合方案。

Abstract

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在过去的十年中，单细胞转录组学已经取得了显着发展，并成为同时分析单个细胞基因表达谱的标准实验室方法，从而可以捕获细胞多样性。为了克服难以分离的细胞类型带来的限制，可以使用一种旨在恢复单核而不是完整细胞的替代方法进行测序，使单个细胞的转录组分析普遍适用。这些技术已成为大脑类器官研究的基石，使它们成为发育中的人类大脑的模型。利用单细胞和单核转录组学在脑类器官研究中的潜力，该协议提供了一个分步指南，涵盖了类器官解离、单细胞或细胞核分离、文库制备和测序等关键程序。通过实施这些替代方法，研究人员可以获得高质量的数据集，从而能够识别神经元和非神经元细胞类型、基因表达谱和细胞谱系轨迹。这有助于对塑造大脑发育的细胞过程和分子机制进行全面研究。

Introduction

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在过去的几年中，类器官技术已成为培养器官样组织的一种有前途的工具1,2,3。特别是对于不容易接触到的器官，如人脑，类器官提供了深入了解发育和疾病表现的机会4.因此，大脑类器官已被广泛用作实验模型，用于研究各种人类脑部疾病，包括发育、精神疾病甚至神经退行性疾病 4,5,6。

随着单细胞转录组分析技术的出现，原代人体组织和复杂的体外模型可以以前所未有的粒度水平进行研究，为健康和疾病中细胞亚群水平上的基因表达变化提供机制见解，并为新的假定治疗靶点提供信息7,8,9.通过利用单细胞转录组分析来评估细胞组成、可重复性和大脑类器官技术的保真度，类器官领域取得了进展 10,11,12。单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 使细胞分类和患病类器官中的遗传失调鉴定成为可能13,14。重要的是，正是类器官组织的复杂性使得有必要实施能够分析单个细胞的技术。使用批量转录组分析（批量 RNA 测序）等方法对类器官进行表征会导致细胞异质性和基因表达谱被掩盖，这些异质性和基因表达谱在复杂组织内的所有类型细胞中均被平均，最终限制了我们对健康和疾病中类器官发育过程中正在进行的过程的理解 15,16,17.随着scRNA-seq方法的不断发展，越来越多的图谱正在被创建，例如Uzquiano等人的Allen Brain Atlas或Single cell atlas of human brain organoids等资源18。

从脑类器官中成功实现 scRNA-seq 依赖于有效分离和捕获完整细胞。由于脑类器官的解离以获得单个细胞是基于酶消化的，因此它可以通过诱导应激和细胞损伤来影响基因表达模式19,20。因此，将组织解离成单个细胞是最关键的一步。另一种方法是单核 RNA 测序 （snRNA-seq），它有助于从新鲜和冷冻组织中无酶提取细胞核21,22。然而，从组织中分离细胞核会带来其他挑战，例如目标细胞类型的富集以及与细胞相比细胞核的 RNA 含量低。

脑类器官的转录组研究通常使用 scRNA-seq 10,18,23 进行。然而，单核的分离可能提供了一种正交和补充方法来研究类器官的转录组学特征。在这里，我们介绍了一个用于脑类器官scRNA和snRNA-seq的工具箱，并讨论了获得最佳质量测序数据的关键点。

Protocol

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所描述的方案在Max Delbrück分子医学中心（批准号:138/08）的生物安全1级实验室中进行，符合要求并符合欧盟和国家的研究伦理规则。

1. 从诱导多能干细胞 （iPSCs） 衍生出前脑类器官

注:该协议已针对在来自不同公司的各种干细胞培养基中培养的几种不同iPSC系进行了测试（表1）。前脑类器官的产生高度依赖于高质量的 iPSC 和 60%-70% 的汇合度，然后才能开始实验方案。在这里，我们使用了市售的细胞系（参见 材料表）。

  1. 第 0 天:胚状体形成
    1. 对于用 pluronic 溶液处理 96 孔板，在 96 孔 U 底板的每孔中加入 80 μL 无菌过滤的 2% pluronic 溶液。在室温 （RT） 或 37 °C 下孵育至少 15 分钟。
      注意:Pluronic 处理板可在 4 °C 下储存长达 2 周，并且可以直接使用，无需任何洗涤步骤即可形成胚状体。
    2. 在接种细胞之前，使用抽吸器或多通道移液器从每个孔中取出 pluronic 溶液。
    3. 在开始之前，为一个 96 孔板准备以下试剂:15 mL 离心管和 5 mL 预热的 DMEM:F12 培养基;11 mL 补充有 50 μM Y-27632 的干细胞培养基，经多糖醛处理的板（如上所述）。
    4. 从 60-70% 汇合 iPSC 的 6 孔板的一个孔中吸出培养基。用 PBS 洗涤细胞一次。加入 500 μL 基于胰蛋白酶的试剂，并在 37 °C 下孵育 2-6 分钟。
      注:用基于胰蛋白酶的试剂正确分离细胞的孵育时间取决于细胞密度和每个iPSC系的细胞基质粘附特性。为避免过度消化，建议在使用基于胰蛋白酶的试剂孵育 2 分钟后使用明场显微镜检查细胞形态。
    5. 使用 1000 μL 移液管分离细胞，并转移到先前制备的带有 DMEM:F12 培养基的 15 mL 离心管中以停止解离。
    6. 将细胞悬浮液以300× g离心3分钟。吸出上清液并保留细胞沉淀。将细胞重悬于补充有 50 μM Y-27632 的 1 mL 干细胞培养基中。
    7. 使用细胞计数器计数细胞，并将所需数量的细胞添加到补充有 50 μM Y-27632 的干细胞培养基中。单个胚状体的生成需要 3,000-12,000 个细胞，具体取决于细胞系。
    8. 使用 10 mL 移液管将细胞悬液转移到多通道试剂储液器中。使用多通道移液器，将 100 μL/孔的细胞悬浮液接种到先前经过多糖醛处理的 96 孔板中。
    9. 将96孔板置于37°C，5%O2 和5%CO2的培养箱中。为避免在胚状体形成过程中受到任何干扰，请避免移动板。
  2. 第 2 天:胚状体形成检查
    1. 使用明场显微镜的10倍物镜检查胚状体的形成。胚状体应显示出清晰的边缘和最小的细胞死亡。
    2. 吸出尽可能多的培养基，并用 100 μL/孔的干细胞培养基替换。（严重）在培养基交换过程中，胚状体很容易从孔中取出。注意不要移除它们，因此在抽吸后监测培养基。
  3. 第 3 天:神经外胚层诱导
    1. 吸出尽可能多的培养基，并用120μL/孔的诱导培养基替换，并将板置于37°C，20%O2 和5%CO2。
  4. 第 6 天:嵌入
    1. 根据 iPSC 系的不同，需要 3 或 4 天才能诱导神经外胚层出现。定期监测胚状体。一旦边缘变亮，胚状体就可以嵌入了。使用可用于胚状体嵌入的两种不同方法之一，如下所述 24.
    2. 嵌入方式一:Cookie嵌入
      1. 将未稀释的细胞外基质凝胶等分试样在冰上解冻 1-2 小时。 （严重） 始终将细胞外基质凝胶放在冰上以防止其凝固。提前准备等分试样，以尽量减少解冻时间和重复的解冻周期。
      2. 使用爪式钳切开 200 μL 移液管的尖端，并将 16-32 个胚状体收集在一个 1.5 mL 微量离心管中。
      3. 将 67 μL 培养基中的胚状体转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。使用切开的 200 μL 移液器吸头加入 100 μL 细胞外基质凝胶并轻轻混合。
      4. 将胚状体均匀分布在6cm培养皿中，并将板放置5-10分钟，以使细胞外基质凝胶凝固。
      5. 加入约4mL分化培养基，并在37°C，20%O2 和5%CO2下孵育。第二天，将培养皿放在轨道振荡器（84 rpm）上。确保所有胚状体都从底部分离。如果没有，请使用切开的移液器吸头和培养基轻轻分离它们。
    3. 包埋方法2:液体包埋
      1. 将未稀释的细胞外基质凝胶的等分试样在冰上解冻 1-2 小时，并将分化培养基置于冰上。（严重）添加细胞外基质凝胶时，培养基必须是冰冷的。
      2. 一旦培养基冷却，加入细胞外基质凝胶至终浓度为 2%。使用爪式钳子切开 200 μL 移液管的尖端，并将多达 24 个胚状体转移到 6 孔板的一个孔中。
      3. 去除所有多余的培养基，将约 4 mL 2% 细胞外基质凝胶/分化培养基加入 6 孔板的一个孔中。立即将板放在轨道振荡器（84 rpm）上。
  5. 第 9-20 天:每 3-4 天使用分化培养基进行一次完整的培养基更换。
  6. 第 21-30 天:将类器官转移到成熟培养基中，每 3-4 天进行一次全培养基更换。
  7. 类器官解离:对于单核和细胞解离，请使用高质量的类器官。为避免过量的细胞死亡，请定期切割类器官以防止坏死核心的积聚，并让它们恢复 2 周，然后再将它们解离以进行进一步分析。

2. 从类器官衍生出单细胞

注:使用神经组织解离试剂盒（表 2）进行单细胞解离，该试剂盒使用机械和酶解离。在这里，我们描述了一种手动机械解离。作为替代方案，可以使用解离机。

  1. 在冰上制备STOP溶液和0.04%BSA。在PBS中制备酶混合物1和2以及0.04%BSA，然后置于冰上。
  2. 在 6 孔板的一个孔中收集多达 5 个类器官，吸出多余的培养基，并用 PBS 洗涤一次以去除培养基。将类器官放在孔中间，用手术刀将类器官彻底切碎。
  3. 加入酶混合物1，置于37°C，20%O2 和5%CO2，以90rpm振荡10-15分钟。
  4. 使用 1000 μL 移液器吸头，通过移液高达 10 倍来重悬类器官。加入酶混合物 2，并使用 1000 μL 移液器吸头移液，充分混合。置于37°C，20%O2 和5%CO2，以90rpm振荡10-15分钟。
  5. 通过将细胞溶液重悬于 10 mL 冷 STOP 溶液中来停止解离过程。使用 70 μM 细胞过滤器的过滤池溶液。将过滤的细胞溶液在4°C下以300× g 离心10分钟以形成沉淀。
  6. 吸出培养基，留下细胞沉淀并将细胞重悬于 4 mL 冷的 0.04% BSA 中。使用 40 μM 细胞过滤器过滤细胞溶液，并使用细胞计数器计数细胞计数细胞。
  7. 将细胞溶液在4°C下以300× g 离心10分钟。 吸出 BSA 溶液，留下细胞沉淀。根据基于微流控的 snRNA-seq 试剂盒手册在 NSB+ 培养基中重悬细胞。

3. 从类器官中分离单核

  1. 将类器官转移到冷冻的 PBS 中，并将每个类器官切成 4 块。用冷冻的 PBS 洗涤类器官 2 次。
  2. 用剪刀剪开 1000 μL 移液管的移液器尖端，并将类器官块转移到 2 mL 移液器中。完全吸出 PBS 并加入 1 mL NP40 裂解缓冲液。
  3. 用 dounce 研杵 A 进行 3 次，用 dounce 研杵 B 进行 3 次，将悬浮液转移到 15 mL 离心管中。用额外的 1 mL NP40 裂解缓冲液洗涤 douncer，然后转移到 15 mL 离心管中。在室温下孵育 5 分钟，然后将悬浮液以 500 x g 离心 5 分钟 。
  4. 吸出上清液，留下 50 μL 上清液。加入 1 mL NSB+ 而不干扰沉淀。孵育 5 分钟后重悬。
  5. Percoll 梯度顶部的层悬浮液（底层:1 mL NSB + 和 250 μL Percoll，中间层:1 mL NSB+ 和 188 μL Percoll，顶层:1 mL NSB + 和 125 μL Percoll）。（严重）非常小心地进行分层，以避免分层混合。
  6. 在4°C下以500× g 离心5分钟，吸出上清液并重悬于NSB +中。使用 40 μM 细胞过滤器过滤细胞核溶液。
  7. 使用 DAPI 和 Neubauer 室对细胞核进行染色和计数。根据基于微流控的 scRNA-seq 试剂盒手册重悬细胞核。

4. 文库制备和测序

  1. 将 10,000 个细胞和细胞核加载到微流控系统中，并根据基于微流控的 scRNA-seq 试剂盒手册（材料表）生成文库。
  2. 对文库进行测序，每个 snRNA-seq 文库估计为 6 x 108 个reads，每个scRNA-seq文库估计为1.6 x 108 个reads，导致snRNA-seq数据集的测序饱和度为87%，scRNA-seq数据集的测序饱和度为36%。

5. 分析

  1. 使用 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的数据分析管道进行测序分析，并与人类 GRCh38 基因组对齐。使用 R 包 Seurat（版本 4.1.1）25 对此管道生成的计数矩阵进行进一步分析。
  2. 通过考虑至少 5 个细胞中表示的基因并合并包含至少 300 个基因的细胞来创建 Seurat 对象。对于 scRNA-seq 数据集，通过保留每个细胞核包含超过 1000 个基因但少于 4000 个基因的细胞，以及对于 snRNA-seq 数据集，通过保留每个细胞核包含超过 800 个但少于 4000 个基因的细胞来执行额外的质量控制过滤。排除超过 5% 线粒体读数的数据集、细胞和细胞核。
  3. 为了减轻两种方法之间的批量效应，请集成两个过滤的数据集，通过均匀流形近似和投影 （UMAP） 进行归一化和可视化。省略显示低唯一分子标识符 （UMI） 和基因计数的聚类 1。之后，对于簇，根据已知的标记基因和来自 Ana Uzquiano 等人的 30 天前的类器官数据集分配细胞身份。（补充编码文件 1）18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了使用 scRNA-seq 和 snRNA-seq 研究脑类器官的细胞类型组成，在培养 30 天后收获脑类器官，因为该阶段的类器官已经表现出由中间祖细胞包围的祖细胞和早期神经元组成的神经上皮环 4,18。在整个生长和培养过程中监测类器官的质量对于获得可靠的单细胞和单核数据至关重要。

类器官是通过将iPSC聚集到胚状体中而形成的（图1B，C）。组装后，这些胚状体有望表现出清晰的边缘和最少的细胞碎片（图1C）。在神经外胚层的诱导下，胚状体在表面周围表现出可观察到的亮度，内部区域相对较暗，表明神经诱导成功（图1D）。在接下来的几周内，类器官发育出所谓的环，即神经元莲座状结构，主要由神经上皮细胞组成（图1E，F）。虽然这些类器官可以在培养物中维持数月，但应注意的是，随着它们的大小增加，由于缺乏营养和氧气供应，类器官内部的细胞死亡会相应增加，最终导致坏死核心的发展。

为了通过测序分析探索皮质类器官内的细胞多样性，我们从类器官中分离出单细胞和细胞核。为了平衡单批脑类器官中固有的异质性，我们对一批中的四个混合类器官进行了测序。此外，为了比较分离过程之间的目的并消除 snRNA-seq 和 scRNA-seq 文库之间的批量效应，这些类器官被分成两半（总共八半;图2）。在酶分离单个细胞之后，确保细胞活力保持在80%以上至关重要，同时观察细胞保持圆形形态（图3A，B）。同样，单个原子核的机械分离应产生不同大小的完整原子核，而可检测到的碎片最少甚至没有（图3C，D）。

测序分析显示，捕获和测序的细胞多于细胞核。两个数据集都显示出通过每个细胞和细胞核的高基因和UMI计数以及低线粒体读数百分比来评估的良好质量（图4A-C）。正如预期的那样，与 snRNA-seq 数据集相比，线粒体和核糖体读取在 scRNA-seq 数据集中回收的总读取部分占比更高。在 scRNA-seq 数据集中，大多数细胞含有少于 30% 的核糖体读长，而在 snRNA-seq 数据集中，大多数细胞核含有少于 5% 的核糖体读长。此外，在 scRNA-seq 数据集中捕获的大多数细胞包含的线粒体读数少于 5%。在过滤掉线粒体读数后，大约 10,000 个细胞和 3,000 个细胞核通过了质量阈值。

对两个数据集的综合分析显示，所有簇都在两个数据集中表示，表明两种方法都能恢复相同的细胞类型（图5A，C）。数据集的注释显示，主要细胞群包括放射状胶质细胞、中间祖细胞、皮质下祖细胞和神经元，以及新生深层投射神经元和代表性较弱的细胞类型，如Cajal-Retzius、皮质下摆和脉络丛细胞（图5B）。总体而言，scRNA-seq 和 snRNA-seq 可以回收 30 天大的大脑类器官20 中预计存在的所有细胞类型。

胚体形成到成熟时间表;显微镜图像;细胞分化阶段。
图 1:从 iPSC 生成脑类器官。 脑类器官生成的时间过程 （A）。iPSCs成功皮质分化的示例图像（B），其形成胚状体（接种后72小时）（C）并在培养7天后显示成功的神经诱导（D）。类器官在第 15 天 （E） 和第 30 天 （F） 描绘了不同的环。比例尺: B-D 200 μm， E 400 μm， F 800 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

单细胞和细胞核RNA测序图;酶解离，Percoll梯度法。
图 2:从大脑类器官获得单细胞和单核的工作流程。 通过用手术刀切碎类器官，然后进行酶消化（顶部），将类器官解离成单细胞。原子核的分离是通过机械解离进行的，然后通过Percoll梯度（底部）进行纯化。单细胞和细胞核悬浮液被过滤并加载到微流体系统中，用于文库生成和测序。 请点击这里查看此图的较大版本.

细胞显微镜图像显示各种细胞密度和染色模式;方法包括染色。
图 3:从 30 天龄的类器官中分离出的细胞和细胞核的代表性结果。 （A） 使用细胞计数仪拍摄的台盼蓝染色细胞的示例图片和 （B） 相应的特写镜头。（C） DAPI染色细胞核的明场和荧光图像的叠加和（D）相应的特写镜头。比例尺: 100 μM 请点击这里查看此图的较大版本.

小提琴图显示按身份划分的数据变异性;统计分析结果。
图 4:scRNA 和 snRNA-seq 的质量控制。 小提琴图说明了细胞（蓝色）和细胞核（粉紫色）的绝对 UMI 计数 （A）、基因计数 （B）、线粒体 （C） 和核糖体读数 （D）。 请点击这里查看此图的较大版本.

显示 scRNAseq 和 snRNAseq 簇的 UMAP 图，神经元细胞中的基因表达分析。
图 5:scRNA-seq 和 snRNA-seq 在 30 天龄的类器官中检索到相似的细胞群。30 天龄类器官的集成嵌入式 UMAP，显示 scRNA-seq（蓝色）和 snRNA-seq 结果（粉红色-紫色）（A）、scRNA-seq 和 snRNA-seq （B，C） 的整合和注释以及个体图谱。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:细胞培养基和包被成分 请点击此处下载此表格。

表2:scRNA和snRNA-seq的解离缓冲液。请按此下载此表格。

补充编码文件1: 用于分析 scRNA-seq 和 snRNA-seq 数据的编码文件。 请点击这里下载此文件。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞和单细胞核的转录组学分析已成为理解复杂组织内基因调控机制的关键工具。这两种方法都可以对大脑类器官进行转录组研究。为了确保实验的整体成功，起始材料的质量具有高度相关性。因此，有必要定期切割类器官以防止形成坏死核心26。也可以通过气液界面培养物来消除这个问题27.为了减少由于类器官异质性导致的批量效应，我们建议每次提取至少使用四个类器官。或者，可以对单个类器官进行多次测序运行，这另外允许检查同一批次17 内的变异性。当同时使用scRNA-seq和snRNA-seq这两种方法时，将类器官一分为二并分为每种方法可以进一步减少由类器官异质性引起的差异。

为了获得单个细胞或细胞核的高质量转录组谱，在整个过程中细胞或核膜保持完整至关重要。因此，优化酶浓度和酶消化的时间至关重要，这需要根据类器官的年龄和大小进行调整。此外，使用正确的温度和离心速度并避免苛刻的移液也很重要。在活性低的情况下，可以在类器官解离成单细胞后使用死细胞去除试剂盒。作为补充，对于细胞核的分离，用 PBS 小心洗涤类器官并根据类器官的大小调整 douncer 的冲程次数至关重要。仔细对 Percoll 梯度进行分层也很重要，以避免分层中的干扰。如果分离后仍有受损细胞核，建议通过荧光激活细胞分选22 实施分选步骤。总体而言，使用RNAse抑制剂对于从样品解离到文库生成的所有步骤都至关重要，以保留每个细胞或细胞核的高质量RNA。

在这项研究中，scRNA-seq产生了更多的细胞，从而可以更广泛地了解细胞群。此外，与细胞核相比，细胞含有更多的 RNA，并且更容易通过表面标记物富集特定细胞类型。然而，单细胞解离依赖于酶促过程，该过程可以诱导应激相关 RNA的转录 19,28。特别是在与应激反应增加相关的疾病中，这可能导致解离诱导的伪影20。此外，研究表明，单细胞分离导致敏感细胞群的丢失 3,29。虽然这在这项研究中可能并不明显，但当使用以更高的细胞多样性为特征的较老的大脑类器官时，这是一个可能的结果。

由于两个数据集都检索相同的细胞群，因此分离方法的选择在很大程度上取决于研究问题、组织采集和时间管理。虽然在解离后，脑类器官的单细胞在甲醇中的固定和储存已经很成熟30，但从冷冻脑类器官中分离单核仍然需要优化。

总体而言，我们的方案提供了一个多功能且适应性强的平台，用于研究大脑类器官中单个细胞和细胞核的转录组学特征，为深入研究体外人脑模型中发育和疾病相关问题铺平了道路。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Valeria Fernandez-Vallone 提供 Miltenyi 神经解离套件的原始说明。我们还要感谢 Max Delbrueck Centrum 的基因组学技术平台提供 NP40 裂解缓冲液的配方和建立此方案的宝贵建议。我们还要感谢玛格丽塔·赫尔佐格（Margareta Herzog）和亚历山德拉·切尔尼切夫（Alexandra Tschernycheff）对实验室组织的支持。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-二硫代-DL-THREIT-LSG.， FD MOL.-BIOL.， ~1 M IN H2O （DTT）Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA 低结合管 VWR525-0130微量离心管
10x Cellranger 管道 分析管道
15 ml FalconFalcon离心管
2-巯基乙醇 （BME）Life Technologies21985023
50 ml FalconFalcon离心管
A83-01Bio Technologies379762
抗生素/抗真菌溶液 （100X）Life Technologies15240062
B-27 Plus补充剂Life Technologies17504044
不含维生素A的B-27补充剂Life Technologies12587010
牛血清白蛋白，无脂肪酸（BSA）Sigma AldrichA8806-5G 
cAMP生物宝石6099240
cAMP生物宝石6099240
C-CHIP NEUBAUER 改进的VWRDHC-N01
细胞过滤器 40 µmNeolab352340
细胞过滤器 70 & micro;m（白色）尼龙西格玛CLS431751-50EA
铬控制器 &Next GEM 配件套件10X Genomics1000204
铬 Next GEM Chip G 单细胞试剂盒，16 次反应10X 基因组学1000127
铬 Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.110X 基因组学1000268
完整， 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物Roche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce 组织研磨机套装 2 mL 完整Sigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex 培养基Life 技术A2858501
EVE 细胞计数载玻片VWREVS-050 （ 734-2676）
胎儿血清 不含四环素 （FBS）PAN BiotechP30-3602
Geltrex 不含 LDEV （涂层）Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotec解离机
GlutaMAX 补充剂Life Technologies35050038
肝素钠细胞培养测试SigmaH3149-10KU
人重组 BDNFStemCell Technologies78005.3
人重组 GDNFStemCell Technologies78058.3
胰岛素溶液 人Sigma AldrichI2643-25MG
敲除血清替代物Life Technologies10828028
LDN193189盐酸盐 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM 非必需氨基酸 （100x）Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 氯化镁 （1M） 不含 RNAse的热科学AM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276干细胞培养基
mTeSR1StemCell Technologies85850干细胞培养基
N2 补充剂 StemCell Technologies17502048
神经组织解离试剂盒Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 系统Illumina测序仪
NP-40 表面活性Amps 去污剂溶液Life Technologies28324
PBS杜尔贝科SInvitrogen14190169
PenStrep （青霉素 - 链霉素）Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic （R） F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
阻岩剂（Y-27632 二盐酸盐） SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
氯化钠 NaCl （5M），无 RNase 的 100mL，InvitrogenAM9760G
StemFlex 培养基Thermo ScientificA3349401干细胞培养基
，StemMACS iPS-Brew XF，MiltenyiBiotec130-104-368干细胞培养基
TC-Platte 96 孔，圆底Sarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
台盼蓝T8154-20mlSigma
TrypLE Express 酶，无酚红Life Technologies12604013蛋白酶试剂
UltraPure 1M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005
，，胰

References

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