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方法文章

脑类器官中单细胞与单细胞核转录组的生成及下游分析

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DOI：

10.3791/66225

⸱

2024年3月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用单细胞和单细胞核RNA测序技术生成人脑类器官并进行下游分析的综合性实验方案。

摘要

在过去十年中，单细胞转录组学得到了显著发展，已成为一种标准的实验室方法，可同时分析单个细胞的基因表达谱，从而捕获细胞异质性。为了克服难以分离的细胞类型的限制，可采用一种替代性策略，即通过测序手段回收单个细胞核而非完整细胞，从而使单细胞转录组分析具有更广泛的适用性。这些技术已成为脑类器官研究的基石，确立了脑类器官作为人类大脑发育模型的地位。本实验方案充分利用单细胞和单细胞核转录组学在脑类器官研究中的潜力，提供了一步一步的操作指南，涵盖类器官解离、单细胞或细胞核分离、文库构建 及测序等关键步骤。通过实施这些替代性方法，研究人员可以获得高质量的数据集，进而鉴定神经元与非神经元细胞类型、基因表达谱以及细胞谱系轨迹，从而促进对塑造大脑发育的细胞过程和分子机制的全面研究。

引言

近年来，类器官技术已成为培养类器官组织的一种颇具前景的工具1,2,3尤其是对于人脑等难以直接获取的器官，类器官为深入研究提供了机会 发育与疾病发生4因此，脑类器官已被广泛用作研究多种人类脑部疾病的实验模型，包括发育性、精神性甚至神经退行性疾病。4,5,6.

随着单细胞转录组测序技术的发展，人类原代组织和复杂的 体外 模型能够以前所未有的精细程度进行研究，从而揭示健康与疾病状态下细胞亚群水平上基因表达变化的机制，并为发现新的潜在治疗靶点提供依据7,8,9类器官领域已通过利用单细胞转录组测序来评估脑类器官技术的细胞组成、可重复性及保真度而取得进展10,11,12单细胞RNA测序（scRNA-seq）可实现细胞分类，并鉴定类器官疾病中的基因表达失调13,14重要的是，类器官组织的复杂性 necessitates 采用能够对单个细胞进行分析的技术。使用群体转录组分析（bulk RNA sequencing）等方法对类器官进行表征，会导致细胞异质性被掩盖，基因表达谱被类器官复杂组织中所有细胞类型的平均信号所稀释，从而限制了我们对健康和疾病状态下类器官发育过程中动态变化的理解15,16,17随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的不断进步，越来越多的图谱正在被构建，例如艾伦脑图谱（Allen Brain Atlas）或Uzquiano等人绘制的人脑类器官单细胞图谱。18.

从脑类器官中成功实现单细胞RNA测序（scRNA-seq）依赖于完整细胞的有效分离与捕获。由于脑类器官解离为单个细胞的过程基于酶消化，可能通过诱导细胞应激和损伤而影响基因表达模式19,20。因此，将组织解离为单个细胞是最关键的步骤。另一种替代方法是单核RNA测序（snRNA-seq），该方法可无需酶解，从新鲜或冷冻组织中提取细胞核21,22。然而，从组织中分离细胞核也面临其他挑战，例如目标细胞类型的富集，以及细胞核中的RNA含量相较于完整细胞较低。

脑类器官的转录组研究通常采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）10,18,23。然而，单细胞核的分离可能为研究类器官的转录组特征提供一种正交且互补的方法。本文介绍了一套适用于脑类器官的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）工具箱，并讨论了获得高质量测序数据的关键要点。

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方案

所述实验方案在马克斯·德尔布吕克分子医学中心的生物安全二级实验室中进行（批准编号：138/08），符合欧盟及国家关于研究伦理的要求和规定。

1. 从诱导多能干细胞（iPSCs）衍生前脑类器官

注意：本方案已针对多家公司提供的不同干细胞培养基培养的多种不同iPSC细胞系进行过测试（表1）。前脑类器官的生成高度依赖于高质量的iPSC细胞，以及在启动本方案前达到60%-70%的融合度。本研究中使用了一种 commercially available cell line（参见材料表）。

  1. 第0天：拟胚体形成
    1. 使用Pluronic溶液处理96孔板时，向96孔U型底板的每孔中加入80 µL无菌过滤的2% Pluronic溶液。在室温（RT）或37 °C下孵育至少15分钟。
      注意：Pluronic处理的板可在4 °C保存最多2周，用于拟胚体形成时可直接使用，无需任何洗涤步骤。
    2. 在接种细胞前，使用吸液器或多通道移液器从各孔中移除Pluronic溶液。
    3. 开始前，为一个96孔板准备以下试剂：含5 mL预热DMEM:F12培养基的15 mL离心管；11 mL添加了50 µM Y-27632的干细胞培养基；已用Pluronic处理的板（如上所述）。
    4. 从6孔板中一个60-70%融合度的iPSC孔中吸除培养基。用PBS洗涤细胞一次。加入500 µL基于胰蛋白酶的消化试剂，在37 °C孵育2-6分钟。
      注意：基于胰蛋白酶的试剂消化细胞所需时间取决于细胞密度及各iPSC系的细胞基质黏附特性。为避免过度消化，建议在加入胰蛋白酶类试剂孵育2分钟后，使用明场显微镜观察细胞形态。
    5. 使用1000 µL移液器吹打使细胞脱离，并转移至预先准备好的含DMEM:F12培养基的15 mL离心管中以终止消化。
    6. 将细胞悬液在300 x g条件下离心3分钟。吸除上清液，保留细胞沉淀。将细胞重悬于1 mL添加了50 µM Y-27632的干细胞培养基中。
    7. 使用细胞计数仪计数细胞，并将所需数量的细胞加入含50 µM Y-27632的干细胞培养基中。单个拟胚体的生成所需细胞数为3,000–12,000个，具体数量取决于细胞系。
    8. 使用10 mL移液器将细胞悬液转移至多通道试剂储液槽中。使用多通道移液器，将100 µL/孔的细胞悬液加入先前经Pluronic处理的96孔板中。
    9. 将96孔板置于37 °C、5% O2和5% CO2的培养箱中。为避免干扰拟胚体形成过程，请勿移动该板。
  2. 第2天：拟胚体形成情况检查
    1. 使用明场显微镜的10倍物镜检查拟胚体形成情况。拟胚体应具有清晰的边缘且细胞死亡最少。
    2. 尽可能吸除培养基，并更换为每孔100 µL的干细胞培养基。（关键）在换液过程中拟胚体容易被移出孔外。请注意避免将其移除，因此在吸液后应观察培养基中是否残留拟胚体。
  3. 第3天：神经外胚层诱导
    1. 尽可能吸除培养基，并更换为每孔120 µL的诱导培养基，将培养板置于37 °C、20% O2和5% CO2条件下。
  4. 第6天：包埋
    1. 根据iPSC细胞系的不同，诱导神经外胚层出现需要3至4天。应定期监测拟胚体。当拟胚体边缘变亮时，即表示已准备好进行包埋。可采用以下两种不同的拟胚体包埋方法之一24。
    2. 包埋方法1：Cookie包埋法
      1. 将一份未稀释的细胞外基质胶在冰上解冻1–2小时。（关键）始终将细胞外基质胶置于冰上，以防止其凝固。建议预先分装，以减少解冻时间和反复冻融次数。
      2. 使用尖嘴钳剪去200 µL移液器吸头的尖端，并将16–32个拟胚体收集至一个1.5 mL微量离心管中。
      3. 将拟胚体连同67 µL培养基转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。使用剪去尖端的200 µL移液器吸头加入100 µL细胞外基质胶，并轻轻混匀。
      4. 将拟胚体均匀分布于一个6 cm培养皿中，放置5–10分钟，使细胞外基质胶凝固。
      5. 加入约4 mL分化培养基，并在37 °C、20% O2和5% CO2条件下培养。次日将培养皿置于轨道摇床上（84 rpm）。确保所有拟胚体均从底部脱离。若未完全脱离，可用剪去尖端的移液器吸头配合培养基轻轻吹打使其脱离。
    3. 包埋方法2：液相包埋法
      1. 将一份未稀释的细胞外基质胶在冰上解冻1–2小时，并将分化培养基置于冰上。（关键）添加细胞外基质胶时，培养基必须保持冰冻状态。
      2. 待培养基冷却后，将细胞外基质胶加入其中，使其终浓度为2%。使用尖嘴钳剪去200 µL移液器吸头的尖端，并将最多24个拟胚体转移至6孔板的一个孔中。
      3. 移除所有多余培养基，并向6孔板的一个孔中加入约4 mL含2%细胞外基质胶的分化培养基。立即置于轨道摇床（84 rpm）上。
  5. 第9–20天：每隔3–4天使用分化培养基进行一次完全换液。
  6. 第21–30天：将类器官转移至成熟培养基中，并每隔3–4天进行一次完全换液。
  7. 类器官解离：为获得单细胞核或单细胞悬液，应使用高质量的类器官。为避免过多细胞死亡，需定期切割类器官以防止坏死核心形成，并在解离前让其恢复培养2周，再进行后续分析。

2. 类器官单细胞的分离

注意：单细胞解离使用神经组织解离试剂盒（表2），该试剂盒结合了机械和酶解解离方法。此处我们描述的是手动机械解离方法。作为替代方案，也可使用解离仪。

  1. 在冰上配制 STOP 溶液和 0.04% BSA。在 PBS 中配制酶混合液 1 和酶混合液 2 以及 0.04% BSA，并置于冰上。
  2. 在 6 孔板的一个孔中收集最多 5 个类器官，吸除多余培养基，用 PBS 洗涤一次以去除残留培养基。将类器官置于孔中央，使用手术刀彻底切碎。
  3. 加入酶混合液 1，置于 37 °C、20% O2 和 5% CO2 条件下，以 90 rpm 振荡消化 10–15 分钟。
  4. 使用 1000 µL 移液枪头，通过反复吹打最多 10 次重悬类器官。加入酶混合液 2，使用 1000 µL 移液枪头充分吹打混匀。置于 37 °C、20% O2 和 5% CO2 条件下，以 90 rpm 振荡消化 10–15 分钟。
  5. 通过将细胞悬液重悬于 10 mL 冷的 STOP 溶液中终止消化过程。使用 70 µm 细胞筛过滤细胞悬液。在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 10 分钟，形成细胞沉淀。
  6. 吸除上清液，保留细胞沉淀，将细胞重悬于 4 mL 冷的 0.04% BSA 溶液中。使用 40 µm 细胞筛过滤细胞悬液，并使用细胞计数仪进行细胞计数。
  7. 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 10 分钟。吸除 BSA 溶液，保留细胞沉淀。根据基于微流控技术的单核 RNA 测序（snRNA-seq）试剂盒说明书，将细胞重悬于 NSB+ 培养基中。

3. 类器官单细胞核的分离

  1. 将类器官转移至预冷的 PBS 中，并将每个类器官切成 4 块。用预冷的 PBS 洗涤类器官 2 次。
  2. 用剪刀剪去 1000 µL 移液枪枪头的尖端，将类器官碎片转移至 2 mL 玻璃匀浆器中。彻底吸除 PBS，加入 1 mL NP40 裂解缓冲液。
  3. 先用匀浆杵 A 匀浆 3 次，再用匀浆杵 B 匀浆 3 次。将悬液转移至 15 mL 离心管中。用额外的 1 mL NP40 裂解缓冲液冲洗匀浆器，并将冲洗液也转移至同一离心管中。室温孵育 5 分钟，随后在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  4. 吸除上清液，保留约 50 µL 上清。加入 1 mL NSB+ 缓冲液，注意不要扰动沉淀。孵育 5 分钟后充分重悬沉淀。
  5. 将悬液小心地分层加至 Percoll 梯度液上方（底层：1 mL NSB+ 和 250 µL Percoll，中层：1 mL NSB+ 和 188 µL Percoll，顶层：1 mL NSB+ 和 125 µL Percoll）。（关键步骤）操作时需极其小心，避免各层液体混合。
  6. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，吸除上清，用 NSB+ 缓冲液重悬。使用 40 µm 细胞滤网过滤核悬液。
  7. 使用 DAPI 染色并用 Neubauer 计数板对细胞核进行计数。根据基于微流控技术的单细胞 RNA 测序试剂盒说明书要求重悬细胞核。

4. 文库构建与测序

  1. 将10,000个细胞和细胞核加载到微流控系统中，并根据基于微流控的单细胞RNA测序试剂盒操作手册（材料表）构建文库。
  2. 对文库进行测序，每个单核RNA测序文库预计产生6 × 108条读长，每个单细胞RNA测序文库预计产生1.6 × 108条读长，最终单核RNA测序数据集的测序饱和度为87%，单细胞RNA测序数据集的测序饱和度为36%。

5. 分析

  1. 使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）的数据分析流程进行测序数据分析，并将序列比对至人类GRCh38基因组。将该流程生成的计数矩阵导入R语言软件包Seurat（版本4.1.1）进行进一步分析25。
  2. 构建Seurat对象时，筛选在至少5个细胞中表达的基因，并纳入包含至少300个基因的细胞。进一步进行质量控制过滤：对于scRNA-seq数据集，保留基因数在1000至4000之间的细胞；对于snRNA-seq数据集，保留每个细胞核中基因数在800至4000之间的样本。排除线粒体reads比例超过5%的细胞和细胞核数据。
  3. 为减少两种方法之间的批次效应，整合两个经过过滤的数据集，进行标准化处理，并通过统一流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）进行可视化。剔除唯一分子标识符（UMI）和基因计数均较低的聚类1。随后，根据已知的标记基因以及Ana Uzquiano等人的30天龄类器官数据集（补充编码文件1）18，对各聚类进行细胞类型注释。

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结果

为了利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）研究脑类器官的细胞类型组成，在培养30天后收获脑类器官，因为此阶段的类器官已表现出由祖细胞、周围环绕的中间祖细胞以及早期神经元构成的神经上皮环结构4,18。在整个生长和培养过程中监测类器官的质量，对于获得可靠的单细胞和单细胞核数据至关重要。

类器官通过iPSCs聚集形成拟胚体（图1B，C）而生成。组装完成后，这些拟胚体应呈现清晰的边缘，且细胞碎片极少（图1C）。在神经外胚层诱导后，拟胚体表面出现明显的亮化现象，内部区域则相对较暗，表明神经诱导成功（图1D）。在随后的数周内，类器官发育出所谓的环状结构，即主要由神经上皮细胞构成的神经元玫瑰花结样结构（

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讨论

单细胞和单细胞核转录组分析已成为研究复杂组织中基因调控机制的关键工具。这两种方法均可用于脑类器官的转录组研究。为确保实验整体成功，起始材料的质量至关重要。因此，有必要定期切割类器官，以防止坏死核心的形成26。也可通过气液界面培养来消除这一问题27。为了减少因类器官异质性导致的批次效应，我们建议每次提取至少使用四个类器官。或者，也可对单个类器官进行多次测序，这还能进一步分析同一批次内的变异情况17。当同时平行使用scRNA-seq和snRNA-seq两种方法时，可将类器官切成两半，分别用于两种方法，从而进一步降低由类器官异质性引起的技术差异。

为了获得高质量的单个细胞或细胞核转录组谱，关键在于在整个操作过程中保持细胞或细胞核膜的完整性。因此，必须优化酶的浓度和酶消化的时间，且需根据类器官的年龄和大小进行相应调整。此外，使用适当的温度和离心速度，并避免剧烈的移液操作也至关重要。如果细胞活力较低，可在将类器官解离为单细胞后使用死细胞去除试剂盒。作...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢Valeria Fernandez-Vallone提供了Miltenyi神经组织解离试剂盒的原始操作说明。同时感谢马克斯·德尔布吕克分子医学中心基因组技术平台提供了NP40裂解缓冲液的配方以及在建立本实验方案过程中给予的宝贵建议。我们还感谢Margareta Herzog和Alexandra Tschernycheff在实验室组织管理方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫代-DL-赤藓糖醇，F. D. Mol.-Biol.，约 1 M 在 H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA低吸附管 VWR525-0130微量离心管
10x Cellranger 分析流程 分析流程
15 ml FalconFalcon离心管
2-巯基乙醇（BME）Life Technologies21985023
50 ml FalconFalcon离心管
A83-01生物技术379762
抗生素/抗真菌素溶液（100X）Life Technologies15240062
B-27 Plus添加剂Life Technologies17504044
B-27 补充剂（不含维生素 A）Life Technologies12587010
牛血清白蛋白，无脂肪酸（BSA）Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP 改良型血球计数板VWRDHC-N01
细胞滤网 40 µmNeolab352340
70 微米细胞滤网 µm（白色）尼龙SigmaCLS431751-50EA
铬控制器 & Next GEM 附加试剂盒10X Genomics1000204
Chromium Next GEM 芯片 G 单细胞试剂盒，16 次反应10X Genomics1000127
Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.110X Genomics1000268
完整，  无EDTA蛋白酶抑制剂混合液罗氏11873580001
DAPI默克化学公司0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce 组织研磨器套装，2 mL，完整Sigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex 培养基Life TechnologiesA2858501
EVE细胞计数板VWREVS-050 (734-2676)
无四环素胎牛血清（FBS）PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free（包被）Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotec解离仪
GlutaMAX 补充剂Life Technologies35050038
肝素钠，细胞培养测试SigmaH3149-10KU
人重组BDNFStemCell Technologies78005.3
人重组GDNFStemCell Technologies78058.3
人胰岛素溶液Sigma AldrichI2643-25MG
无血清替代物Life Technologies10828028
LDN193189 盐酸盐 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM非必需氨基酸（100倍浓缩）Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl₂ 氯化镁（1 M）RNase-free赛默飞世尔科技AM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276干细胞培养基
mTeSR1StemCell Technologies85850干细胞培养基
N2 补充剂 StemCell Technologies17502048
神经组织解离试剂盒Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 系统Illumina测序仪
NP-40 Surfact-Amps 去垢剂溶液Life Technologies28324
PBS杜尔贝科’sInvitrogen14190169
青霉素-链霉素（PenStrep）Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
泊洛沙姆 F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase 抑制剂Life Technologies EO0382
ROCK 抑制剂（Y-27632 二盐酸盐）SB生物分子Cay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
氯化钠 NaCl (5 M)，无RN酶，100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex 培养基赛默飞世尔科技A3349401干细胞培养基
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368干细胞培养基
96孔圆底TC培养板Sarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
台盼蓝T8154-20mlSigma
不含酚红的 TrypLE Express 酶Life Technologies12604013胰蛋白酶类试剂
UltraPure 1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life SciencesBML-WN100-0005

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