本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。
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摘要
摘要
斑马鱼是一种引人关注的模式生物，以其显著的心脏再生能力而闻名。研究其跳动的心脏 体内 对于深入了解损伤后结构和功能变化至关重要。然而，获取斑马鱼心脏的高分辨率、高速四维（4D，即三维空间加一维时间）图像以评估心脏结构和收缩功能仍具挑战性。在此背景下，自主研发的光片显微镜（LSM）与定制化的计算分析方法 用于克服这些技术局限。该策略包括LSM系统构建、回顾性同步、单细胞追踪和用户导向分析，能够在转基因小鼠全心范围内以单细胞分辨率研究心肌微结构与收缩功能 Tg(myl7:nucGFP) 斑马鱼幼体。此外，我们还能够进一步结合小分子化合物的显微注射，以精确且可控的方式诱导心脏损伤。总体而言，该体系可实现对心脏形态发生和再生过程中生理与病理生理变化以及单细胞水平区域力学特性的动态追踪。
引言
斑马鱼（Danio rerio）因其光学透明性、遗传可操作性以及强大的再生能力，被广泛用作研究心脏发育、生理学及修复过程的模式生物1,2,3,4。心肌梗死后，尽管结构和功能的变化会影响心脏射血功能和血流动力学，但技术上的局限性仍阻碍了以高时空分辨率对心脏再生过程中的动态变化进行深入研究。例如，传统的成像方法（如共聚焦显微镜）在成像深度、时间分辨率或光毒性方面存在局限，难以捕捉多个心动周期中动态变化并准确评估心肌收缩功能5。
光片显微镜是一种先进的成像方法，通过快速将激光扫描穿过心脏的心室和心房，成功解决了上述问题，实现了具有更高时空分辨率的精细图像，同时几乎无光漂白和光毒性效应6,7,8,9,10,
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方案
本研究已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，批准编号为 #20-07。Tg(myl7:nucGFP) 转基因斑马鱼幼体12被用于本研究。所有数据采集和图像后期处理均使用具有科研或教育许可的开源软件或平台完成。相关资源可在合理请求下向作者索取。
1. 斑马鱼繁殖与胚胎显微注射
时间：2 天
- 通过标准的饲养和繁殖程序维持并培育成年斑马鱼。详细方法请参考先前的报告13。
- 按照既定方案进行显微注射14。本研究中，显微注射在1-2细胞（合子）阶段进行。
注意：准确识别该阶段对于实现有效的显微注射以及确保胚胎发育的一致性至关重要。在单细胞阶段，卵黄顶部会形成一个小圆顶，此阶段通常持续约12分钟。进入双细胞阶段后，可观察到两个相邻的圆顶，此阶段持续约受精后45分钟15。有关系统构建的更详细信息可参见其他报告或方案12,16,
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结果
本实验方案包含三个主要步骤：斑马鱼制备与显微注射、光片成像及4D图像重建、细胞追踪与虚拟现实（VR）交互。成年斑马鱼允许自然交配后收集受精卵，并根据实验设计需要进行显微注射（图1）。该步骤为研究斑马鱼在心脏发育与再生中的应用提供了切入点，同时在后续的成像与分析中起关键作用。利用自主搭建的光片显微镜（LSM）系统，在不同发育阶段（从3 dpf至7 dpf）对跳动的心脏进行成像，并将沿z轴获取的图像序列进行配准，以重建4D斑马鱼心脏模型（图2 和 图3）。这些模型为深入的表型表征提供了基础，对于揭示心脏形态与功能在发育过程中的动态变化至关重要。通过定制的虚拟现实（VR）平台对斑马鱼心脏中的单个细胞进行追踪，量化其运动与相互作用。同时，在心房和心室中比较选定细胞在一个心动周期内的速度及相对距离变化，以评估区域收缩性并研究局部应变（图4）。区域应变的计算基于感兴趣区域内两个相邻心肌细胞之间位移变化的差异。分数.......
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讨论
将斑马鱼模型与工程学方法相结合，在心肌梗死、心律失常和先天性心脏缺陷的体内研究中具有巨大潜力。凭借其光学透明性、再生能力以及与人类在遗传和生理上的相似性，斑马鱼胚胎和幼鱼已被广泛应用于科学研究1,2,4。光片成像技术具有优异的时空分辨率、光损伤小以及光学切片能力，使其在斑马鱼幼鱼心脏形态和收缩功能的四维研究中脱颖而出12,26,27,28。本实验方案介绍了一种综合性方法，整合了光片成像、回顾性同步、三维细胞追踪以及交互式虚拟现实（VR）平台，用于定量分析。该方法为捕获和重建心脏收缩、追踪并量化细胞动态，以及评估心脏发育和再生过程中的结构、功能和力学变化提供了入门途径。此外，该方法还.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢波士顿儿童医院的Caroline Burns博士慷慨分享转基因斑马鱼。感谢德克萨斯大学达拉斯分校的Elizabeth Ibanez女士在斑马鱼饲养方面提供的帮助。我们还感谢德克萨斯大学达拉斯分校D-incubator成员提供的所有建设性意见。本研究由美国国立卫生研究院R00HL148493（Y.D.）、R01HL162635（Y.D.）以及德克萨斯大学达拉斯分校STARS项目（Y.D.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 资源 | 来源/参考文献 | 标识符 | |
| 动物模型 | |||
| Tg(myl7:nucGFP) 转基因斑马鱼 | Boston儿童医院Burns实验室 | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| 软件与算法 | |||
| MATLAB | The MathWorks公司 | R2023a | |
| LabVIEW | 美国国家仪器公司 | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | 滨松光子学公司 | 4.6.1.2 | |
| Python | Python软件基金会 | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider等18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen等15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity软件公司 | 2020.3.2f1 | |
| Amira | 赛默飞世尔科技公司 | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov等17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich等16 | 4 | |
| 光片成像系统 | |||
| 柱面透镜 | Thorlabs公司 | ACY254-050-A | |
| 4倍照明物镜 | 尼康公司 | MRH00045 | |
| 20倍检测物镜 | 奥林巴斯公司 | 1-U2M585 | |
| sCMOS相机 | 滨松公司 | C13440-20CU | |
| 电动XYZ平台 | Thorlabs公司 | PT3/M-Z8 | |
| 双轴倾斜平台 | Thorlabs公司 | GN2/M | |
| 旋转步进电机 | Pololu公司 | 1474 | |
| 荧光微珠 | Spherotech公司 | FP-0556-2 | |
| 473 nm DPSS激光器 | Laserglow公司 | R471003GX | |
| 532 nm DPSS激光器 | Laserglow公司 | R531003FX | |
| 显微注射仪与真空泵 | |||
| 显微注射仪 | WPI公司 | PV850 | |
| 真空泵 | Welch公司 | 2522B-01 | |
| 预拉制玻璃毛细管 | WPI公司 | TIP10LT | |
| 凝胶加样用毛细管尖端 | Bio-Rad公司 | 2239912 | |
| 虚拟现实硬件 | |||
| VR头戴显示器 | Meta公司 | Quest 2 | |
| 30 mg/L PTU溶液 | |||
| PTU | Sigma-Aldrich公司 | P7629 | |
| 1× E3工作液 | - | - | |
| 1% 琼脂糖 | - | - | |
| 低熔点琼脂糖 | 赛默飞公司 | 16520050 | |
| 去离子水 | - | - | |
| 10 g/L Tricaine储备液 | |||
| Tricaine | Syndel公司 | SYNC-M-GR-US02 | |
| 去离子水 | - | - | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich公司 | S6014 | |
| 150 mg/L Tricaine工作液 | |||
| 10 g/L Tricaine储备液 | - | - | |
| 去离子水 | - | - | |
| 60× E3储备液 | |||
| 氯化钠 | 德克萨斯大学达拉斯分校实验动物资源中心（LARC） | NaCl | |
| 氯化钾 | - | KCL | |
| 二水合氯化钙 | - | CaCL2 × 2H2O | |
| 七水合硫酸镁 | - | MgSO4 × 7H2O | |
| 反渗透水 | - | - | |
| 1× E3工作液 | |||
| 60× E3储备液 | 德克萨斯大学达拉斯分校实验动物资源中心（LARC） | - | |
| 反渗透水 | - | - | |
| 1% 亚甲蓝（可选） | - | C16H18ClN3S |
参考文献
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, ....
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