本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。
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摘要
摘要
斑马鱼是一种引人关注的模式生物，以其显著的心脏再生能力而闻名。研究其跳动的心脏 体内 对于深入了解损伤后结构和功能变化至关重要。然而，获取斑马鱼心脏的高分辨率、高速四维（4D，即三维空间加一维时间）图像以评估心脏结构和收缩功能仍具挑战性。在此背景下，自主研发的光片显微镜（LSM）与定制化的计算分析方法 用于克服这些技术局限。该策略包括LSM系统构建、回顾性同步、单细胞追踪和用户导向分析，能够在转基因小鼠全心范围内以单细胞分辨率研究心肌微结构与收缩功能 Tg(myl7:nucGFP) 斑马鱼幼体。此外，我们还能够进一步结合小分子化合物的显微注射，以精确且可控的方式诱导心脏损伤。总体而言，该体系可实现对心脏形态发生和再生过程中生理与病理生理变化以及单细胞水平区域力学特性的动态追踪。
引言
斑马鱼（Danio rerio）因其光学透明性、遗传可操作性以及强大的再生能力，被广泛用作研究心脏发育、生理学及修复过程的模式生物1,2,3,4。心肌梗死后，尽管结构和功能的变化会影响心脏射血功能和血流动力学，但技术上的局限性仍阻碍了以高时空分辨率对心脏再生过程中的动态变化进行深入研究。例如，传统的成像方法（如共聚焦显微镜）在成像深度、时间分辨率或光毒性方面存在局限，难以捕捉多个心动周期中动态变化并准确评估心肌收缩功能5。
光片显微镜是一种先进的成像方法，通过快速将激光扫描穿过心脏的心室和心房，成功解决了上述问题，实现了具有更高时空分辨率的精细图像，同时几乎无光漂白和光毒性效应6,7,8,9,10,11。
本方案介绍了一种综合成像策略，包括共聚焦显微系统构建、4D图像重建、3D细胞追踪和交互式分析，用于捕获并分析整个心脏在多个心动周期中心肌细胞的动态行为12。该定制的成像系统与计算方法能够 在转基因Tg(myl7:nucGFP)斑马鱼幼体中实现心肌微结构和收缩功能的单细胞水平追踪。此外，通过显微注射将小分子化合物导入胚胎，以评估药物诱导的心脏损伤及其后续再生过程。这一整体性策略为在心脏发育与再生过程中以单细胞分辨率在体研究心肌组织的结构、功能及力学特性提供了切入点。
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方案
本研究已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，批准编号为 #20-07。Tg(myl7:nucGFP) 转基因斑马鱼幼体12被用于本研究。所有数据采集和图像后期处理均使用具有科研或教育许可的开源软件或平台完成。相关资源可在合理请求下向作者索取。
1. 斑马鱼繁殖与胚胎显微注射
时间：2 天
- 通过标准的饲养和繁殖程序维持并培育成年斑马鱼。详细方法请参考先前的报告13。
- 按照既定方案进行显微注射14。本研究中，显微注射在1-2细胞（合子）阶段进行。
注意：准确识别该阶段对于实现有效的显微注射以及确保胚胎发育的一致性至关重要。在单细胞阶段，卵黄顶部会形成一个小圆顶，此阶段通常持续约12分钟。进入双细胞阶段后，可观察到两个相邻的圆顶，此阶段持续约受精后45分钟15。有关系统构建的更详细信息可参见其他报告或方案12,16,17。
2. 斑马鱼胚胎/幼鱼的制备与固定
时间：7 天
- 将受精后1天（dpf）的胚胎转移至含有0.2 mM 1-苯基-2-硫脲（PTU）（见材料表）的E3水中，以防止色素形成。
- 每天更换新鲜的含PTU的E3水，直至进行激光扫描显微成像（LSM）。
- 在0至7 dpf期间的预定时间点，使用体视显微镜对胚胎或幼鱼进行成像，记录其发育情况。
- 准备内径为2 mm的分段式氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管，用于在LSM系统下包埋斑马鱼幼鱼12。
注意：FEP管用于固定样本，并可使用折射率与周围介质（如水）相近的材料进行匹配。 - 从3 dpf开始，将鱼转移至150 mg/L的三卡因（MS-222）溶液中（见材料表），在成像前使其 immobilize（固定）。
- 制备含150 mg/L三卡因的0.8%低熔点琼脂糖，待其冷却至室温后，用移液管将麻醉后的鱼转移至琼脂糖中18。
- 使用另一支移液管将鱼与琼脂糖一起装入FEP管中（图1）。
注意：为确保发育中胚胎受到的应激最小化，在固定前后通过显微观察评估心脏活动（如心率），以检测三卡因麻醉前后是否存在显著差异。此外，可在固定后进一步检查皮肤和肌肉组织是否存在心脏结构异常（如水肿）。三卡因的浓度对心脏成像具有关键影响19，因此本项目中采用150 mg/L浓度的三卡因溶液进行斑马鱼幼鱼收缩成像。尽管当前的回顾性同步方法使我们能够分析不规则心跳20，但针对斑马鱼心脏心律失常的4D成像及长期成像的完整解决方案仍在开发中。
3. 光片成像系统的设置与配置
时间：3-14 天
- 基于柱面透镜构建一套自主设计的光片显微镜（LSM）系统，采用特定波长（如 473 nm 和 532 nm）的连续波二极管泵浦固体（DPSS）激光器作为照明光源（图 2A）。
- 定制 LabVIEW（见材料表）控制代码，以实现样品平移台、光片照明与 sCMOS 相机曝光之间的同步，从而采集图像序列。
注意：有关系统构建的更详细信息可参见其他研究报告或实验方案12,16,17。我们鼓励研究团队在系统构建过程中积极寻求与在光学成像领域具有成熟经验的实验室开展合作。
4. 斑马鱼成像样品制备与数据采集
时间：1 天
- 通过测量荧光微珠来校准 LSM 系统的空间分辨率，并最小化不同深度下的不透明度变化。
- 首先，将直径为 0.53 µm 的荧光微珠（参见材料表）用 0.8% 低熔点琼脂糖稀释至 1:1.5 × 105 的浓度，并将溶液转移至分段 FEP 管中。
- 其次，使用 LSM 系统对微珠成像，并在整个样品范围内测量点扩散函数（PSF），以验证空间分辨率和系统对准情况12。
注意：在本系统中，对半高全宽（FWHM）代表性结果的分析表明，横向和轴向分辨率分别为 1.26 ± 0.15 和 2.48 ± 0.15 µm（n = 60 个微珠）。这表明在整个成像深度范围内空间分辨率保持一致。
- 将固定有斑马鱼幼鱼的 FEP 管牢固地连接到六轴（x、y、z、俯仰、偏航和滚动）电动样品台上，并将管子浸入充满 E3 水的样品室中。为避免卵黄囊引起的光散射并更准确地定位心脏位置，应旋转斑马鱼幼鱼，从腹侧进行成像（图 2B）。在此情况下，大多数捕获的图像将同时包含心室和心房（图 2C）。
注意：由于当前成像过程通常每条鱼耗时少于一小时，且在受控的室温环境中进行，因此本项目中样品室的温度控制和氧气水平调节被视为可选步骤。然而，对于长期延时成像研究，特别是关注发育过程的研究，建议在样品室内持续监测并调节温度至 27 °C，以维持斑马鱼的生理环境，并防止潜在的发育异常。 - 将电动样品台连接至工作站，并配置所有必要参数，包括所需的移动模式。
- 建立 sCMOS 相机与工作站之间的连接。调整所有关键设置，例如 5 ms 的曝光时间和所需的感兴趣区域。
- 在自定义的 LabVIEW 控制程序中设置图像序列的数量及每序列的帧数。
- 开启激光器并启动 LSM 对样品的成像。持续操作直至所有图像序列均成功记录。
- 以每秒 200 帧的帧率记录 300 帧，形成一个二维图像序列，覆盖幼鱼 3–5 个心动周期。该记录捕捉了光片照明选择平面上的心脏收缩功能。
- 以 1 µm 的步长在光片照明方向上移动幼鱼，实现对样品的虚拟切片。
注意：样品台的步长应根据光片系统的轴向分辨率设定，遵循奈奎斯特-香农采样定理12。 - 重复步骤 7，记录新样品切片的另一组图像序列，直至覆盖整个心脏。通常，以 1 µm 步长采集 100–200 个图像序列即可确保覆盖斑马鱼幼鱼的整个心脏（图 2D）。
注意：步骤 4.7–4.9 由 LabVIEW 程序控制，并由 LSM 系统自动执行（图 3）。鉴于生成的图像数据量庞大，建议采用标准化的命名规范对图像序列进行管理。例如，使用“z-1”"、"z-2""等名称建立文件夹，以分类不同图像序列的数据。在每个序列内，图像应按时间点顺序命名（如“1”"、"2""……）。固定一条鱼、调整成像 角度并完成全部数据采集的总时间约为 1 小时。
5. 采用并行计算进行4D图像 重建
时间：1天
注意：我们团队开发的4D重建算法及样本数据可公开获取21。该方法可用于从此前步骤采集的图像序列中重建4D心脏图像（表1）。
- 打开文件 test_Parallel.m 在 MATLAB 中（参见 材料表）。在变量中指定存储原始图像序列的文件夹位置 "baseDir".
- 分配变量 "切片数量" 图像序列的总数（通常为100-150）以及变量 "图像数量" 每个序列中的图像数量（通常为300-500张）。
- 检查显示斑马鱼心脏中位平面的图像序列（例如，第51帧）st 在总共101个序列中确定该序列的第一次和第四次心缩的帧编号，并将其赋值给变量 收缩期第一点 和 收缩期点_4th.
- 点击 运行 开始该过程。
注意：每个图像序列中心动周期的长度将首先由MATLAB程序通过比较不同时间点图像之间的相似性（平方差之和）来确定。随后，通过计算所有图像序列周期长度的平均值来估算心动周期。接下来，程序将通过从第一个图像序列到最后一个图像序列的图像相似性进行迭代比较，对不同轴向位置图像序列的起始点进行对齐。 - 在输出文件夹中查看结果。程序将把图像保存为 ".tif" 带有时间戳的文件。每个 ".tif" 文件是某一特定时间点的三维心脏图像。两幅三维图像之间的时间间隔等于所设置的曝光时间。
注意：重建前几步获取的图像，以展示四维（三维空间 + 一维时间）心脏收缩过程。为在回顾性同步过程中提高高通量研究的效率，该方法利用 MATLAB 并行计算工具箱通过多个 CPU 核心实现并行计算，并将图像转换为 gpuArray 格式，从而在 GPU 上同时执行计算操作。
6. 三维细胞分割与细胞追踪
时间：1 天
- 下载 3DeeCellTracker 软件包（参见材料表），并配置 Python 环境22。
- 下载 ITK-SNAP 标注软件23（参见材料表），并使用该软件在两个选定的时间点（一个处于心室舒张期，另一个处于心室收缩期）对三维心脏图像进行手动标注，以创建训练集和验证集。
注意：其他标注软件也可能适用。 - 在 Python 中运行 3DeeCellTracker 训练程序，并在 TrainingUNet3D 函数中初始化 noise_level（本例中为 100）、folder_path 和 model 参数，以设置预定义的三维 U-Net 模型。
- 在 MATLAB 中，使用 imageDimConverter.m 程序将训练集和验证集转换并重命名为合适的格式以便加载。
- 在 Python 中，使用 trainer.load_dataset() 和 trainer.draw_dataset() 函数加载训练集和验证集。
- 在 Python 中运行 3DeeCellTracker 跟踪程序的第一部分并初始化参数。
注意：此步骤包括定义用于描述图像尺寸的图像参数、选择用于细胞分割的机器学习模型的分割参数，以及选择用于细胞配准的预训练深度神经网络模型的跟踪参数。首次使用时，建议采用 U-Net 模型进行细胞分割，采用 FFN+ PR-GLS 进行细胞配准。需要将数据、模型和结果存储在本步骤中自动创建的文件夹中。 - 在 MATLAB 中，使用 imageDimConverter.m 程序将所有三维心脏图像转换并重命名为合适格式，并将其转移至上一步创建的数据文件夹中。
- 在 Python 中运行 3DeeCellTracker 程序的第二部分以开始分割。
- 当第一幅三维图像完成分割后，将分割结果与原始图像进行比较，若发现任何错误分割，则进行手动校正。将校正后的分割结果移至已创建的 "/manual_vol1" 文件夹中。
- 在 Python 中运行 3DeeCellTracker 程序的第三部分，以完成所有图像的分割。
- 使用 Amira（参见材料表）通过比较被追踪细胞的位置与其对应的原始图像，对追踪结果进行可视化评估。如果测试结果不理想，则从步骤 6.6 重新开始，采用其他机器学习模型进行分割或细胞配准，然后重新启动追踪流程。
注意：分割完成后，默认情况下细胞标签数据以 8 位图像（0 到 255）形式存储，这意味着仅提供 256 个标签用于细胞分类。当需要更多类别时，有两种解决方案。一种是在跟踪程序中将细胞标签数据格式设置为 16 位图像，但这会导致处理时间呈指数级增长，本例中超过两天。另一种解决方案是使用 "separateTrackingResults.py" 程序对细胞标签进行后处理，该程序会根据细胞的物理位置将具有相同标签的细胞分开，并为每个细胞分配不同的标签。本例中该过程耗时约 10 分钟。
7. 虚拟现实模式下的心脏收缩力分析
时间：1 天
- 获取前序步骤的细胞追踪结果。
- 手动验证数据，并筛选在所有体积中图像强度保持一致的细胞（约600个细胞中的500个）。
- 使用 cellLabelsToObj.ipynb 脚本21，通过 3D Slicer 软件24（见材料表）为每个单个细胞生成表面网格，并为每个细胞分配唯一的颜色编码。
- 将每个包含单个时间点所有细胞的三维模型导出为一个单独的 .obj 文件，该文件包含多个子对象，并附带一个 .mtl 文件以描述细胞标签。
- 使用教育许可证将模型导入 Unity，Unity 是一种用于扩展现实的开发引擎。
- 将包含用 C# 编写的函数的自定义脚本应用于模型和用户界面元素，以实现四维可视化和交互式分析。按照步骤 7.7 执行 VR 交互。
- 在虚拟现实（VR）中使用以下功能与模型进行交互（图4）：
- 细胞选择：每次最多选择两个细胞，查看其轨迹、速度、体积、表面积及相对距离。
- 时间点选择：在数据中选择特定时间点以分析所选细胞的输出，例如在舒张期的 t = 0 ms 或收缩期的 t = 200 ms。
- 时间暂停：冻结动态模型，以集中观察所选细胞及其输出结果。
- 对比度调节：调节模型中所选细胞与周围细胞之间的对比度。
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结果
本实验方案包含三个主要步骤：斑马鱼制备与显微注射、光片成像及4D图像重建、细胞追踪与虚拟现实（VR）交互。成年斑马鱼允许自然交配后收集受精卵，并根据实验设计需要进行显微注射（图1）。该步骤为研究斑马鱼在心脏发育与再生中的应用提供了切入点，同时在后续的成像与分析中起关键作用。利用自主搭建的光片显微镜（LSM）系统，在不同发育阶段（从3 dpf至7 dpf）对跳动的心脏进行成像，并将沿z轴获取的图像序列进行配准，以重建4D斑马鱼心脏模型（图2 和 图3）。这些模型为深入的表型表征提供了基础，对于揭示心脏形态与功能在发育过程中的动态变化至关重要。通过定制的虚拟现实（VR）平台对斑马鱼心脏中的单个细胞进行追踪，量化其运动与相互作用。同时，在心房和心室中比较选定细胞在一个心动周期内的速度及相对距离变化，以评估区域收缩性并研究局部应变（图4）。区域应变的计算基于感兴趣区域内两个相邻心肌细胞之间位移变化的差异。分数...
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讨论
将斑马鱼模型与工程学方法相结合，在心肌梗死、心律失常和先天性心脏缺陷的体内研究中具有巨大潜力。凭借其光学透明性、再生能力以及与人类在遗传和生理上的相似性，斑马鱼胚胎和幼鱼已被广泛应用于科学研究1,2,4。光片成像技术具有优异的时空分辨率、光损伤小以及光学切片能力，使其在斑马鱼幼鱼心脏形态和收缩功能的四维研究中脱颖而出12,26,27,28。本实验方案介绍了一种综合性方法，整合了光片成像、回顾性同步、三维细胞追踪以及交互式虚拟现实（VR）平台，用于定量分析。该方法为捕获和重建心脏收缩、追踪并量化细胞动态，以及评估心脏发育和再生过程中的结构、功能和力学变化提供了入门途径。此外，该方法还...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢波士顿儿童医院的Caroline Burns博士慷慨分享转基因斑马鱼。感谢德克萨斯大学达拉斯分校的Elizabeth Ibanez女士在斑马鱼饲养方面提供的帮助。我们还感谢德克萨斯大学达拉斯分校D-incubator成员提供的所有建设性意见。本研究由美国国立卫生研究院R00HL148493（Y.D.）、R01HL162635（Y.D.）以及德克萨斯大学达拉斯分校STARS项目（Y.D.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 资源 | 来源/参考文献 | 标识符 | |
| 动物模型 | |||
| Tg(myl7:nucGFP) 转基因斑马鱼 | Boston儿童医院Burns实验室 | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| 软件与算法 | |||
| MATLAB | The MathWorks公司 | R2023a | |
| LabVIEW | 美国国家仪器公司 | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | 滨松光子学公司 | 4.6.1.2 | |
| Python | Python软件基金会 | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider等18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen等15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity软件公司 | 2020.3.2f1 | |
| Amira | 赛默飞世尔科技公司 | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov等17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich等16 | 4 | |
| 光片成像系统 | |||
| 柱面透镜 | Thorlabs公司 | ACY254-050-A | |
| 4倍照明物镜 | 尼康公司 | MRH00045 | |
| 20倍检测物镜 | 奥林巴斯公司 | 1-U2M585 | |
| sCMOS相机 | 滨松公司 | C13440-20CU | |
| 电动XYZ平台 | Thorlabs公司 | PT3/M-Z8 | |
| 双轴倾斜平台 | Thorlabs公司 | GN2/M | |
| 旋转步进电机 | Pololu公司 | 1474 | |
| 荧光微珠 | Spherotech公司 | FP-0556-2 | |
| 473 nm DPSS激光器 | Laserglow公司 | R471003GX | |
| 532 nm DPSS激光器 | Laserglow公司 | R531003FX | |
| 显微注射仪与真空泵 | |||
| 显微注射仪 | WPI公司 | PV850 | |
| 真空泵 | Welch公司 | 2522B-01 | |
| 预拉制玻璃毛细管 | WPI公司 | TIP10LT | |
| 凝胶加样用毛细管尖端 | Bio-Rad公司 | 2239912 | |
| 虚拟现实硬件 | |||
| VR头戴显示器 | Meta公司 | Quest 2 | |
| 30 mg/L PTU溶液 | |||
| PTU | Sigma-Aldrich公司 | P7629 | |
| 1× E3工作液 | - | - | |
| 1% 琼脂糖 | - | - | |
| 低熔点琼脂糖 | 赛默飞公司 | 16520050 | |
| 去离子水 | - | - | |
| 10 g/L Tricaine储备液 | |||
| Tricaine | Syndel公司 | SYNC-M-GR-US02 | |
| 去离子水 | - | - | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich公司 | S6014 | |
| 150 mg/L Tricaine工作液 | |||
| 10 g/L Tricaine储备液 | - | - | |
| 去离子水 | - | - | |
| 60× E3储备液 | |||
| 氯化钠 | 德克萨斯大学达拉斯分校实验动物资源中心（LARC） | NaCl | |
| 氯化钾 | - | KCL | |
| 二水合氯化钙 | - | CaCL2 × 2H2O | |
| 七水合硫酸镁 | - | MgSO4 × 7H2O | |
| 反渗透水 | - | - | |
| 1× E3工作液 | |||
| 60× E3储备液 | 德克萨斯大学达拉斯分校实验动物资源中心（LARC） | - | |
| 反渗透水 | - | - | |
| 1% 亚甲蓝（可选） | - | C16H18ClN3S |
参考文献
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