斑马鱼心脏收缩的 4D 光片成像

斑马鱼 （Danio rerio） 是一种广泛使用的模式生物，用于研究心脏发育、生理学和修复，因为它具有光学透明度、遗传可处理性和再生能力 1,2,3,4。心肌梗死后，虽然结构和功能变化会影响心脏射血和血流动力学，但技术限制继续阻碍以高时空分辨率研究心脏再生过程中动态过程的能力。例如，传统的成像方法，如共聚焦显微镜，在成像深度、时间分辨率或光毒性方面存在局限性，无法捕捉多个心动周期期间的动态变化和评估心脏收缩功能⁵。

光片显微镜代表了一种最先进的成像方法，它通过快速扫描激光扫过心脏的心室和心房，获得具有增强的时空分辨率和可忽略不计的光漂白和光毒^性效应的详细图像，从而成功地解决了这些问题6,7,8,9,10,11。

该协议引入了一种全面的成像策略，包括 LSM 系统构建、4D 图像重建、3D 细胞跟踪和交互式分析，以捕获和分析多个心动周期期间整个心脏的心肌细胞动力学¹²。定制的成像系统和计算方法允许人们在转基因 Tg（myl7:nucGFP） 斑马鱼幼虫的单细胞水平上跟踪心肌微观结构和收缩功能。此外，使用显微注射将小分子化合物输送到胚胎中，以评估药物诱导的心脏损伤和随后的再生。这种整体 策略为在 心脏发育和再生过程中在单细胞水平上研究心肌的结构、功能和机械特性提供了一个切入点。

这项研究的批准由德克萨斯大学达拉斯分校的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，协议编号为 #20-07。本研究采用 Tg（myl7:nucGFP） 转基因斑马鱼幼虫¹² 。所有数据采集和图像后处理均使用具有研究或教育许可证的开源软件或平台进行。这些资源可根据作者的合理要求获得。

1. 斑马鱼繁殖和胚胎显微注射

定时:2天

1. 通过标准护理和繁殖程序维护和繁殖成年斑马鱼。详细方法见上一份报告¹³。
2. 按照既定方案¹⁴进行显微注射。在本研究中，显微注射在 1-2 细胞（受精卵）阶段进行。
   注意:准确识别此阶段对于有效的显微注射并确保发育一致性至关重要。在单细胞阶段，卵黄顶部形成一个小圆顶，该阶段通常持续约 12 分钟。在进展到双细胞阶段时，两个相邻的圆顶变得可见，并且该阶段在受精后持续约 45 分钟¹⁵。有关系统构建的更详细信息，请参阅其他报告或协议12,16,17。

2. 斑马鱼胚胎/幼虫的制备和安装

时间:7天

1. 在受精后1天（dpf）将胚胎转移到含有0.2mM 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3水中（参见 材料表）以防止色素形成。
2. 每天用 PTU 的新鲜 E3 水替换培养基，直到 LSM 成像。
3. 用体视显微镜对胚胎或幼虫进行成像，以记录它们在0至7 dpf之间的所需时间点的发育。
4. 准备内径为 2 mm 的分段氟化乙丙烯 （FEP） 管，用于将斑马鱼幼虫嵌入 LSM 系统¹²。
   注意: FEP 管用于使用与周围介质（例如水）非常相似的折射率匹配材料来固定样品。
5. 从 3 dpf 开始，将鱼转移到 150 mg/L 三卡因 （MS-222） 溶液（参见 材料表）中以在成像前固定鱼。
6. 用150mg / L三卡因制备0.8%低熔点琼脂糖，并在冷却至室温¹⁸后使用移液管将麻醉的鱼移至琼脂糖中。
7. 使用另一个转移移液管将装有琼脂糖的鱼安装在FEP管中（图1）。
   注意:为了确定发育中的胚胎中的最小压力，在显微镜观察下对心脏活动（例如心率）进行固定前和固定后检查。这些评估旨在确定三卡因麻醉前后的任何显着差异。固定后还可以对皮肤和肌肉组织进行心脏结构不规则（如水肿）的额外检查。三卡因的浓度在心脏成像中也起着至关重要^的作用19，因此本项目将浓度为150 mg/L的三卡因溶液用于斑马鱼幼虫收缩的成像。虽然目前的回顾性同步使我们能够解决心律不齐^{的问题 20}，但斑马鱼心律失常 4D 成像和长期成像的综合解决方案仍在开发中。

3. 光片成像系统设置和配置

定时:3-14天

1. 使用特定波长（如 473 nm 和 532 nm）的连续波二极管泵浦固态 （DPSS） 激光系统作为照明源，构建基于柱面透镜的内部 LSM 系统（图 2A）。
2. 自定义LabVIEW（参见 材料表）控制代码，用于同步平移样品台、光片照明和sCMOS相机的曝光，以捕获图像序列。
   注:有关系统构建的更多详细信息，请参阅其他报告或协议12,16,17。我们鼓励研究小组在系统构建过程中寻求与在光学成像方面拥有成熟专业知识的实验室合作的机会。

4. 斑马鱼成像准备和数据收集

定时:1天

1. 通过测量荧光微珠来校准 LSM 系统的空间分辨率并最大限度地减少不同深度的不透明度变化。
   1. 首先，使用0.8%低熔点琼脂糖将直径为0.53μm的荧光珠（见 材料表）稀释至浓度为1:1.5×10⁵ ，并将溶液转移到分段的FEP管中。
   2. 其次，使用 LSM 系统对磁珠进行成像并测量整个样品的点扩散函数 （PSF），验证空间分辨率和系统对齐¹²。
      注意:在该系统中，对半最大全宽 （FWHM） 的代表性结果的分析表明，横向和轴向分辨率分别为 1.26 ± 0.15 和 2.48 ± 0.15 μm（n = 60 个珠子）。这表明整个成像深度的空间分辨率一致。
2. 将装有斑马鱼幼虫的 FEP 管牢固地连接到 6 轴（x、y、z、俯仰、偏航和滚动）电动样品台，并将管浸入充满 E3 水的样品室中。为了避免卵黄囊的光散射并更好地定位心脏的位置，旋转斑马鱼幼虫以从腹侧拍摄图像（图2B）。在这种情况下，大多数捕获的图像将包括心室和心房（图2C）。
   注意:鉴于目前的成像程序通常每条鱼持续不到一小时，并且是在受控室温环境中进行的，因此本项目认为腔室温度控制和氧气水平调节是可选的。然而，对于长期的延时成像研究，特别是那些专注于发育过程的研究，建议在样品室内连续监测和调节27°C的温度，以确保斑马鱼的生理环境并防止任何潜在的发育异常。
3. 将电动样品台连接到工作站并配置所有必要的参数，包括所需的移动模式。
4. 在sCMOS相机和工作站之间建立连接。调整所有基本设置，例如 5 毫秒的曝光时间和所需的感兴趣区域。
5. 在定制的LabVIEW控制程序中配置图像序列和帧的数量。
6. 打开激光器电源并启动样品的LSM成像。保持该过程，直到成功记录所有图像序列。
7. 将 300 帧记录为 2D 图像序列，以 200 帧/秒的帧速率覆盖幼虫的 3-5 个心动周期。记录在灯片照亮的选择性平面上捕获心脏收缩力。
8. 将幼虫以 1 μm 的步长移动到光片照明上，以虚拟切片样品。
   注意:采样台的步长应根据光片系统的轴向分辨率设置，遵循奈奎斯特-香农采样定理¹²。
9. 重复步骤 7 记录新样品切片的另一个图像序列，直到覆盖整个心脏。通常，步长为1μm的100-200个图像序列可确保覆盖斑马鱼幼虫的整个心脏（图2D）。
   注:步骤 4.7-4.9 由 LabVIEW 程序控制，并由 LSM 系统自动执行（图 3）。鉴于生成的图像数据量很大，建议对图像序列采用标准化的命名约定。例如，使用"z-1"、"z-2"等名称指定文件夹，以对各种图像序列中的数据进行分类。在每个序列中，图像应按顺序命名（例如，"1"、"2"等），以表示不同的时间点。为一只斑马鱼幼虫安装鱼、调整成像角度和收集所有数据的总时间约为 1 小时。

5. 使用并行计算进行4D图像重建

定时:1天
注:我们小组开发的 4D 重建算法和样本数据可公开访问²¹.这种方法允许人们从前面步骤中收集的图像序列中重建 4D 心脏图像（表 1）。

1. 在 MATLAB 中打开 文件 test_Parallel.m （参见 材料表）。在变量"baseDir"中指定原始图像序列的存储文件夹位置。
2. 为变量"numOfSlice"分配图像序列总数（通常为 100-150），为变量"numOfImage"分配每个序列中的图像数（通常为 300-500）。
3. 检查显示斑马鱼心脏中间平面的图像序列（例如，总共 101 个序列中的第 51^个 序列）。确定此序列中第一个和第四个收缩期的帧号，并将它们分配给变量 systolicPoint_1st 和 systolicPoint_4th。
4. 单击 "运行 "以启动该过程。
   注意:每个图像序列中心动周期的长度将首先由MATLAB程序通过比较不同时间点图像之间的相似性（平方差之和）来识别。随后，将使用所有图像序列的周期长度的平均值来估计心周期。接下来，程序将通过对从第一个图像序列到最后一个图像序列的图像相似度进行迭代比较，对不同轴向位置的图像序列的起点进行对齐。
5. 检查输出文件夹中的结果。该程序会将图像保存为带有时间戳的".tif"文件。每个".tif"文件都是特定时间点的 3D 心脏图像。两个 3D 图像之间的时间间隔等于设置的曝光时间。
   注意:重建从前面步骤中获取的图像以描绘 4D（3D 空间 + 1D 时间）心脏收缩。为了提高回顾性同步期间高吞吐量调查的熟练程度，这种方法通过 MATLAB 并行计算工具箱利用多个 CPU 内核并将图像转换为 gpuArray 格式，从而在 GPU 上实现同步计算操作。

6. 3D细胞分割和细胞追踪

定时:1天

1. 下载 3DeeCellTracker 软件包（参见 材料表）并设置 Python 环境²².
2. 下载 ITK-SNAP 注释软件²³ （参见 材料表），并使用它在两个选定的时间点（一个在心室舒张期，另一个在心室收缩期）手动标记 3D 心脏图像，以创建训练和验证数据集。
   注意:其他标签软件也可能适用。
3. 在 Python 中，运行 3DeeCellTracker 训练程序，并在 TrainingUNet3D 函数中初始化 noise_level（在本例中为 100）、folder_path和模型参数，以设置预定义的 3D U-Net 模型。
4. 在 MATLAB 中，使用 imageDimConverter.m 程序将训练和验证数据集转换并重命名为正确的格式以进行加载。
5. 在 Python 中，使用 trainer.load_dataset（） 和 trainer.draw_dataset（） 函数加载训练和验证数据集。
6. 在 Python 中，运行 3DeeCellTracker 跟踪程序的第一部分并初始化参数。
   注意:这包括定义图像参数以表征图像尺寸，分割参数以选择应用于细胞分割的机器学习模型，以及跟踪参数以选择用于细胞配准的预训练深度神经网络模型。首次使用时，建议使用 U-Net 模型进行细胞分割，并使用 FFN+ PR-GLS 进行细胞配准。需要将数据、模型和结果存储在将在此步骤中自动创建的文件夹中。
7. 在MATLAB中，使用 imageDimConverter.m 程序将所有3D心形图像转换并重命名为正确的格式，并将它们传输到最后一步创建的数据文件夹中。
8. 在 Python 中，运行 3DeeCellTracker 程序的第二部分以开始分割。
9. 分割第一张 3D 图像后，将分割结果与原始图像进行比较，如果发现任何不正确的分割，请执行手动校正。将更正后的分段移动到创建的"/manual_vol1"文件夹。
10. 在 Python 中，运行 3DeeCellTracker 程序的第三部分来分割所有图像。
11. 使用 Amira（参见 材料表）通过将跟踪单元的位置与其相应的原始图像进行比较，对跟踪结果进行可视化评估。如果测试结果不令人满意，请从步骤 6.6 重新开始该程序，使用替代机器学习模型进行分割或细胞配准，然后重新启动跟踪过程。
    注意:分割后，细胞标签的数据默认存储为 8 位图像（0 到 255），这意味着仅提供 256 个尺度作为细胞分类的标签。当需要其他类时，有两种解决方案可以解决此问题。一种解决方案是在跟踪程序中将单元格标签的数据格式设置为16位图像，这将导致处理时间呈指数级增加，在本例中超过两天。另一种解决方案是使用"separateTrackingResults.py"程序对单元格标签进行后处理，这将根据其物理位置将具有相同标签的单元格分开，并为每个单元格分配不同的标签。在这种情况下，此过程大约需要 10 分钟。

7. 虚拟现实模式下的心脏收缩力分析

定时:1天

1. 获取前面步骤的细胞跟踪结果。
2. 手动验证数据，并在所有体积中选择具有一致图像强度的细胞（大约 600 个细胞中的约 500 个细胞）。
3. 使用 cellLabelsToObj.ipynb 脚本²¹ 通过 3D Slicer 软件²⁴ 为每个单独的单元生成曲面网格（参见 材料表），并为每个单元分配唯一的颜色代码。
4. 将每个 3D 模型（由单个时间点中的所有单元格组成）导出为由多个子对象组成的单个.obj文件，并附有一个 .mtl 文件来描述单元格标签。
5. 使用教育许可证将模型导入 Unity，教育许可证是用于扩展现实的开发引擎。
6. 将包含用 C# 编写的函数的自定义脚本应用于模型和用户界面元素，以实现 4D 可视化和交互式分析。按照步骤 7.7 执行 VR 交互。
7. 使用以下功能在虚拟现实 （VR） 中与模型进行交互（图 4）:
   1. 单元格选择:一次最多选择两个单元格，并查看它们的轨迹、速度、体积、表面积和相对距离。
   2. 时间点选择:在数据中选择一个特定的时间点来分析所选细胞的输出，例如舒张期的t = 0 ms，或收缩期的t = 200 ms。
   3. 暂停时间:冻结动态模型以专注于所选单元格及其输出。
   4. 对比度:调制模型中所选像元与周围像元之间的对比度。

目前的方案包括三个主要步骤:斑马鱼制备和显微注射、光片成像和 4D 图像重建，以及细胞跟踪和 VR 交互。允许成年斑马鱼交配，收集受精卵，并根据所提出的实验的需要进行显微注射（图1）。这一步为探索斑马鱼在心脏发育和再生研究中的应用提供了一个切入点，它在随后的成像和分析中也起着至关重要的作用。使用定制的 LSM 系统在不同阶段（从 3 dpf 到 7 dpf）对收缩心脏进行成像，并沿 z 轴对齐图像序列以重建 4D 斑马鱼心脏模型（图 2 和 图 3）。这些模型为深度表型表征提供了基础，对于揭示整个发育时间线的心脏形态和功能动态至关重要。对斑马鱼心脏中的单个细胞进行跟踪，并使用定制的VR平台量化它们的运动和相互作用。还比较了心房和心室中一个心动周期中所选细胞的速度和相对距离变化，以评估区域收缩力并研究局部应变（图4）。区域应变是根据感兴趣区域中两个相邻心肌细胞之间的位移变化确定的。使用已发表文献中描述的方法估计缩短分数 （FS） 和射血分数 （EF）25。FS 和 EF 的公式如下:

其中 Dd 和 Ds 分别是舒张末期和收缩末期的心室直径（短轴，通过不同心室细胞之间的距离测量），Vd 和 Vs 分别是舒张末期和收缩末期的心室容积（通过心室的长轴和短轴直径计算）。

总的来说，这些结果展示了一种整合生理学和工程学的新策略，以促进斑马鱼模型的体积成像和数据解释，为推进心脏形态发生和力学的探索带来了巨大的希望。

图1:斑马鱼卵采集和显微注射过程。 该过程包括与成年斑马鱼交配、收集受精卵和进行可选的显微注射。在显微注射过程中，预拉式玻璃移液器中装有所需的材料。受精卵在琼脂糖霉菌狭缝内直行排列，并垂直于针头放置。显微注射是在对卵和针尖进行恒定显微镜观察的情况下进行的。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:光片成像过程和 4D 图像重建。 （A） 内部光片成像系统结构示意图。CL:柱面透镜。EO:激发物镜。DO:检测目标。TL:镜筒透镜。FL:过滤器。CAM:sCMOS相机。（B） 安装在FEP管中并用琼脂糖包埋的斑马鱼的示意图。（C） 从 4 dpf 斑马鱼幼虫捕获的原始 2D 图像序列。每帧左上角的时钟表示从收缩末期开始的心形阶段。（D） 4D斑马鱼图像配准的回顾性同步图示。图像序列表示沿 z 轴在一定深度处的连续记录。图像序列中的每一帧都由一个红点表示，从舒张末期到收缩期末期的开始和结束阶段在黄色框中突出显示。（E） 根据 2D 图像序列重建的 4D 心脏模型。Dpf:受精后天数。该图改编自Zhang等人12。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:LabVIEW控制面板。 （A） 控制面板中使用的设置包括激光、相机、图像路径和电机模式的配置。（B） LabVIEW 程序捕获的原始斑马鱼心脏图像示例。比例尺:30 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:细胞跟踪和 VR 交互有助于揭示斑马鱼的心脏收缩力。 （A） 3 dpf 下 Tg（myl7:nucGFP） 斑马鱼心脏的跟踪细胞。（B） VR平台为用户提供4D斑马鱼心脏模型的沉浸式观看和互动体验，允许用户通过用户定义的分析可视化心脏功能随时间的变化。（C） 从 VR 平台收集测量值后，比较 3 dpf 和 7 dpf 所选细胞在一个心动周期内的速度和相对距离变化。前两张图显示了五个心室细胞和五个心房细胞的平均速度变化，其他图显示了三组细胞（即两个心室细胞、一个心室细胞和一个心房细胞以及两个心房细胞）之间的相对距离变化。（D） 3 dpf 和 7 dpf 斑马鱼心脏的心脏功能评估。在斑马鱼心脏中以 3 dpf 追踪共有 370 个细胞，以 7 dpf 追踪 580 个细胞。该图改编自Zhang等人12。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:自定义资源表。示例代码和数据上传到 Zenodo21。

作者没有要披露的利益冲突。