本文提供了一种针对出生后、幼年及发育迟缓成年小鼠的球后窦注射方案及配套视频，最大注射总体积可达 150 µL。当尾静脉注射不可行时，该方法特别适用于体重较小的小鼠（15 g）。
本文内容
摘要
摘要
尽管尾静脉注射常用于成年小鼠的全身给药，但眶后注射是一种具有较少限制的替代性全身给药方法。首先，尾静脉注射（TVIs）仅适用于尾静脉尺寸足够大、便于操作的成年小鼠。当研究的小鼠模型无法存活至成年阶段时，这一限制会带来显著问题。其次，对于表现出生长迟缓表型、无法达到正常成年野生型小鼠体型的小鼠模型，尾静脉注射也不可行。因此，眶后注射可成功用于幼龄小鼠及体型较小的成年小鼠的给药。最后，眶后注射在麻醉状态下进行，相比通常在无麻醉条件下实施的尾静脉注射，对小鼠造成的应激更小。本文提供了一套可用于小体型及幼龄小鼠全身给药的眶后注射操作方案与详细步骤说明。
引言
遗传性疾病的小鼠模型常被用于验证小分子、基因和细胞治疗策略的有效性1。在小鼠中，最常用的模拟人体系统性给药的方法是尾静脉注射（TVI），通常在约6至8周龄的成年小鼠中进行，以确保静脉足够粗大便于操作。尾静脉注射已成功应用于多种遗传性疾病的临床前概念验证研究中，例如血友病，这些研究为基因治疗的临床试验提供了支持2。然而，许多遗传性疾病小鼠模型存在生长障碍和/或早期致死表型，导致其无法达到成年小鼠的年龄或体型（图1）。对于这类小鼠，尾静脉注射治疗可能极为困难，甚至无法实施，具体取决于其致死年龄和/或动物所能达到的最大体型。
相比之下，通过眶后窦注射（常被错误地称为眶后注射）进行治疗剂的全身递送，在小鼠中可相当容易地实施，且不受年龄或体型的限制3。在年轻的生长迟缓遗传病小鼠模型（如甲基丙二酸血症（MMA）和尼曼-匹克C型病）中，已成功使用腺相关病毒（AAV）进行眶后注射4,5,6,7,8。（该操作也可用于新生小鼠的注射3,4,9,10；但本方案及配套视频中未详细描述此技术。）即使是像阿霉素（doxorubicin）这样高毒性的物质，也可通过眶后注射安全递送11,12。与尾静脉注射（TVI）不同，眶后窦注射过程中小鼠处于麻醉状态，这使得操作对小鼠的应激更小，操作者也无需手动固定小鼠，操作更为简便13,14。另一个需要关注的问题是，TVI通常使用加热灯来扩张尾静脉，这可能导致幼鼠脱水，对于那些对热应激更敏感的遗传病小鼠模型而言可能带来问题。此外，使用TVI时还可能出现的一个问题是，在色素较深的小鼠中，尾静脉往往特别难以观察。然而，与TVI类似，眶后窦注射也能实现广泛的全身生物分布15,16。
方案
本方案及配套视频介绍了通过眶后窦注射法对出生后、幼年及发育迟缓的成年小鼠进行眶后注射的技术；该方案已获得国家人类基因组研究所机构动物照护与使用委员会（ACUC）的批准，批准编号为 G-03-4。其他机构可能有不同的要求和限制，本方案可能需要根据您所在机构的规定进行修改方可获得批准。在开展本实验或任何其他动物实验之前，请务必先获得所在机构 ACUC 的批准。
1. 注射前准备
- 将AAV用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）在无菌的1.5 mL微量离心管中稀释至每针所需的注射体积和浓度。每针额外增加50%的体积，以确保能够准确填充一次性无菌注射器。
注意：此处我们将AAV8-CAG-eGFP报告基因病毒稀释至每千克体重注射1 × 1013病毒基因组（vg/kg），注射体积为50 μL。注射用50 μL体积中的AAV用量根据动物注射时的体重计算。本视频中通过眶后注射途径给药，以模拟在人体中的全身性递送。其他基因治疗载体（如慢病毒、腺病毒）、RNA疗法以及小分子药物也可通过此方法进行全身递送。 - 确保台式实验动物麻醉系统（LAAS）已按照制造商说明正确安装并正常运行。
注意：若使用其他麻醉方法，应在开始注射前准备好麻醉剂。眶后注射操作适用于大多数麻醉方式（例如，使用氯胺酮和赛拉嗪等可注射化学限制剂）。 - 在填充一次性无菌注射器（此处为胰岛素注射器，31 G，长8 mm，容量3/10 mL）之前，先将活塞上下推动数次，以确保活塞可顺畅下压。然后将注射器填充至所需体积，并确保无气泡存在。
注意：可注射体积最高达150 µL；本实验室通常注射50 µL体积。
2. 通过实验室动物麻醉系统（LAAS）吸入异氟烷气体对小鼠进行镇静
- 确保气体仅流向诱导室。关闭通向非重复呼吸（NRB）回路的二通旋塞。
- 打开流量计前方的绿色氧气流量旋钮，使氧气流速为 1 L/min。
- 按下挥发罐顶部的杠杆并旋转旋钮，将异氟烷浓度调至 ≤4%。
- 将小鼠放入透明诱导室中。密切观察动物的呼吸和活动情况。当动物呈侧卧状态时，将挥发罐旋钮调低至异氟烷浓度为 2–2.5%。
- 打开通向与面罩相连的 NRB 回路的二通旋塞，同时关闭流向诱导箱的气体。
- 取出动物，并将其置于 NRB 回路的面罩中。
- 根据动物对刺激（如脚趾夹捏或足垫挤压）的反应，将异氟烷浓度下调至 1.5%–1.75%。
- 在整个过程中应持续监测小鼠的呼吸频率及黏膜颜色（如条件允许）。若动物出现呼吸费力或黏膜颜色非粉红色，应降低麻醉剂浓度。
- 在整个操作过程中保持动物体温。可在吸水垫下方放置用纸巾包裹的暖手袋，使其直接位于小鼠下方。
- 操作结束后关闭氧气和挥发罐。
3. 动物注射
- 若为右利手，则注射小鼠的右眼，并将小鼠置于左侧卧位，使其吻部朝向右手方向。若为左利手，则注射小鼠的左眼，并将小鼠置于右侧卧位，使其吻部朝向左手方向。
- 向待注射的眼球滴加一至两滴眼科用麻醉剂，然后用无菌吸收性纱布垫吸除多余的眼科麻醉液。用指尖对眼球背侧和腹侧的皮肤施加轻柔压力，使小鼠眼球部分从眼窝中突出（图 2A、B）。
注意：突出眼球时需小心，避免对周围颈血管施加过大压力，否则会阻碍血流并影响注射。此外，压迫气管可能导致小鼠呼吸受阻。确保整个操作过程中小鼠能够正常呼吸。 - 将针头保持斜面向下的方向，以约30°角插入内眦（图 2C）。
注意：针头插入的深度需根据动物体型而定，以达到眶后窦为目标。注射时保持针头斜面向下可降低眼部损伤的风险。注意不要插入过深，以免刺穿眼窝。注射过程应耗时少于一分钟。 - 缓慢而平稳地推动注射器推杆，以注入药液，从而减少外渗的可能性。
- 缓慢而平稳地拔出针头。
- 从小鼠面部移除面罩，使其从麻醉状态中恢复。
4. 注射后处理
- 操作完成后关闭氧气和蒸发器。
- 若存在残余出血，使用无菌纱布清除血液。
- 确保小鼠处于温暖环境（约 37 °C），但不可过热，以防止麻醉恢复期间发生低体温。
- 将小鼠单独观察直至完全恢复意识，然后再将其放回笼具和鼠架中。
注意：在恢复期间将小鼠隔离可防止同笼小鼠对处于镇静状态的小鼠造成伤害。
结果
球后窦注射已成功用于系统性递送小分子、抗体以及腺相关病毒（AAV）4,5,9,15,16。图3展示了经PBS（溶剂）处理的小鼠与经AAV8处理的小鼠肝脏，用以示例球后注射后AAV的递送与表达情况。AAV8与许多天然存在的AAV载体一样，具有嗜肝性。因此，在接受5 × 1012vg/kg系统剂量的小鼠中，预期会出现显著的肝脏转导17。图3中可见大量肝细胞表达甲基丙二酰辅酶A变位酶（MMUT）RNA，该RNA由AAV转基因表达，表明球后注射成功。
图1：患有丙酸血症的生长迟缓小鼠。 这是遗传性疾病小鼠模型中可能出现的严重生长迟缓的一个示例。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：眶后窦注射的图像与示意图。（A）手指按压毛皮使眼球突出的位置示意图（白色箭头所示）。（B）进针前向下按压毛皮使眼球突出的图像（白色箭头所示）。（C）针尖斜面方向（针尖斜面向下朝向眼球）、进针角度（30°）及眶后窦针头位置的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：经眶后窦注射AAV8后的RNA原位杂交。 分别为（A）10倍放大倍数下的对照溶剂处理肝脏、（B）10倍放大倍数下的AAV8处理肝脏、（C）20倍放大倍数下的对照溶剂处理肝脏，以及（D）20倍放大倍数下的AAV8处理肝脏的MMUT RNA染色图像。患有甲基丙二酸血症的小鼠在1月龄时接受5 × 1012 vg/kg剂量的AAV8-LPS-MMUT或对照溶剂（PBS）治疗。肝脏组织于治疗后1个月采集。MMUT RNA呈棕色染色（黑色箭头指示阳性染色区域）。肝脏组织用苏木精复染。比例尺 = 10倍图像为100 µm，20倍图像为50 µm（B）。缩写：AAV = 腺相关病毒；LPS = 肝脏特异性启动子；MMUT = 甲基丙二酰辅酶A变位酶。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
尽管球后注射是一种递送小分子、蛋白质和基因治疗药物的可靠方法，但在使用染料进行操作练习是必要的，以确保实现可靠且可重复的全身递送效果。在小鼠实验中正式采用该给药途径之前，强烈建议先使用染料练习球后注射技术。通过观察小鼠组织中的染料分布，可直观评估全身递送的一致性。
在我们演示球后注射技术的过程中，使用异氟烷气体在操作前对小鼠进行麻醉。操作前也可采用其他形式的麻醉，但重要的是要确保小鼠在注射完成前不会从镇静状态中恢复。幸运的是，实际注射过程通常不到一分钟，小鼠需要完全麻醉的时间很短。注射过程中小鼠应完全处于镇静状态，若在注射前小鼠恢复意识，应重新给予麻醉。由于使用麻醉存在一定风险，应尽量缩短小鼠被镇静的时间。我们在使用异氟烷镇静患有甲基丙二酸血症和丙酸血症的小型病鼠时未遇到问题。然而，某些小鼠模型可能对镇静或特定麻醉剂更为敏感。在研究中尝试使用镇静前，应充分考虑这一潜在问题。最后，与经尾静脉注射（TVI）中通常不使用镇静的情况相比，镇静结合球后注射可显著减少小鼠在注射过程中表现出的明显痛苦。
我们尚未观察到任何与注射相关的不良反应，尽管任何注射操作均存在潜在的感染风险。为降低感染可能性，我们采用无菌的一次性注射器以及无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）来稀释纯化的腺相关病毒（AAV）。我们动物设施中的所有小鼠均每天接受潜在健康问题的检查，并在需要时接受兽医护理以处理任何健康问题。
与球后窦注射相对，更广泛用于幼年和成年小鼠的全身给药方法是尾静脉注射（TVI）。对于小分子和抗体而言，TVI与球后窦注射具有相似的生物分布，据此推断，病毒载体也应表现出类似情况15,16。然而，在现有文献中尚未发现比较TVI与球后窦注射在基因治疗载体全身递送中效果的实例。我们认为，对于生长迟缓表型和/或早期致死性的小鼠，球后窦注射操作更为简便。
TVI 通常被认为在某种程度上更类似于人类的全身给药，尽管人类具有眶后窦，但没有尾巴。从某一方面来看，眶后窦注射类似于人类的全身给药，因为注射物进入上静脉系统，这与通过外周插入的中心静脉导管（PICC 导管）或手臂静脉导管向人体给药时的情况相同。相反，尾静脉注射后，注射物进入小鼠的下静脉系统。遗憾的是，这两种方法均无法完全复制人类全身给药所采用的方法，但二者均为在小鼠中实现全身给药的有效方法。
披露
作者无任何与本出版物相关的内容需要披露。
致谢
我们感谢美国国家人类基因组研究所（NHGRI）小鼠设施工作人员、美国国家癌症研究所（NCI）分子病理学实验室，特别是Andrew Warner提供的帮助。R.J.C.的研究由NHGRI院内研究计划（项目编号：1ZIAHG200318-16）资助，本工作部分由国家转化科学促进中心（NCATS）提供资金支持。图2C使用BioRender软件绘制。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AAV8-CAG-eGFP | 宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室 | 特殊订购 | 可提供其他来源的AAV报告基因载体及替代型AAV报告基因 |
| 屏障式（滤芯）吸头，20 μL规格 | 赛默飞世尔科技 | AM12645 | 用于将AAV稀释至所需注射体积和浓度 |
| 屏障式（滤芯）吸头，100 μL规格（无菌） | 赛默飞世尔科技 | AM12648 | 用于将AAV稀释至所需注射体积和浓度 |
| 双通道麻醉系统 | VetEquip | 921400 | 可采用其他麻醉方法 |
| Gilson PIPETTEMAN Classic P20移液器 | Gilson | F123600 | 用于将AAV稀释至所需注射体积和浓度 |
| Gilson PIPETTEMAN Classic P100移液器 | Gilson | F123615 | 用于将AAV稀释至所需注射体积和浓度 |
| 暖手贴（HOTHANDS） | ULINE | S-1497B | 用于在麻醉期间保持小鼠体温 |
| 胰岛素注射器，31 G， 针长8 mm，容量3/10 mL | 贝克顿·迪金森公司 | 328438 | 视频中使用；每次注射使用一支新注射器 |
| 异氟烷（Fluriso） | VETONE | 502017 | 可使用其他麻醉剂替代 |
| Medline Protection Plus 一次性防护垫 | 赛默飞世尔科技 | 23-666-062 | 用于注射过程中放置小鼠 |
| 带透明盖的橡树岭采血用锐器盒 | 赛默飞世尔科技 | 22-730-434 | 用于针头废弃处理 |
| 磷酸盐缓冲液 PBS，pH 7.4 | Gibco | 10010023 | 用于将AAV稀释至所需浓度和体积 |
| 带盖低吸附微量离心管（无菌） | 赛默飞世尔科技 | 3451 | 用于将AAV稀释至所需注射体积和浓度 |
| 无菌纱布垫，4"×"4 | Covidien | 3033 | |
| 盐酸丁卡因眼用溶液（0.5%） | Oceanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | 局部 麻醉剂 |
| 结核菌素注射器，配27.0 G（或更小）针头 | 任意品牌 | N/A | 可作为视频中所用胰岛素注射器的替代品 |
| VetEquip台式及移动式实验动物麻醉系统用户指南与操作手册’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | 用户指南与操作手册链接 |
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