本方案描述了从冷冻的非人灵长类动物胰岛中分离高质量细胞核的步骤，可用于进行单细胞核同时RNA测序和ATAC测序，同时保留同一标本中的大部分胞质组分，以用于代谢组学分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在利用来自多个队列的组织样本开展研究时，一个挑战是在准备大规模多组学实验（如联合单细胞RNA测序与代谢组学）时避免批次效应。本研究采用的方法利用了在两年时间内收集的胎儿非人灵长类动物胰岛组织，这些组织经速冻保存，用于单核RNA测序和ATAC测序实验。在细胞核提取过程中产生的胞质组分被保留下来，用于后续的毛细管电泳-质谱分析及代谢物定量。该方法可对在不同实验条件下影响转录组和表观基因组动态变化的代谢物进行整体分析，适用于多种组织类型，并最大限度地提高了从难以获取的样本中可提取的信息量。鉴于代谢在细胞身份建立过程中的重要作用 通过 表观遗传修饰的重要性日益受到重视，因此能够识别特定细胞类型中代谢物作用的技术显得及时且必要。
引言
胰腺朗格汉斯岛在生命全周期的葡萄糖耐量调控中至关重要。无法恰当地调节血糖水平 通过 降糖激素胰岛素或升糖激素胰高血糖素的异常导致糖尿病1可改变的糖尿病风险因素包括运动和饮食。此外，越来越多的证据表明，母亲在妊娠期间的饮食也会影响子代成年后患糖尿病的易感性。2,3因此，需要建立相应方法来分析母体饮食及其他孕期暴露因素（如妊娠期间使用的药物）对发育过程中模式生物胰岛素生成β细胞的影响。例如，可利用胎儿期非人灵长类动物（NHP）子代的胰岛评估发育暴露的影响。与人类相似，NHP通常为单胎分娩，且对西方饮食喂养的生理反应存在个体差异。4尽管非人灵长类动物（NHP）的妊娠过程和胎儿发育与人类有许多相似之处，使其成为代谢编程研究中高度相关的物种，但在NHP子代中开展比较性生物信息学分析仍面临交配季节受限和样本采集间断等挑战。因此，在样本处理与分析前能够实现长期保存的方法尤为理想。本方案描述了用于单核RNA测序、ATAC测序和整体细胞质代谢组学分析的样本制备流程。
其他研究者在胰岛生物学领域的研究表明，在所制备样本中观察到的基因表达特征存在重叠 通过 单细胞RNA测序和单细胞核RNA测序5....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
胰岛获取操作严格遵循俄勒冈国家灵长类研究中心（ONPRC）和俄勒冈健康与科学大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指导方针，并已获得ONPRC IACUC的批准。ONPRC遵守美国农业部（USDA）执行的《动物福利法》及其相关法规，以及公共卫生服务关于实验动物人道照护与使用的政策。本方案适用于妊娠第145天处死的恒河猴胎儿的胰岛（恒河猴妊娠期通常为173至175天）。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 胰岛分离
- 从周围组织中分离胎儿胰腺9 并将其置于冰冻的磷酸盐缓冲液中。
- 从 PBS 中取出胰腺，并用胶原酶 P（0.6 mg/mL）进行膨胀灌注 通过 使用33G啮齿类动物脑部套管注射器对胰管进行插管。
- 用无菌手术剪将胰腺分为六个部分，在37 °C下用胶原酶溶液消化27-30分钟。
- 将10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素加入RPMI 1640中，配制RT培养基。
- 倒出胶原酶，加入10 mL室温培养基。
- 轻轻振荡1分钟，以破坏残留的结缔组织。
- 通过500 µm滤网过滤，去除未消化的物质。
- 用50 mL室温培养基将胰岛洗涤两次。
- 将胰岛....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
测序结果的质量在很大程度上取决于细胞核输入样本的质量。细胞核出泡以及核外膜的损伤会导致环境RNA和DNA污染，从而在分析中引入数据噪声。理想的细胞核提取物应极少出现细胞核被细胞质成分包裹（图2A）或过度消化（表现为细胞核破裂，图2B）的现象。理想的细胞核输入样本应包含完整形态的细胞核（图2C）。
单核RNA测序和ATAC测序数据分析的详细方法已在其他文献中充分描述5,14胎儿非人灵长类动物细胞核悬液制备中的代表性细胞群体簇 通过 UMAP在 图3A代谢组学数据可使用开源软件进行分析，方法如前所述。15生成的谱图可进行可视化分析，并可比较来自食用西式饮食母鼠的胎儿胰岛.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
传统上，用于单核RNA测序和ATAC测序的细胞核分离方法依赖于含有去垢剂的缓冲液，而这些去垢剂与液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）不兼容；LC-MS是代谢物定量分析中常用的技术16,17。本实验方案通过采用温和的去垢剂进行细胞组分分离，并在组分分离后结合毛细管电泳技术，实现了在同一份样品制备基础上联合开展转录组学与代谢组学分析。毛细管电泳技术相较于液相色谱所需样品量更少，适用于代谢物的分离18。
本方案最关键的步骤是在细胞核分离过程中保护核膜的完整性，以避免遗传物质降解，并减少来自周围环境的核苷酸和大分子的污染。可通过调整样品在裂解缓冲液中的暴露时间，以避免组织过度消化和细胞核损伤。此外，在样本保存过程中，必须迅速冷冻胰岛以及含有胞质组分的上清液，以防止遗传物质和代谢物的降解。所有样品必须来自相同的培养基配方（本研究中为2.8 mM葡萄糖DMEM），以避免因培养基中营养物质的差异而对代谢状态产生干扰效应。
<.......访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨向俄勒冈健康与科学大学的整个团队致以诚挚感谢，感谢他们对非人灵长类动物种群的悉心管理以及组织样本的获取。此外，范德堡先进基因组学技术中心提供了技术支持和实验设计方面的建议。DTC 获得了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDK）F31 博士前奖学金资助（1F31DK135164）。PK 获得了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK）的资助（1R01DK128187）。MG 获得了美国退伍军人事务部杰出研究奖（VA Merit award，I01 BX005399）、美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK，1R01DK135032，1R01DK128187）以及青少年糖尿病研究基金会（JDRF，2-SRA-2024-1455-S-B）的资助。俄勒冈国家灵长类研究中心（ONPRC）的工作获得了 P51OD011092 项目的支持，用于研究中心的日常运行。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 33G 大鼠脑部套管注射器 | Protech International | 8IC315IS5SPC | 用于导管插管和胰腺充盈 |
| 青霉素/链霉素 | Fisher | 15-140-122 | 用于RT培养基 |
| FBS | Millipore/Sigma | F4135-500ML | 用于RT培养基 |
| RPMI 1640 | 赛默飞世尔科技 | 11-875-135 | 用于RT培养基 |
| 胶原酶P | Sigma Aldrich | 11213865001 | 胰腺消化 |
| 牛DNase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | 用于RT培养基和分离 |
| 葡萄糖 | Fisher | D16-1 | 终浓度为 2.8 mM |
| 氯化钙 | Fisher | C4901-500G | 终浓度为 0.5 mM |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 终浓度为 10 mM |
| 牛血清白蛋白（BSA）第5组分 | 研究产品国际公司 | A30075100 | 终浓度为 0.5 mg/mL |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | 11966025 | 用于手挑胰岛 |
| 20x 细胞核缓冲液 | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Digitonin（5%） | 赛默飞世尔科技 | BN2006 | Digitonin 可能需要加热至 65 °C 以溶解白色沉淀 |
| MACS SmartStrainer（30 µM | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA 储存液（10%） | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | 使用 MilliQ 水配制 10% 的储存液 |
| Trizma 盐酸盐溶液，pH 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| 5 M 氯化钠溶液 | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| 1 M 氯化镁溶液 | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
| Sigma Protector RNase抑制剂 | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
| DTT | 研究产品国际公司 | D11000-5.0 | |
| 无RNase一次性研磨杵 | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | 使用 MilliQ 水配制 20% 的储存液 |
| 无核酸酶水 | Promega | PR-P1193 | |
| DNA LoBind 离心管（5 mL） | Eppendorf | 30108310 | |
| 冻存管（1.5 mL） | VWR | 20170-225 | |
| Posi-Click 管（0.6 mL） | 丹维尔 | C-2177 | |
| 台盼蓝（0.4%） | 赛默飞世尔科技 | T-10282 | |
| 双室细胞计数板 | 伯乐（Bio-Rad） | 1450011 | |
| MiiliQ超纯水系统 | 默克/西格玛 | 7003/05/10/15 | |
| 5 kDa 截留分子量滤膜 | HMT 代谢组学技术 | ||
| 内标物 | HMT 代谢组学技术 | ||
| P10、P20、P200 和 P1000 移液器 | Eppendorf | 2231000602 | |
| 移液器吸头，10 µL | VWR | 76322-528 | |
| 移液器吸头，1000 µL | 赛默飞世尔科技 | 21-236-2A | |
| 移液器吸头，20 µL | Genesee Scientific | 23-404 | |
| 移液器吸头，200 µL | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 相差显微镜 | 奥林巴斯 | BX41-PH-B | |
| Countess II 自动细胞计数仪 | 赛默飞世尔科技 | AMQAX1000 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Allegra X-30R 离心机 | 贝克曼库尔特 | B06315 | |
| RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
参考文献
- Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
- Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
- Salzberg, L.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
