利用高容量吸附萃取探针和气相色谱-质谱法对水和鱼类中的土臭素与2-甲基异茨醇进行提取与检测

摘要

本方案介绍了一种完全自动化的流程，用于从水体和富含脂质的鱼类组织中提取土臭素和2-甲基异茨醇。该方法可在这些化合物达到气味阈值之前实现早期检测。文中提供了来自水产养殖环境的代表性数据。

摘要

土臭素和2-甲基异茨醇是微生物来源的挥发性有机化合物，常出现在循环水养殖系统中，即使在极低浓度下也会使鱼类产生令人不悦的气味和风味。目前针对鱼类中这些化合物的分析方法往往难以实现足够的样品通量，且通常无法自动化，需要大量人工前处理操作。我们已开发出分别用于水样和鱼类组织中土臭素和2-甲基异茨醇分析的方法，该方法采用一种带有高容量吸附萃取相的金属探针。通过对水样和鱼类组织的检测，实现了稳定且定量的分析结果，水中土臭素和2-甲基异茨醇的最低检测限分别为1.2 ng/L和1.1 ng/L，鱼类组织中的最低检测限分别为18.1 ng/kg和13.6 ng/kg。这些浓度远低于人类感官的感知阈值。因此，我们得出结论：该方法可在土臭素和2-甲基异茨醇尚未被人察觉之前即实现有效检出。与其他高容量吸附萃取技术（如搅拌棒吸附萃取）相比，该技术可完全自动化，显著提高通量并避免人工操作误差；同时，探针的耐用设计避免了诸如固相微萃取（SPME）纤维常见的断裂问题。该方法适用于各类水质环境中的气味物质监测，也适用于固体和半固体基质中异味化合物的检测。

引言

土臭素（GSM）和2-甲基异莰醇（MIB）是微生物代谢的天然副产物，常见于水体和土壤中^1,2。尽管它们通常对环境和人类健康无害，但会赋予水体令人不悦的“土味”和“泥腥味”，即使在极低浓度下也能被察觉，GSM 和 MIB 的嗅觉阈值分别可低至 10 和 20 ng/L^3,4。因此，这些致嗅物质的存在会降低水体的感官品质，在大多数情况下均为不受欢迎的现象。在内陆水道中，致嗅物质会降低对游客的吸引力，并可能引发公众向环境监管部门投诉⁵；而在饮用水中，这些物质会导致消费者无法接受的异味和异嗅⁶。事实上，许多国家已对饮用水中致嗅物质的含量设定了监管限值，其中中国规定GSM的最高允许浓度为10 ng/L⁷。

循环水养殖系统（RAS）作为鱼类生产的一种手段，在水产养殖业中正变得越来越重要。这些系统在陆地上运行，并持续重复利用水，从而减少对环境的影响，但需要对RAS水进行广泛的过滤，以维持鱼类养殖的最佳条件。由于鱼类粪便和未食用饲料中富含营养物质，移动床生物滤池会逐渐被微生物定殖⁸。这些微生物有助于去除含氮废物和过剩营养物质；然而，某些物种可能产生土臭素（GSM）、2-甲基异莰醇（MIB）及其他致味物质⁴。这些致味物质随后渗入水中，并被鱼类组织吸收，导致鱼肉产生令人不悦的气味和风味，消费者通常难以接受。鱼肉中致味物质的嗅觉阈值因物种而异，以RAS中常见的大西洋鲑为例，其GSM的阈值为44–500 ng/kg，MIB的阈值为>900 ng/kg⁴。因此，RAS运营者应定期监测系统中GSM和MIB的浓度，确保其不达到有害水平⁴。受污染的鱼类可在收获前通过净化处理去除异味化合物，以恢复鱼片品质；然而，该过程成本较高，需停止水的循环，并连续引入新水冲洗系统10至14天⁹。鉴于GSM和MIB在多个行业中长期存在并造成显著经济损失，重新评估和改进其检测分析方法具有重要意义。理想情况下，RAS运营者应能够同时监测RAS水体，以在GSM和MIB浓度升高至有害水平前及时发现，以及检测鱼类组织，以评估GSM和MIB对产品品质的影响程度。

目前检测GSM和MIB的大多数方法均采用气相色谱法（GC），并结合质谱仪（MS）或火焰离子化检测器（FID）进行分离与检测。然而，气味物质最初从水相基质中的提取方式差异较大，已有多种方法被报道¹⁰。如此多样的方法被尝试并仍在常规使用，恰恰说明每种方法均存在显著缺陷。这些缺陷包括：液液萃取（LLE）需要较大的样品量和大量溶剂；基于顶空的方法灵敏度低且受水的干扰；吹扫捕集（P和T）则存在严重的交叉污染和系统污染问题。

吸附萃取涵盖一系列萃取技术，其中可通过固相吸附材料从样品上方的顶空或通过直接浸入样品本身来萃取气味物质¹⁰。这些技术适用于比其他方法更小的样品体积，无需使用溶剂，且通常不易受到水干扰的严重影响。然而，吸附萃取最常见的形式——固相微萃取（SPME）——仅使用少量吸附相，对分析物的富集容量较低，从而限制了萃取效率。此外，所用的脆性纤维容易损坏或断裂¹¹，导致实验流程中断。搅拌棒吸附萃取（SBSE）通过更大的吸附相体积和更耐用的设计克服了这些问题，但其难以实现自动化，需要手动将搅拌棒放入样品以及从样品转移至热脱附管¹²。在需要高通量的常规水质筛查中，缺乏自动化是一个显著障碍。

本方法的目标是改进上述方法在样品通量和整体吸附萃取能力方面的不足。因此，我们开发了一种采用高容量吸附萃取（HCSE）探针的技术，该技术结合了搅拌棒吸附萃取（SBSE）的高分析物载样量和高稳定性，以及固相微萃取（SPME）的固定相选择性和自动化优势，用于土臭素（GSM）和2-甲基异莰醇（MIB）的定量、高通量分析。经过适当修改后，该技术既可用于水样，也可用于均质化鱼组织样品。本文详细描述了该实验方案，并提供了验证数据，证明该方法具有良好的重现性、线性关系和高灵敏度。尽管本文以水产养殖样品为例进行演示，但该方案适用于多种样品类型中异味物质的监测，包括水体、土壤及各类食品。由于实现了全流程自动化，该方案在样品数量较多时尤为适用。

方案

鱼类样本取自已为人类食用而宰杀的动物，因此无需伦理审批。

1. 校准标准品和内标物的制备

1. 校准标准品的制备
   1. 通过将10 µL土臭素（geosmin）和2-甲基异茨酮（2-methylisoborneol）溶液（100 µg/mL）加入100 mL容量瓶中，并用LC-MS级甲醇定容，配制储备液C1。所得溶液中每种分析物浓度均为10 µg/L（ppb）。
   2. 根据表1中所示体积，将C1储备液加入100 mL容量瓶中，并用去离子水定容，以制备校准标准品。
   3. 每天新鲜配制校准标准品，因为这些溶液极不稳定。
      注意：每天必须新鲜配制这些储备液。
2. 内标物的制备
   1. 将10 mg 的2-异丙基-3-甲氧基吡嗪（IPMP）（>98%纯度）加入1 L容量瓶中，并用LC-MS级甲醇定容，配制浓度为10 mg/L的储备液（I1）。
   2. 用移液器吸取100 µL I1溶液至100 mL容量瓶中，用去离子水定容，得到溶液I2（10 µg/L）。向每个样品小瓶中加入50 µL，使最终浓度为100 ng/L。

2. 水质分析

1. 样品制备
   1. 为待分析的每个水样在样品盘中放置一个 20 mL 样品瓶。
   2. 使用校准过的天平称取 2.5 g NaCl，并将其加入每个 20 mL 压盖样品瓶中。
      注意：添加盐可促进土臭素（MIB）和二甲基萘烷醇（geosmin）从水相向顶空的转移。
   3. 使用移液器或瓶口分液器，向每个 20 mL 压盖样品瓶中加入 5 mL 待测水样。
   4. 向每个样品、校准标准品以及所有质量保证/质量控制（QA/QC）样品（包括空白样）中加入 50 µL 内标溶液 I2。
   5. 将瓶盖盖在瓶口上，并使用压盖工具密封，以尽量减少分析物的损失。
   6. 每次仅处理 1–2 个样品，密封完成后应迅速压盖，以尽量减少挥发性分析物的损失。
2. 分析物提取（水样）
   1. 将样品盘放置在自动进样器的样品盘支架上。
   2. 在仪器程序中打开方法编辑器，以建立仪器方法。
      1. 在方法编辑器中输入以下参数（其余参数保持默认值），创建新方法：
      2. 在“预进样”步骤中，将样品瓶振荡时间设为 10 min，以使分析物从水相充分分配至顶空。
      3. 在“进样”步骤中，将孵育温度设为 65 °C，孵育时间设为 30 min，振荡速度设为 400 rpm。
      4. 确保“HiSorb 探针清洗”功能已启用，否则残留的样品基质可能污染系统。
      5. 在“探针脱附”步骤中，将脱附时间设为 15 min，脱附温度设为 270 °C。
      6. 在捕集阱设置中，将捕集阱低温设为 25 °C，分流流速设为 8 mL/min。
   3. 分别点击相应程序中的启动按钮，运行自动进样器方法与气相色谱-质谱（GC-MS）方法。

3. 鱼类组织分析

1. 样品制备
   1. 为每份待分析的鱼类样品在样品盘中放置一个20 mL小瓶。
   2. 使用市售食品加工机匀浆鱼组织。
   3. 使用校准的天平，将1.00 g均质化的鱼组织称量至每个小瓶中。
   4. 用移液器将5 mL饱和NaCl溶液加入每个小瓶中。
   5. 向每个样品、校准样品以及任何质量保证/质量控制（QA/QC）样品中加入100 µL内标溶液I2。
   6. 将瓶盖盖在小瓶顶部，并使用小瓶压盖工具密封。
   7. 每次仅制备1-2个样品，以减少半挥发性和挥发性化合物的损失。
2. 分析物提取（鱼类）
   1. 将样品盘放置在自动进样器的样品盘架上。
   2. 按如下步骤准备仪器方法（其余参数保持默认值）。 
      注意：采样前小瓶振荡时间及孵育温度与第2.2.2节不同。
      1. 在“采样前”阶段，设置 小瓶振荡 时间到 20 最小
      2. 在“采样”中，设置 孵育温度 至 80 °C， 孵育时间 30 分钟，以及 搅拌速度 至 400 转/分钟。
      3. 确保启用“清洗 HiSorb 探针”功能，否则残留的样品基质可能污染系统。
      4. 在“探针脱附”中，设置 解吸时间 至15分钟和 解吸温度 至 270 °C。
      5. 在陷阱设置中，设置 低温捕集 至 25 °C 并 分流 至 8 mL/min。
         注意：由于MIB和GSM与富含脂质的鱼类组织具有更高的亲和力，此处需要更长且温度更高的采样前处理步骤 与 水
   3. 运行自动进样器方法，同时按下与气相色谱-质谱法联用的按钮 开始 每个相应程序上的按钮。

4. 使用气相色谱-质谱法进行分离与检测

1. 对水样和鱼组织样品的分析采用相同的气相色谱-质谱（GC-MS）参数。
2. 确保气相色谱仪配备一根5MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm），并使用高纯氦气作为载气。载气流速设定为2 mL/min。
3. 设置气相色谱炉程序如下：初始温度60 °C，保持3 min，随后以10 °C/min的升温速率升至100 °C，再以20 °C/min升至190 °C，最后以30 °C/min升至280 °C，最终保持2 min。总运行时间为16.5 min。
4. 将气相色谱仪与质谱仪之间的传输线温度设为280 °C，离子源和四极杆温度分别设为250 °C和200 °C。
5. 质谱检测采用全扫描模式时，扫描范围设为m/z 50–350。
6. 在选择离子监测（SIM）模式下，土臭素（MIB）的定量离子和确认离子分别为m/z 95和107，异丙基甲氧基吡嗪（IPMP）为m/z 137和152，二甲基三硫（GSM）为m/z 112和55。
   注意：许多色谱软件具备自动峰识别功能，但强烈建议手动检查峰识别结果以避免错误。

结果

方法优化

已开展多项实验以优化该方法，包括残留效应评估、探针解吸时间优化、内标物评估、探针固定相评估、线性与重复性评估，以及方法检出限的计算。

残留评估

实验开始时，我们采用的探针解吸温度为 250 °C。校准标准品的配制如表 1所示。为评估残留效应，我们首先分析了浓度为 20 ng/L 的 GSM 和 MIB 标准品，随后依次进行了以下操作：运行 GC-MS 参数但不向色谱柱进样（柱空白）、解吸聚焦捕集阱但不从进样器转移任何物质（捕集阱空白）、加热进样器但不插入探针（进样器空白），以及在未预先采样的情况下对探针进行解吸（探针空白）。在柱空白、捕集阱空白和进样器空白中观察到的残留均低于 1%，但在探针空白中，GSM 和 MIB 的残留分别达到 9.35% 和 3.77%（表 2）。因此，我们确定在所用条件下，GSM 在 PDMS 探针上存在显著的残留。

解吸时间优化

在确定聚二甲基硅氧烷（PDMS）探针上存在残留后，我们尝试通过调整探针解吸温度来解决该问题。提高探针解吸温度有望加快分析物从探针表面的解吸速率，从而在15分钟的解吸时间内实现更完全的解吸。然而，过高的温度也可能导致分析物分解，进而对灵敏度产生不利影响。此外，较高温度还可能损坏吸附材料，因此应避免使用超过280 °C的温度。在250 °C的探针解吸温度下，GSM的残留现象较为显著；但当温度升至270 °C时，残留量显著降低，远低于5%的可接受阈值（图1）。这一改进并未伴随灵敏度的损失，因为在初始分析中，270 °C下的峰面积并不小于较低解吸温度下的峰面积（图1），表明分析物分解的增加可忽略不计。

内标物的使用

化合物2-异丙基-3-甲氧基吡嗪在检测土臭素（GSM）和2-甲基异莰醇（MIB）时被广泛用作内标物¹³。我们将计算得到的GSM和MIB浓度与已知的加标浓度进行比较，分别在使用和不使用内标校正的情况下进行评估。未进行内标校正时，回收率较差，60%的加标样品中计算浓度偏低（图2）。相比之下，采用内标校正后，回收率非常理想，接近100%。因此，我们在后续所有分析中均应用了内标校正。

相位选择

在固相微萃取（SPME）分析中，常向聚二甲基硅氧烷（PDMS）中添加碳宽范围（CWR）和/或二乙烯基苯（DVB）以提高灵敏度，但这会增加成本。我们旨在比较仅含PDMS的探针与三相（DVB/CWR/PDMS）探针的性能，考虑到探针相体积的增加可能相较于SPME纤维更有利于提高灵敏度。PDMS探针与三相探针的回收率数据（图3）表明两种探针的整体性能相似，但PDMS探针的回收率略接近100%。因此，鉴于其稍优的性能和更低的成本，后续所有分析均采用PDMS探针进行。需要注意的是，由于探针是从顶空收集分析物，而非直接从样品中采集 通过 由于与样品基质直接接触，GSM/MIB在水样和鱼样中向相材料分配的动力学应无差异。

方法验证

对水中分析物浓度范围为1至100 ng/L的六个浓度水平的校准系列进行了分析（图4）。GSM和MIB的线性关系极佳，r²值分别为0.9999和0.9999。回归标准误差分别为GSM 0.43，MIB 0.37。这表明该方法适用于所评估范围内的定量分析。我们通过在水中对含有40 ng/L GSM和MIB的实验室标准品进行八次重复测定来确定重复性。GSM和MIB的相对标准偏差（RSD）分别为6.3%和4.8%，显示出结果具有极好的重现性。这些重复样品在不同日期分三批独立分析，进一步证明了该方法的精密度。因此，HCSE结合GC-MS分析是一种定量且可靠的方法。

最低检测限（MDL）

根据美国环保署（U.S. EPA）协议¹⁴，通过加标水样（n=10）或加标鱼样（n=11）计算出方法检出限（MDL）。水中土臭素（GSM）和2-甲基异莰醇（MIB）的提取与检测方法所得检出限分别为1.2 ng/L（GSM）和1.1 ng/L（MIB）。这些方法检出限远低于人体嗅觉阈值（分别约为10 ng/L和20 ng/L）。因此，所提出的方法可在这些致嗅物质达到人类感官阈值之前，对其积累情况进行可靠且定量的检测。从鱼样中提取并检测GSM和MIB的检出限分别为18.1 ng/kg（GSM）和13.6 ng/kg（MIB）。

水产养殖水样的分析

我们分析了来自七个循环水养殖系统的水样，每个系统检测了五个重复（系统3）或三个重复（其他所有系统）。所分析的循环水养殖系统中，除一个系统外，其余均含有浓度高于我们方法检出限（MDL）的土臭素（geosmin）和2-甲基异莰醇（MIB）（图5），表明可能存在水质问题。然而，我们注意到在所有情况下，MIB浓度均远低于人类嗅觉阈值（20 ng/L），而仅有1个系统超过了GSM的嗅觉阈值（10 ng/L）（系统1，GSM浓度 = 12.69 ng/L）。尽管我们在系统3中检测到了GSM和MIB，但MIB浓度低于我们计算出的MDL，因此无法对其浓度进行可靠定量。尽管使用的是实际环境水样，该方法在所有系统中均表现出优异的精密度，各系统内重复样品间计算浓度的变异极小（图5）。

鱼类组织分析

鱼类组织富含脂质，在本方法中会产生强烈的基质效应，阻碍土臭素（GSM）和2-甲基异莰醇（MIB）的提取。因此，需对方法进行细微调整以提高提取效率，包括采用更高的孵育温度（80 °C）和更长的孵育时间（20 min），相较于水样提取方法有所改进。此前已对鱼类组织样品进行分析，以确定其中GSM和MIB的本底浓度。随后，向这些相同的样品中添加已知量的GSM和MIB，进行三份平行测定，以评估回收率和精密度（图6）。

图1：探针解吸温度对残留的影响。 （A）含有20 ng/L GSM和MIB的实验室标准样品在三种不同探针解吸温度下各进行三次分析，得到平均峰面积。每个探针随后在初始温度下再进行两次解吸，以评估残留情况，结果分别显示于（B）（GSM）和（C）（MIB）。残留量以相对于初始峰面积的百分比表示。误差线代表三次重复实验的标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2: 内标物的使用 校正后的比较 与 仅使用PDMS探针萃取时，15或40 ng/L分析标准品的未校正数据及回收数据。样品浓度采用IPMP作为内标物进行校正。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3： 分析物回收率。 使用仅 PDMS 或三相（PDMS、DVB、CWR）探针提取时，GSM（左）和 MIB（右）在 15 ng/L 浓度下的分析标准品回收率数据。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：分析校准曲线。 GSM（实线，r² = 0.9999；S = 0.37）和 MIB（虚线，r² = 0.9999；S = 0.37）校准曲线的线性回归结果。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5： 水产养殖用水应用。 从七个水产养殖系统中采集的水样中（A）GSM 和（B）MIB 的浓度（每个系统的样本数 n ≥ 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6： 鱼类组织应用。 两种添加了 GSM 和 MIB 的鱼类样品（F1 和 F2）中 GSM 与 MIB 的浓度。请点击此处查看此图的放大版本。

溶液名称	加入的C1储备液体积	总体积	终浓度
储备液 C1	10 µl	100 ml	10 µg/ml
标准品 1	10 µl	100 ml	1 ng/L
标准品 2	20 µl	100 ml	2 ng/L
标准品 5	50 µl	100 ml	5 ng/L
标准品 10	100 µl	100 ml	10 ng/L
标准品 20	200 µl	100 ml	20 ng/L
标准品 50	500 µl	100 ml	50 ng/L
标准品 100	1000 µl	100 ml	100 ng/L
标准品 200	2000 µl	100 ml	200 ng/L

表1：校准标准品。 土臭素和2-甲基异莰醇标准品均以甲醇中土臭素和2-甲基异莰醇溶液（CRM47525，100 µg/mL）配制，稀释为甲醇中的储备液C1（10 µg/mL）。

分析	残留 (%)
	GSM	MIB
气相色谱运行	0.04	0.08
捕集阱脱附	0.09	0
进样口脱附	0	0
探针再脱附	9.35	3.77

表2：探针残留评估。 对含有GSM和MIB（浓度为20 ng/L）的实验室标准品进行提取、解吸及气相色谱-质谱分析后，检测残留情况，内标IPMP浓度为30 ng/L。分析方法的描述见2.2.1节。

讨论

GSM 和 MIB 是在多种水质监测环境中出现的异味化合物，对检测能力的需求很高。此外，人类在痕量水平下即可感知 GSM 和 MIB。因此，理想的分析系统必须兼具高灵敏度和高通量，以生成大量高质量的数据。我们已在前面的章节中证明，使用 HCSE 探针进行萃取所提供的灵敏度远超实际所需水平。

HCSE探针的坚固设计避免了任何断裂问题，而断裂可能中断SPME工作流程。在方法优化后，我们未遇到系统污染或残留问题，而这些问题在P和T方法中较为常见。然而，该方法实现高通量的最大贡献无疑来自于所使用的自动进样平台。借助该系统，分析可全天候持续进行，仅需人工将样品放入样品盘。这与其他高容量吸附萃取方法（如SBSE）形成鲜明对比，后者需要手动操作。尽管SPME通常可实现完全自动化，但其通量受限，因为下一个样品的孵育通常只能在前一样品注入GC柱后才可开始。假设GC循环时间较短，则在下一个样品完成萃取期间，GC可能处于闲置状态。而采用我们的方法，多个样品可同时进行采样前处理和萃取，从而最大限度地减少GC停机时间。因此，我们能够以每小时每系统1.8个样品的速度进行处理。

迄今为止，我们已实现对GSM和MIB的检测限（MDL）分别为1.2 ng/L和1.1 ng/L，已远超所需的灵敏度要求。尽管其他技术如吹扫捕集（P and T）、液液萃取（LLE）、搅拌棒吸附萃取（SBSE）和固相微萃取（SPME）在某些情况下可能达到更低的检测限¹¹，但这些灵敏度的提升实际应用价值有限，且不足以弥补HCSE探针在上述所列出的优势。此外，其中一些技术需要较大的样品体积，随之带来废液产生量和运输成本的增加。对于LLE，样品体积通常在200–500 mL范围内¹⁵,^16,17；而对于SPME、SBSE以及吹扫捕集技术，典型样品体积为10–100 mL^{18,19,20,21,22}。本方法表现出优异的重现性，GSM和MIB的相对标准偏差（RSD）分别为6.34%和4.82%。这些数值与其他方法报道的结果大致相当¹¹，尤其优于已发表的SPME方法中的RSD值^23,24。值得注意的是，我们的低RSD值仅使用5 mL样品体积即实现，远低于绝大多数已发表的萃取技术所用体积。因此，我们确信HCSE探针在提供足够灵敏度和重现性的同时，还兼具一系列优势，将所有主流替代方法的最佳特性整合为一种简单、完全自动化且可持续的单一方法。

土臭素和2-甲基异莰醇是疏水性化合物，这为科学家从富含脂质的组织中提取这些化合物进行分析带来了挑战。因此，我们调整了采样前的条件，采用更长且更高温度的采样前处理程序，以促使更多分析物从样品基质进入顶空。经过这些调整后，我们确定该方法在鱼类组织中GSM和MIB的分析中效果良好。需要注意的是 ，对于脂质含量极高的样品，可能需要减少所用样品的质量，例如减少至0.50 g，以避免脂质在水相表面形成完全密封层，阻碍分析物进入顶空。

该方法利用平衡原理从样品的顶空中提取分析物。尽管本文中使用的是水产养殖中的水样和鱼样，但我们认为该方法适用于从任何可均质化并置于20 mL采样瓶中的固体或液体基质中提取气味物质。示例应用包括环境水体和土壤的监测、饮用水检测，以及水果、蔬菜或非养殖水生生物等食品的检测。在农业中，GSM和MIB常存在于潮湿土壤中，并可能导致在其中种植的作物产生异味。²因此，可以同时对土壤和作物进行检测 通过 我们采用该方法监测气味物质浓度，以实现质量控制和/或追溯恶臭投诉的来源。许多环境水体，如河流和湖泊，由于藻类大量繁殖，会在特定季节出现气味物质浓度的急剧升高²⁵，该方法可高通量、高灵敏度地监测这些峰值的程度。该方法也适用于学术研究，例如用于测定微生物产生气味物质的速率。²⁶ 或研究水中气味物质浓度与动物组织中气味物质浓度之间的关系²⁷其他研究团队已使用HCSE法从多种类型的样本中提取，例如酒精饮料²⁸，羊肉²⁹，橄榄油³⁰，人细胞培养基³¹和开心果³²这些研究针对其他分析物或属于非靶向分析研究，因此并未针对GSM和MIB的分析进行优化，但在此列出，因其可为制备不同类型样品以进行HCSE探针提取提供一般性参考。

尽管所述的水样方法经过极少修改后可能适用于所有水或以水为基质的样品，但将其应用于其他固体或半固体样品时，可能需要针对样品前处理（第3.1节）和分析物提取（第3.2节）进行一些基质特异性的调整。虽然无法在此涵盖所有采样情况，但我们提出以下考虑事项。（1）固体样品应通过研磨、粉碎或匀浆处理均质化为细粉，以确保样品的代表性，并为分析物的释放提供尽可能大的表面积。（2）低脂含量的固体样品可能无需添加水或盐——即，可直接称取1.00 g样品至样品瓶中并加盖密封。这将允许分析物从样品直接转移至顶空，而无需经过从样品基质向所加水中转移的中间步骤。然而，这会降低搅拌效率。分析人员应通过实验确定其特定样品基质的最佳样品前处理方法。（3）不同基质对GSM和MIB具有不同的亲和性，因此需要不同的孵育温度，以便及时达到分析物的平衡状态。但某些基质可能因受热发生化学变化，导致在高温下发生化学反应而产生干扰物质。同样，需通过实验确定特定样品类型的最优孵育温度（注意：含水量高的样品绝不可在90 °C以上孵育 ，以免因水沸腾产生的蒸气压力导致样品瓶破裂）。

我们已开发出用于检测水中及鱼类组织中土臭素和2-甲基异莰醇的方法。对实验室标准品的测试证实，这些方法具有定量性和可重复性；而对实际样品（来自循环水产养殖系统的水样、源自此类系统的鱼类组织）的应用结果表明，即使在复杂且含杂质较多的样品中，该方法仍表现出良好的检测性能。尽管我们已将这些方法应用于水产养殖来源的样品，但我们认为该方法同样适用于多种类型样品中GSM和MIB的监测，包括水样以及固体或半固体材料。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5-10 µL 移液器	Nichipet Air	A21405581
1000 µL 移液器吸头	VWR	76322-154
100-1000 µL 移液器	eppendorf	285612
100 mL 玻璃烧瓶	VWR	76008-704
10-100 µL 移液器	Nichipet Air	A20814031
10-100 µL 移液器吸头	mega	24502-18
10xL 移液器吸头	VWR	76322-132
20 mL 玻璃烧杯	VWR	10754-698
2-异丙基-3-甲氧基吡嗪	TCI	I0577	内标物
40 mL 棕色 1 型（硼硅酸盐）玻璃小瓶	Environmental sampling company	0040-0400-QC	水质采样瓶
5 mL 移液器吸头	VistaLab technologies	4058-5102
天平	VWR	VWR-124B2
Centri 360	Markes	U-CENTRI-1691	自动进样器
Chromeleon 版本 7.3	Thermo Scientific		气相色谱-质谱软件
聚焦捕集阱	Markes	U-T12ME-2S
气相色谱仪 Trace 1310	Thermo Scientific	14800403
气相色谱柱	Thermo Scientific	26098-1420	TG-5MS
土臭素和 2-甲基异莰醇溶液	SIGMA-ALDRICH 或 MilliporeSigma	CRM47525
顶空小瓶，20 mL	Markes	C-VCC20
HiSorb 手柄	Markes	C-HH-6
HiSorb 进样器盖帽	Markes	C-HSPCCS
HiSorb 进样衬管	Markes	U-LINER-HISORB
HiSorb 探针，PDMS，短款	Markes	H1-XXABC
HiSorb 小瓶盖	Markes	C-HSPCCS
实验室金属药勺
质谱仪 ISQ 7000	Thermo Scientific	ISQ7K-NOVPI
甲醇	VWR chemicals	BDH1135-4LP
甲醇，Optima LC-MS 级	Fisher-scientific	A456-4
O 型圈，尺寸 201	Markes	U-COV201	用于 HiSorb 进样器盖帽和 HiSorb 储存
Ovation 自动移液器（100-5000 µL）	VistaLab technologies	213626
紫色腈纶-Xtra 无粉检查手套	Kimtech	50602-54
氯化钠（食盐）	VWR chemicals	BDH9286-2.5K
转换接头（自动移液器）	CUI INC	SMI10-5
小瓶压盖工具	Markes	U-HSVCR
小瓶去盖器	Markes	U-HSVDC
称量舟	Grainger	8AG69