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方法文章

利用毛细血管显微镜无创观察小鼠甲床微血管形态

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DOI：

10.3791/67529

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2025年2月28日

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1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Ophthalmology, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School, 3Department of Anesthesia and Critical Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Ophthalmology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

甲襞微循环显微镜检查是一种简便易行的工具，可用于直接、经济且无创地观察微血管系统。本实验方案的目的是使研究人员能够利用甲襞微循环显微镜检查技术，观察小鼠甲床部位外周微血管的形态结构。

摘要

利用甲襞微循环显微成像（nailfold capillaroscopy, NFC）对人体皮肤微毛细血管网络进行成像，凸显了微循环作为多种严重系统性疾病中靶器官系统的重要性。临床上，甲襞微循环显像被用于检测多种系统性疾病中的外周微血管功能障碍与结构异常，包括风湿性疾病、心脏疾病、眼部疾病（如青光眼）以及内分泌系统疾病（如高血压和糖尿病 mellitus）。NFC不仅有助于发现外周系统性微血管结构的破坏，还可用于评估药物疗效。然而，将临床NFC的研究发现转化为动物疾病模型时往往面临挑战。在动物中检测微血管功能障碍或异常通常具有侵入性（如内镜检查），且操作过程繁琐 离体 （例如，组织的死后成像），或成本高昂，需要使用显微计算机断层扫描和光声成像等技术所需的专用设备。有必要开发快速、无创且经济的成像技术，用于疾病动物模型中外周微血管的成像，以降低研究成本并提高向临床应用的转化能力。

既往已使用毛细血管显微镜在包括豚鼠和小鼠在内的动物模型中观察甲襞微血管结构，从而证明了毛细血管显微镜作为一种非侵入性成像工具在动物模型中的应用能力。本研究提供了一种应用于小鼠甲床的毛细血管显微镜检测方案，使研究人员能够简便且低成本地评估其微血管形态。文中提供了两种常用实验小鼠品系SV129/S6和C57/B6J的野生型小鼠典型甲床微血管结构的代表性图像。利用该方法开展进一步研究，对于将甲床毛细血管显微镜技术应用于多种伴有外周微血管异常的小鼠疾病模型具有重要意义。

引言

利用甲襞微循环显微镜（nailfold capillaroscopy, NFC）对人体外周微毛细血管网络进行成像，凸显了微循环作为多种全身性疾病靶器官系统的重要性1毛细血管显微镜检查涉及使用显微镜放大并观察指褶部位的血管 体内因此，该技术在临床中被广泛用于检测多种系统性疾病的外周微血管功能障碍及异常，包括风湿性疾病2,3心脏4，眼部（例如，青光眼）5,6，以及内分泌疾病（如高血压和糖尿病）7,8）。通过NFC可轻松检测到甲襞毛细血管的形态学改变，包括出血、血管扭曲程度增加以及无血管区域。这些形态学异常反映了病理性过程，例如微血管过度或不足的重塑。9,10NFC 是检测这些病理变化的有用诊断工具。此外，该技术在评估药物疗效方面也具有应用价值。11.

然而，由于多种原因，将临床NFC发现转化为疾病动物模型具有挑战性。在动物体内观察微血管通常具有侵入性（例如内窥镜），且需进行 离体 （例如，组织的死后成像），或成本较高，需要使用微计算机断层扫描等专用设备12,13相干光断层扫描血管成像14和光声成像技术15由于外周微血管病变在多种系统性疾病和中枢神经系统疾病（包括心肌梗死）中均明显存在16高血压17，中枢神经系统与年龄相关的神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病18，以及青光眼等视神经病变19，一种非侵入性、成本效益高的 体内 可视化技术非常有益。

毛细血管显微镜已被用于评估包括豚鼠20和小鼠21在内的动物模型中的甲襞微血管结构，从而证明其作为一种无创成像工具的能力。本文中，我们将毛细血管显微镜应用于指甲的另一部位——甲床。利用小鼠指甲的透明性，甲床毛细血管显微镜技术为外周微血管的可视化提供了一个新的观察位置。与特别适用于监测血细胞运动的甲襞毛细血管显微镜（NFC）相比21,22，本文所述的甲床毛细血管显微镜方法提供了更大的观察区域，更有利于微血管形态和结构的观察。我们提供了一种简便且低成本的实验方案，使研究人员能够评估小鼠甲床微血管的形态，该部位是一种新型的无创外周血管成像位置。本方案使用两种常用的实验小鼠品系（SV129/S6 和 C57/B6J），展示了野生型小鼠典型的甲床微血管结构的代表性图像。我们证明，甲床毛细血管显微镜是一种低成本、无创的微血管成像方法。未来利用这一探索性技术开展的进一步研究，对于将甲床毛细血管显微镜应用于多种存在外周微血管病理异常的小鼠疾病模型具有重要意义。

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方案

本文所述所有方法均已获得范德比尔特大学医学中心和麻省总医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 成像用小鼠指甲的制备

注意：为了获得最佳的血管清晰度和皮肤恢复效果，成像前应至少等待 24 小时。

  1. 为了实现对小鼠甲床的无障碍成像，需在进行甲襞微循环成像前至少 24 小时去除啮齿类动物足部的毛发（图 1A）。去除小鼠足部毛发的具体步骤见 1.1.1–1.1.6。
    1. 使用吸入式异氟烷麻醉剂（2% 异氟烷，混合 5% 二氧化碳和 95% 氧气）对动物进行镇静。通过夹捏后肢足垫来确认小鼠是否已充分麻醉。若麻醉充分，则不应出现抽动反应（即足底回缩反射消失）。若仍存在反射性动作，需延长小鼠在异氟烷中的暴露时间以确保完全麻醉。重复检测足底回缩反射，直至确认麻醉效果后继续后续操作。
    2. 在小鼠达到适当麻醉状态后，将润滑性眼用凝胶或无菌非药物性眼膏涂抹于双眼，以防止麻醉期间角膜干燥。
    3. 通过鼻罩维持动物麻醉状态，使用涂抹工具将足量脱毛膏均匀涂抹于整个足部。注意覆盖整个足部及甲床区域，如 图 1B 所示。
    4. 在室温（RT）下保持脱毛膏作用 1 分钟。若此时毛发已易于去除，则清除毛发并用大量水彻底冲洗。
    5. 用干净的纸巾轻轻擦拭，仔细清除残留的脱毛膏。
    6. 用温热的无菌水清洗足部。
      注意：成像前应确保足部无毛发残留，且指甲区域无障碍物遮挡，如 图 1C 所示。
    7. 将小鼠放回笼中，确保其从麻醉中安全恢复。在小鼠恢复意识前不得离开无人看管。一旦小鼠恢复意识，将其放回原笼并与其他动物同笼饲养。

2. 体内 甲襞毛细血管显微成像

  1. 去除毛发后至少经过 24 小时恢复时间，将毛细血管显微镜设备置于温度受控的房间内（保持在 21.5–22.5 °C），如图 2A所示。用于甲床成像的完整设备包括：1）异氟烷麻醉设备，2）麻醉鼻罩，3）可调节动物载物台，4）毛细血管显微镜，以及 5）配备成像视频软件的笔记本电脑。
  2. 使用吸入式异氟烷麻醉剂（2% 异氟烷，混合 5% 二氧化碳和 95% 氧气）对动物进行麻醉。
    1. 通过夹捏小鼠后肢足垫来确认其是否充分麻醉。若麻醉充分，则不应出现抽动反应（即足底回缩反射消失）。若仍存在反射性动作，则返回步骤 1.1.1，延长麻醉时间直至完全麻醉。随后重新测试足底回缩反射，并继续操作。
    2. 在小鼠充分麻醉后，向双眼涂抹润滑性眼用凝胶或无菌非药物性眼膏，以防止角膜在麻醉期间干燥。
  3. 在维持麻醉状态下，将后肢足掌侧朝上放置于物镜下方的实验胶带平台上，如图 2B放大图所示。
  4. 使用棉签轻轻展开脚趾，使指甲在显微镜物镜下彼此分离。确保各甲床相互分开，以获得最佳血管成像效果。
    注：图 2C展示了完整的成像装置，以及笔记本电脑视频软件中显示的血管图像。
  5. 为减少反光并改善聚焦效果，大量涂抹浸油（玉米油）于足部，确保完全覆盖所有指甲。在小鼠足底下方添加白色胶带或其他类似材料以增强对比度，从而改善血管床的可视化效果（图 3；箭头 3）。
  6. 聚焦于后肢第二趾的指甲；在小鼠中，该指甲最大且最易于成像。为对准小鼠指甲，使用 x 和 y 轴调节旋钮（图 3；箭头 4）以及放大调节轮（本仪器最高可达 280 倍；图 3；箭头 1）进行调节。
  7. 旋转物镜以减少反光位置，使指甲下的血管网络清晰可见（图 3；箭头 2）。
    注：若血管难以观察或成像时间延长，可再次充分涂抹浸油。小鼠前肢的爪子比后肢更小，因此建议在后肢爪子上进行成像。
  8. 通过通用串行总线（USB）连接将毛细血管显微镜连接至笔记本电脑。
  9. 在笔记本电脑上打开 Debut 视频软件应用程序。
    注：请在设置中确认设备已正确连接至笔记本电脑。
  10. 在笔记本电脑屏幕上观察毛细血管显微镜所放大的图像，并通过调节 x 和 y 轴调节旋钮及放大轮，对准甲床以获得清晰图像。
  11. 当显微镜已聚焦并清晰显示甲床内血管网络时，点击 Debut 或其他类似视频软件中的红色录制按钮开始录制视频（图 2C）。
  12. 将每个视频保存至相应的项目文件夹中，并对每个视频进行适当命名标注。

3. 保存甲床图像

  1. 在软件中打开甲床视频，手动选择视频中血管清晰对焦的一帧画面。
  2. 使用计算机上的截图工具，截取显示指甲部位清晰血管结构的初始视频画面，并保存图像。
  3. 通过点击文件和打开，在 ImageJ 软件中打开截图图像；从目标文件夹中选择该文件。
  4. 如有需要，通过选择图像 > 调整 > 亮度/对比度来调节图像的亮度和对比度。该工具可用于调整图像对比度，以更清晰地观察血管形态。
  5. 图像调整完成后，在亮度/对比度工具中点击设置。
  6. 点击文件，然后选择另存为，将图像保存为 TIFF 文件格式。

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结果

利用此处所述的毛细血管显微成像方法，可轻松观察甲床血管形态，如图4A所示。小鼠典型的甲床血管结构具有三个稳定特征，如图4B所示：每个甲床均包含1）一条传入血管、2）一条传出血管，以及3）连接传入与传出血管的毛细血管网络。为展示甲床形态的一致性，我们在图4C中展示了背景为SV129/S6的野生型小鼠的代表性甲床毛细血管网络，以及在图4D中展示了背景为C57/B6J的野生型小鼠的甲床毛细血管网络。

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讨论

综上所述，我们提供了一种实验方案，使研究人员能够以简便且低成本的方式评估小鼠甲床微血管的形态，该部位是无创外周血管成像的一个新位点。与已用于豚鼠20和小鼠21的NFC方法类似，本方案的主要优势在于能够快速、无创地评估疾病小鼠模型中的外周微血管系统。该方法可能特别适用于涉及外周血管异常的研究，例如风湿性疾病2,3，以及包括高血压和糖尿病在内的内分泌系统疾病7,8。

利用小鼠指甲的透明特性，指甲床毛细血管显微成像技术为外周微血管系统的可视化提供了一个全新的观察部位。与特别适用于监测血细胞运动的NFC相比21,22此处所述的甲襞毛细血管显微观察方...

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披露

与本工作无关，Pasquale 博士曾担任 Twenty Twenty 的付费顾问。 与本工作无关，Clara Cousins 是 Cartography Biosciences 的付费顾问。其余作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由授予Lauren K. Wareham的无限制部门资金资助。Pasquale博士获得了青光眼基金会（纽约）以及防止失明研究组织（纽约）的无限制挑战基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉用活性炭过滤罐ReFreshEZ-258
微循环显微镜 Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, ChinaJH-1004
压缩气体（5% 二氧化碳，95% 氧气）AirgasUN3156
玉米油SigmaC8-267 
Debut 视频采集软件Debut可在线免费获取。
眼科棉签BVI Weck-Cel0008680用于涂抹和清除脱毛膏。
脱毛膏Nair 610370323649
异氟烷 250 mL 瓶装Piramal Critical CareNDC  6679401725
实验升降台 Fisherbrand14-673-52用作固定小鼠的平台。
鼻罩（低剖面麻醉面罩）Kent ScientificSOMNO-0801
移液管Fisherbrand13-711-9AM将玉米油充分涂抹于小鼠足垫，作为浸油使用。
USB 视频采集卡VIXLWBR116
VetequipVWR89012-492异氟烷麻醉设备
白色标签胶带 Fisherbrand15-958在拍摄图像时置于小鼠足垫下方，以形成白色/高对比度背景。

参考文献

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