小鼠通常对脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）感染具有抗性，这给针对肺部感染的急需抗生素的研发和发现带来了困难。本文介绍了一种接种物制备及气管内感染的方法，该方法已被证实可在免疫功能健全的小鼠中建立持续性感染。
方法文章
琼脂糖珠制备 脓肿分枝杆菌 通过气管内接种免疫活性小鼠
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
迫切需要建立稳定的Mycobacterium abscessus（一种主要感染肺部的环境致病菌）慢性感染小鼠模型。临床上，长达一年的多药联合治疗方案治愈率极低，仅约50%，因此亟需可预测的临床前工具以开发更有效的抗生素。然而，免疫功能健全的小鼠通常对M. abscessus的肺部感染具有抗性。文献中已报道多种在免疫功能健全小鼠中建立持续性M. abscessus感染的尝试。其中，将包埋于琼脂珠中的细菌通过气管内途径接种至C57BL/6小鼠的方法显示出最大的潜力。该方法的主要局限在于技术上的挑战：需制备大小一致、含菌量可重复的琼脂珠，并完成气管内接种。本文首先详细描述了一种优化后的方案，可制备出直径适宜且载菌量可重复的M. abscessus琼脂珠。随后，我们提供了一种优化的气管内接种操作流程，旨在避免琼脂珠和细菌因黏附于接种装置表面而造成损失，并实现肺部M. abscessus琼脂珠沉积的可重复性。本方法的目标是确保操作简便，并具备优异的实验室间可重复性。
引言
脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，Mab）肺病的治疗选择有限，通常需要长达一年的多药联合治疗方案，包括口服、肠外给药以及偶尔使用吸入性抗生素，其中大多数药物缺乏理想的杀菌活性，且具有显著的毒性1,2,3,4,5。目前迫切需要更短程、更安全且更有效的治疗方法。分枝杆菌感染的小鼠模型在有效药物及治疗方案的发现与优化过程中发挥了重要作用6,7。然而，由于难以在小鼠体内建立持续进展性的肺部感染，针对Mab感染的抗生素临床前评估面临挑战8,9。
在免疫功能健全的小鼠品系中，Mab 感染通常仅导致短暂定植，随后病原体被迅速清除10,11。 为实现临床上所观察到的慢性感染，已有研究使用琼脂糖或琼脂等固定剂，以促进机会性病原体（如Pseudomonas aeruginosa或Haemophilus influenza）在免疫功能健全小鼠体内的持续存在及其引发的免疫病理反应12,13,14。该模型近期已被改进，用于在免疫功能健全的 C57BL/6N 小鼠中建立 Mab ATCC 19977 慢性呼吸道感染15,16,17,18。该方法通过气管内接种约 1 × 104 至 1 × 106 菌落形成单位（CFU）的病原体，可在接种后维持持续感染达 45 天，感染小鼠中慢性感染的发生率为 90%–100%19，并在降解中的琼脂珠周围形成结构化的肉芽肿18。研究表明，将 Mab 包埋于微珠中可使其免受先天免疫系统的快速清除，而负载细菌的微珠则成为免疫细胞募集的焦点，进而诱导肉芽肿形成并建立慢性感染18。琼脂/琼脂糖微珠是一种相对惰性的生物材料，仅引发轻微的炎症反应。此外，微珠降解缓慢，可避免异物过敏反应或诱导性纤维化等问题。通过气管内接种（无论是否使用微喷雾装置）可确保接种物有效沉积于肺部8,20,21，相较于静脉注射或鼻内接种，更能真实模拟临床暴露与感染过程。
因此，该模型具有诸多优势。然而，它也存在一些技术上的挑战，即：（i）获得可重复的微球大小，（ii）获得可重复的微球细菌载量，以及（iii）确保接种物经气管内递送的一致性。本文中，我们提供了详细的实验方案，以可靠地实现这些目标，并确保实验室之间的可重复性。
方案
所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并获得美国国家过敏与传染病研究所（NIAID，NIH）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，贝塞斯达，马里兰州。所有实验程序均已通过机构动物护理和使用委员会的审批。所有涉及M. abscessus的研究均在生物安全二级防护实验室中进行。
1. 制备包埋于琼脂珠的 M. abscessus 接种物
- 通过将1.5 mL光密度（OD600）为1（使用分光光度计测定）的M. abscessus ATCC 19977菌液接种至200 mL Middlebrook 7H9培养基中，制备预培养物，该培养基中添加有0.05%（v/v）Tween 80、0.5%（v/v）甘油和10%（v/v）Middlebrook白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶增补剂（ADC）。
- 将培养物置于旋转瓶中，在37 °C下孵育24小时，直至达到对数中期（OD600 = 0.4–0.6）。
- 将1.2 g胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）溶解于40 mL超纯水中，并加入0.6 g Difco琼脂，使其终浓度为1.5%。
- 将60 mL重质矿物油转移至500 mL锥形瓶中，并将矿物油和胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）在121 °C下灭菌15分钟，随后在50 °C烘箱中平衡温度。
- 取1 mL培养物样品，测定其OD600。
- 在4 °C下以3700 g离心15分钟收集菌体，然后将菌体重悬于4 mL 1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，使OD600约为30。
- 在50 mL离心管中，将3 mL菌悬液与27 mL预先在50 °C平衡的熔融TSA混合，通过涡旋振荡或移液迅速混匀。
- 小心地将30 mL细菌-琼脂混合物倒入60 mL矿物油中，并将锥形瓶置于次级容器内。迅速启动磁力搅拌器（设置为50 °C），使用磁力搅拌子以中等速度（420 rpm）搅拌，确保油-琼脂混合物中形成可见的涡流。在室温（RT）下持续搅拌6分钟。
- 通过向次级容器中加入冰块冷却混合物，并继续搅拌35分钟。
- 停止搅拌，让琼脂珠悬液静置20分钟（必要时补充冰块）。
- 将悬液转移至两个50 mL离心管中，用一倍体积的DPBS洗涤10次以去除矿物油和游离细菌（前5个循环使用3700 g，6分钟，4 °C）。
- 在第三次洗涤时，将琼脂珠悬液合并至同一离心管中。前5次洗涤过程中，使用移液管轻柔地重悬琼脂珠。
- 后续5次洗涤循环中，采用以下离心参数：2000 g离心5分钟，随后依次为1000 g离心4、3、2和2分钟。
- 将琼脂珠重悬于DPBS中，终体积为40 mL，转移至125 mL无菌瓶中，并通过加入120 mL DPBS进行4倍稀释。
- 将悬液通过200 µm细胞筛进行过滤。
- 将细胞筛固定于无菌50 mL离心管上，然后将样品加至筛网上，过滤珠悬液。
- 为促进过滤过程，将细胞筛、漏斗、连接环和50 mL离心管组装成一个整体装置，按漏斗、细胞筛、连接环、50 mL离心管的顺序装配，并缓慢拉动连接环上所接30 mL注射器的活塞。
- 如有需要，从反面用DPBS冲洗细胞筛，以洗去滞留的大颗粒琼脂珠。通过在1000 g下离心2分钟或静置沉降的方式浓缩稀释后的悬液。收集后，将琼脂珠于4 °C保存，最多可保存1周。建议每次实验批次均新鲜制备。
- 取5 µL珠悬液滴加于载玻片上，加盖盖玻片，使用10×物镜的光学显微镜或荧光显微镜在若干随机位置拍摄图像。保存图像，并使用ImageJ软件测量珠粒直径（理想尺寸范围：200 ± 50 µm）。
2. 包埋于琼脂珠中的 M. abscessus 接种物的滴定
- 将1 mL珠子悬浮液加入M管中，使用设定为预定义程序RNA.02.01的解离仪进行无菌均质化，以释放包埋在珠子中的细菌。
- 取100 µL均质液，按1:10比例进行系列稀释至1 × 10-5稀释度。将各稀释液涂布于添加了10%油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（OADC）和2%甘油的7H10琼脂平板上。培养3至5天后计数菌落形成单位（CFU）。
- 根据需要调整接种物滴度。例如，若每只小鼠接种含1 × 105 CFU 的100 µL珠子悬浮液，共接种10只小鼠，则需制备总量约2 mL、浓度为1 × 106 CFU/mL的悬浮液，并额外增加约25%以补偿注射器中的损失。
3. 通过注射器和针头进行微珠分配测试
注意：以下步骤旨在确保微珠不会黏附在注射器或针头表面。研究发现，使用玻璃注射器和24 G金属喂养针至关重要，可防止微珠因黏附于塑料表面而损失。
- 通过将 1.25 mL 无菌 Tween 80 加入 500 mL 无菌 PBS 中来配制 PBST。
- 向五个 M 管中各加入 900 µL PBST，用于检测通过喂养针的琼脂珠；同时向 2 mL 无菌离心管中各加入 900 µL PBST，以制备每份“推过”样品的 -2 至 -6 梯度稀释液。
- 使用 P1000 移液器混合先前制备的包埋有 M. abscessus 的琼脂珠，确保所有珠子均匀分散。
- 将 24 G 金属喂养针连接至玻璃注射器，并吸取琼脂珠悬液，注意避免产生气泡。
- 当注射器充满且无气泡后，在注射器推杆上安装尼龙夹或塞子，夹子之间不留空隙。这些塞子可实现准确分配 50–100 µL 液体。推杆上最多可安装 6 个夹子。
- 按相应顺序将 100 µL 珠子（"推过"）分配至 M 管中。
- 收集完 5 份“推过”样品后，使用组织解离仪在 RNA.02.01 设置下进行珠子均质化处理，该程序适用于从冷冻组织中提取 RNA，且被证实可有效从珠子中释放 M. abscessus，同时不影响细胞活力。
- 对均质后的样品进行 -1 至 -6 的系列稀释，将稀释液接种于添加 OADC 的 7H11 琼脂平板上。5 天后计数菌落形成单位（CFU）。
4. 小鼠气管内接种
- 准备6至8周龄的CD-1小鼠。
- 使用异氟烷气雾暴露系统对小鼠进行麻醉，流速为1-5%，具体操作如前所述1。
注意：小鼠麻醉后应涂抹眼药膏。本实验未通过面罩持续维持异氟烷麻醉，因此完成该操作的时间较为有限。 - 使用定制设计和制造的三维（3-D）打印倾斜支架固定小鼠。支架中央的杆上带有缝合线，通过门齿将小鼠垂直悬挂，使其呈腹卧位且头部抬高。
- 将金属24 G动物喂食针连接至装有包埋脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的琼脂珠的玻璃注射器。在注射器推杆上安装尼龙夹或塞子，以确保每只小鼠接种50 µL的接种物。
- 当麻醉后的小鼠被缝合线固定后，使用棉签将舌头拨至口腔一侧。
- 观察小鼠口腔后部，清晰识别口腔后方的白色区域，并对准气管位置。
- 将金属灌胃针垂直置于小鼠上方，并从气管顶部插入。穿过会厌时可能会有轻微阻力。
注意：可通过插入灌胃针时触感气管的环状结构来确认其是否正确进入气管。 - 将灌胃针沿气管缓慢推进，取下尼龙夹或塞子，注入50 µL包埋脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的琼脂珠悬液。
- 让小鼠静置5分钟，然后重复步骤4.2–4.8一次。采用两步接种法的目的是确保接种物在肺部沉积的可重复性和深度。
注意：动物从麻醉中恢复期间，应在笼子下方提供加热支持。 - 让感染进展24小时后，处死小鼠，以定量肺部细菌定植情况。
结果
微珠大小与细菌载量
为观察琼脂微珠及其携带的细菌，将mCherry红色荧光蛋白在Mab标准菌株ATCC 19977中由组成型 Hsp60启动子驱动表达，并如上所述将该菌株包埋于琼脂微珠中。图1A显示了微珠的尺寸范围（比例尺 = 200 μm）。图1B展示了6次独立制备的微珠中的细菌载量，表明该实验方法具有良好的可重复性。
注射器推注接种与细菌植入的涂布操作，继以气管内接种
气管内接种的方案经过两步优化。在接种物通过玻璃注射器前后，分别测定其每毫升菌落形成单位（CFU/mL），以确保微珠或细菌在通过注射器及连接导管时无损失。表1展示了两次独立制备的微珠样品（试验1和试验2）的初始细菌滴度，以及单次注射器装载量中每100 mL“推注通过”样品所回收的CFU数量。为避免微珠和细菌的损失，必须使用连接金属导管的玻璃注射器。因为琼脂微珠易黏附于塑料表面。
在珠粒制备物中随时间变化的菌落形成单位（CFU）计数显示，珠粒中的细菌载量在 4 °C 条件下可保持稳定达 1 周，此后每 2 周细菌载量约下降 2 倍，且肺部沉积能力未受影响。接下来，使用三种独立制备的珠粒分别感染 5 至 8 只小鼠，以验证经气管接种操作的可重复性。表 2 列出了感染后 24 小时每只小鼠肺组织中的 CFU 数量，计数方法如前所述。
最后，通过三组不同的操作者分别对三组各10只CD-1小鼠进行感染，以评估操作者间的感染可重复性。感染后24小时的肺部菌落形成单位（CFU）计数结果如图2所示。
图1：评估微珠大小、可视化并定量 M. abscessus 细菌载量的预实验。（A） 含有 M. abscessus ATCC 19977 菌株的琼脂微珠，该菌株经基因工程改造，可在组成型 hsp60 启动子驱动下表达 mCherry 红色荧光蛋白。将 5 µL 微珠悬液涂布于载玻片上，使用配备相机的荧光显微镜（10倍物镜）成像。每个红色斑点为一个荧光标记的细菌细胞，包裹在直径约为 70–250 µm 的琼脂微珠中。（B） 6 次独立制备的微珠样品中细菌载量（以 CFU/mL 表示），显示该方法具有良好的可重复性。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：感染操作的实验者间可重复性。 三名独立操作者按照前述方法，使用相同的珠子制备物，分别对10只CD-1雌性小鼠进行气管内感染。图中显示感染后24小时的肺组织菌落形成单位（CFU）计数。O1、O2、O3：分别代表操作者1、2和3。请点击此处查看该图的放大版本。
| CFU/100 μL | ||
| 微珠制备 | 试验 1 | 试验 2 |
| 1.13E+05 | 2.40E+05 | |
| 注射器推过样品 | ||
| 1 | 1.14E+05 | 5.10E+05 |
| 2 | 1.36E+05 | 4.10E+05 |
| 3 | 9.30E+04 | 3.90E+05 |
| 4 | 9.80E+04 | 3.60E+05 |
| 5 | 1.14E+05 | |
| 平均值 | 1.11E+05 | 4.18E+05 |
| 标准差 | 1.69E+04 (15%) | 6.50E+04 (16%) |
表1：经过玻璃注射器和金属饲喂针后，每100 µL样本中的菌落形成单位（CFU）。
| 试验 1 | 试验 2 | 试验 3 | |||
| 小鼠编号 | 每只小鼠肺部 CFU | 小鼠编号 | 每只小鼠肺部 CFU | 小鼠编号 | 每只小鼠肺部 CFU |
| M-1 | 6.50E+03 | M-6 | 2.20E+05 | M-11 | 6.80E+04 |
| M-2 | 1.10E+04 | M-7 | 2.70E+05 | M-12 | 1.70E+05 |
| M-3 | 1.40E+04 | M-8 | 8.10E+04 | M-13 | 2.10E+05 |
| M-4 | 3.20E+03 | M-9 | 1.40E+05 | M-14 | 4.40E+04 |
| M-5 | 4.50E+03 | M-10 | 1.30E+05 | M-15 | 7.50E+04 |
| M-16 | 1.01E+05 | ||||
| M-17 | 7.00E+04 | ||||
| M-18 | 5.80E+03 | ||||
| 平均值 | 7.84E+03 | 平均值 | 1.68E+05 | 平均值 | 9.30E+04 |
| 标准差 | 4.54E+03 (58%) | 标准差 | 7.57E+04 (45%) | 标准差 | 6.67E+04 (72%) |
表2：接种后24小时将含M. abscessus的琼脂珠植入小鼠肺部
讨论
为确保细菌在琼脂珠中均匀分布，在将熔化的琼脂-细菌混合物加入油相之前，必须将其充分混匀。油相与琼脂-细菌混合物体积之比是控制珠粒大小的关键因素。较高的油-琼脂比例会形成更小的琼脂珠。在将琼脂-细菌悬液与油相混合时，温度控制至关重要：混合物的温度必须足够高以利于乳化和液滴形成，但又不能过高以免损伤细菌。在持续搅拌下将混合物冷却至室温或更低温度，可使琼脂液滴形成并固化。
搅拌板的正确校准、搅拌子的尺寸以及烧瓶的形状和大小是形成均匀旋涡的重要决定因素。将搅拌子置于烧瓶中心可产生对称的旋涡，确保混合均匀。搅拌子偏离中心可能导致旋涡不稳定，从而产生形状不规则的微珠，并使气泡进入微珠内部。建议实时监测并调整搅拌子的位置。烧瓶的容积需与油-琼脂混合物的体积成比例。使用500 mL烧瓶旋转90 mL油-琼脂混合物最为理想，可形成可见的旋涡。当使用较大的烧瓶时，需相应调整油-琼脂混合物的体积、搅拌子的尺寸以及旋涡速度，以在有效混合与旋涡稳定之间达到平衡。在整个过程中以及不同批次微珠制备之间保持一致的旋涡速度，对于批间重复性至关重要。
琼脂珠制备过程中的涡旋速度和油-琼脂比例参照文献16,22进行，并做了少量修改。旋转涡流内部的剪切力本身会产生不同大小的珠粒。为了尽量减少这种尺寸差异，在珠粒收集步骤中引入了多次洗涤操作，采用逐渐降低离心速度和时间的梯度方法，以确保去除小尺寸珠粒（以及游离细菌）。使用微孔滤网对目标尺寸的珠粒进行富集，有效滤除较大珠粒以及可能因随机聚集而形成的珠粒。为了避免珠粒悬液在通过注射器和连接管进行小鼠气管接种过程中造成珠粒或细菌损失，必须使用玻璃注射器、24 G金属喂养针和金属连接管。
该方法的主要局限性在于微球制备和经气管接种的技术复杂性，难以实现可重复的微球负荷量和肺部植入效果。操作时需注重细节并具备排除故障的能力。此外，该模型尚未通过测试标准护理抗生素以及临床上最常用于Mab患者治疗的抗生素组合的疗效来进行充分验证。
目前，尚无慢性 Mab 感染的小鼠模型经过充分验证，能够合理地通过模型预测药物单剂或联合用药在患者中的疗效9。已有研究利用琼脂珠嵌入的 C57BL/6 小鼠系统来评估抗菌治疗的效果15,19,23。与琼脂珠嵌入的 C57BL/6 小鼠系统最接近的替代模型是 C3HeB/FeJ 小鼠模型，该模型依赖地塞米松诱导的免疫抑制以建立持久的慢性感染24,25。本文所述方案的优势在于：（i）可使用免疫功能完整的、成本最低的 C57BL/6 小鼠；（ii）可利用特征明确的标准菌株 ATCC 19977 建立有效且持续的慢性感染；（iii）无需化学诱导的免疫抑制，避免了每日注射地塞米松的需要，从而规避了潜在的药物相互作用及其对肺部免疫病理的影响。
鉴于目前缺乏经过验证的慢性Mab感染小鼠模型来评估新的候选药物和药物治疗方案8,9该技术有望推动领域发展，提高临床前疗效数据的预测价值，有助于优先筛选出最具潜力实现持久治愈的药物方案，并整体加速针对Mab肺病的药物发现与开发进程。该方法可应用于其他肺部病原体，且已有成熟的应用记录 铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌本方案的主要目标是提供充分的细节和建议，以确保易于实施以及良好的实验室间可重复性。
致谢
本工作由囊性纤维化基金会资助，授予TD和VD的奖项编号为DICK24XX0，以及美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所授予TD和VD的R01-AI132374项目。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 125 mL 瓶 | Corning | 8388 | 无菌 |
| 3 x 3 管架 | Fisher | 5972-0030PK | 使用前已消毒 |
| 3D 打印小鼠支架 | Transworld Marketing | 定制设计与生产 | 使用前已消毒 |
| 48 孔稀释板 | Celltreat | 229192 | 无菌 |
| 50 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 227261 | 无菌 |
| 麻醉机 | E-Z Systems | EZ-AF9000 SYSTEM | 不适用 |
| Avanti J-15R | Beckman Coulter | B99517 | 离心机 |
| 带掀盖架的屏障式移液器吸头 1000G | Thermo Scientific ART | 21-236-2A | 无菌 |
| 生物危害袋 | Fisherbrand | 22-044561 | |
| 连接环 | pluriSelect | 41-50000-03 | |
| 棉签 | Puritan | 22-029-571 | 无菌 |
| 一次性接种环 黄色 无菌 100 个/自封袋 | Cole-Parmer Essentials | 03-391-562 | 无菌 |
| 一次性带衬里毛巾巾单 | Dynarex | 19-310-671 | 无菌 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Thomas Scientific | 21-031-CM | 无菌 |
| 漏斗 | pluriSelect | 42-50000 | 无菌 |
| GE Ultrospec 10 | Sigma-Aldrich | GE80211630 | 分光光度计 |
| GentleMACS 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | 非热激活 |
| Hamilton 注射器 | Hamilton | 80801 | 使用前已消毒 |
| 重矿物油 | Sigma-Aldrich | 330760-1L | 无菌 |
| 异氟烷溶液 250 mL 瓶装 | Covetrus | 29405 | 皮肤腐蚀/刺激：类别 2，严重眼损伤/眼刺激：类别 2A，特定靶器官系统毒性（单次接触）：类别 3 可引起嗜睡和头晕，造成严重眼刺激，造成皮肤刺激。切勿吸入，应在通风良好处使用。 |
| M 管（gentleMACS） | Miltenyi Biotec | 130-096-335 | 无菌 |
| 磁力搅拌器 MR Hei-Connect | Heidolph | 505-40000-13-1 | |
| 磁力搅拌子 | Thomas Scientific | 1181L08 | 无菌 |
| 机械移液器 100–1000 µL–µ | Gilson PIPETMAN L | FA10006M | 使用前已消毒 |
| 机械移液器 20–200 µL–µ | Gilson PIPETMAN L | FA10003MG | 使用前已消毒 |
| 金属动物喂食针 24 G | Braintree Scientific | N-VP 24G-1S | 必须灭菌（高压灭菌） |
| Middlebrook 7H10 琼脂 | Sigma-Aldrich | M0303-500G | 已灭菌（高压灭菌） |
| Middlebrook 7H11 琼脂 | Thermo Fisher | R4554002 | 已灭菌（高压灭菌） |
| Middlebrook 7H9 培养基 | Beckton Dickinson | 271310 | 已灭菌（高压灭菌） |
| 小鼠支架部件 | TriMech Solutions | SRV-AMS-FDM | 使用前已消毒 |
| 不可吸收丝线缝合线 | Fisher Scientific | 18020-50 | 不适用 |
| 用于 Middlebrook 培养基的 OADC 液体增补剂 500 mL | Thermo Scientific Remel | R450605 | 无菌 |
| PBS (10x)，pH 7.4，无菌过滤 500 mL | Gibco | 70-011-044 | 无菌 |
| Peroxiguard 消毒湿巾 | Peroxigard | 29221 | 不适用 |
| 带透明盖的圆形培养皿 100 mm × 15 mm | Fisherbrand | FB0875712 | 无菌 |
| PluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-03 | 无菌；细胞筛 |
| 滚瓶 | Corning | 430165 | 无菌 |
| 血清移液管 | Corning | 4489 | 无菌 |
| 分光光度计比色皿 1.5 mL | Fisher Scientific | 14955127 | 已灭菌（高压灭菌） |
| 注射器塞子或夹子（尼龙） | Trimech | SRV-AMS-MJF | 使用前已消毒 |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Sigma-Aldrich | T8907-500G | 无菌 |
| Tween 80 | Fisher | 170793 | 过滤除菌 |
| 宽口带掀盖架滤芯移液器吸头 200G | Thermo Scientific ART | 21-236-1A | 无菌 |
参考文献
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