迭代漂白通过在核心设施中使用染色自动化来扩展多样性

摘要

在这里，我们描述了迭代漂白扩展多重性（IBEX）方法的应用，该方法利用市售的自动化组织染色机和基于酪胺信号放大的试剂的优化考虑因素。

摘要

迭代漂白扩展多重性 （IBEX） 是一种基于酪胺信号放大 （TSA） 的高灵敏度多轮荧光成像技术，能够通过重复漂白、重新染色和图像共配准对单个组织样本中的多种蛋白质生物分子进行详细检查。尽管 IBEX 越来越多地用于生成高度多重免疫染色，但通过在核心设施中部署以自动化方式实施 IBEX 具有许多好处，包括提高通量、可重复性和实验室工作人员的整体效率。在这里，我们展示了IBEX在两个广泛使用的自动染色平台上的成功应用，并讨论了使用基于TSA的反应对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样品进行面板设计的重要优化考虑因素。这包括测试抗体-抗原修复灵敏度的方法，这是 IBEX 组合设计在确定抗体开发顺序时的一个重要考虑因素。此外，我们还展示了利用市售全玻片扫描仪的下游成像方法，并说明了使用市售细胞表型软件进行质量比对和分析。通过对这些方法的详细描述和随附的视频，我们旨在强调 IBEX 的多功能性和易用性，为核心病理学设施将 IBEX 集成到其现有的自动染色平台中提供实用指导。

引言

迭代漂白扩展多样性 （IBEX） 是基于高灵敏度 TSA 的多轮荧光免疫组织化学的一项重大进步，可以对单个组织样本中的众多生物分子进行详细的可视化和定量。通过采用重复的漂白和再染色循环，IBEX能够以无与伦比的深度和清晰度检查复杂的细胞环境，使其成为免疫染色和多^{重成像领域的}强大工具^1,2。

许多学术、政府和行业实体都拥有核心病理学设施，致力于支持各种基于组织的研究方法，旨在生成定性和定量形态分子数据集。这些核心是关键资源，提供基于组织的专业服务，使研究实验室能够外包复杂和劳动密集型的分子病理学过程，并在研究设计、检测开发和数据解释方面直接咨询病理学家。为了确保实验的一致性并减少变异性，这些核心设施通常依赖市售的自动染色仪自动化仪器，这些仪器旨在执行具有高重现性和效率的标准化染色方案³。

虽然自动染色机已成为核心设施免疫染色的支柱，可实现高通量和一致的结果，但它们尚未适应 IBEX 等最新进展。此外，在面板设计方面需要专业知识，特别是在使用基于酪胺信号放大 （TSA） 的试剂⁴ 时，增加了额外的复杂性，限制了 IBEX 在常规研究工作流程中的更广泛采用。因此，希望利用 IBEX 高分辨率多路复用成像功能的研究人员通常可能会受到其核心设施现有设备的限制。创新成像技术与核心设施运营的实际现实之间的差距凸显了 IBEX 在学术研究中更广泛采用的障碍。这项工作旨在通过展示 IBEX 在常见自动染色平台上的成功应用来解决这一障碍，重点是使用福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织的基于 TSA 的试剂。我们首先讨论使用基于TSA的染料构建IBEX组合的必要步骤，以及将这些组合覆盖应用于两种不同的市售自动染色剂。总之，这为抗体抗原修复灵敏度测试提供了实用指导，讨论了优化面板设计的关键考虑因素，并提供了一种使用可能可用的商业软件和核心病理学实验室进行面板对齐的替代方法。

方案

1. 使用基于TSA的染料构建IBEX面板

注意：始终使用新鲜的抗体和染料制备，不使用时储存在 4 °C 下。

1. 抗原修复敏感性测试
   1. 载玻片的制备
      1. 使用切片机为每种抗体收集三个连续切片，以从相同的FFPE包埋组织在三个单独的带正电荷的载玻片上进行测试。
      2. 用待测抗体标记载玻片，以及待测抗原修复周期数：1 个周期、3 个周期和 6 个周期。
      3. 在室温下干燥载玻片过夜。如果仅使用表面标记，请在 60 ^°C 下烘烤载玻片至少 20 分钟以软化蜡。如果使用核标记，请将载玻片在 60 ^°C 下烘烤过夜。
   2. 在自动染色机上准备不同循环次数的程序，确保每个步骤之间有三个洗涤步骤。参见 表 1 ，了解 1、3 和 6 循环测试的示例协议。
      注意：对于每种单独的抗体，确保抗体步骤和 TSA 染料应用的时间一致。
      对于基于 TSA 的染料应用，让染料在室温下静置 3-10 分钟的替代方法是让染料在 37 °C 下孵育 20 分钟。
   3. 将样品加载到自动染色机上，并运行相关循环次数的方案。
   4. 对要验证和测试的每个抗体重复从步骤 1.1.1 到 1.1.3 的此过程。
   5. 从自动染色器中取出载玻片并将它们放入PBS中。
   6. 使用水性封片介质（与 IBEX 子弹相同）和 #1.5 盖玻片安装载玻片，以获得最佳成像效果。
   7. 使用落射荧光显微镜对 TSA 染料和 DAPI 的 1 个循环载玻片进行成像，记下可视化信号所需的曝光时间。
   8. 对 3 个循环和 6 个循环载玻片重复此作，注意可视化 TSA 染料所需的曝光时间。
   9. 比较不同循环数的曝光时间。有关示例，请参见 图 1 。确保所有步骤之间有三个洗涤周期。
      1. 如果暴露时间随着周期的增加而减少，请在稍后的步骤中放置该抗体和染色。
      2. 如果暴露时间随着周期的增加而增加，请将该抗体放在较早的步骤中。
      3. 如果暴露时间没有太大变化，则将该抗体放置在任何步骤。
      4. 根据 IBEX 面板初始通过的周期要求对抗体进行分组。
         注意：为获得最佳结果，请对给定 IBEX 面板的所有所需标记执行此验证。每次改变组织类型或使用具有唯一批号的多克隆一抗时，都执行此验证。
2. 通过评估信号强度来解决来自光谱附近染料的信号渗漏问题。
   1. 根据最佳检索周期数将抗体分组到潜在的 IBEX 组合中，如上所述，分为 1、3 或 6 个周期组。
   2. 载玻片的制备
      1. 使用切片机从 FFPE 样品中创建连续切片，每个抗体一个用于单个 IBEX 组合。
      2. 用一种用于 IBEX 组合的抗体标记每张载玻片。
      3. 让载玻片在室温下干燥过夜。如果仅使用表面标记，请让载玻片在 60 ^°C 下烘烤至少 20 分钟以软化蜡。如果使用核标记，请让载玻片在 60 ^°C 下烘烤过夜。
   3. 对于 1、3 和 6 循环组，请使用表 1 中的单循环设置。确保在所有步骤之间进行三次洗涤
      1. 修改每种抗体的方案，以最佳染色时间使用。
      2. 对所有抗体使用相同的 TSA 时间。
   4. 在自动染色机上染色样品。
   5. 取出样品并将载玻片放入PBS中。
   6. 使用水性封片介质（与 IBEX 子弹相同）和 #1.5 盖玻片安装载玻片，以获得最佳成像效果。
   7. 在落射荧光显微镜上使用每张图像的最佳曝光时间对载玻片进行成像。
   8. 确定信号强度。曝光时间短的幻灯片信号强度非常高，而曝光时间长的幻灯片信号强度低。
   9. 使用信号强度和周期数来开发 IBEX 面板。
      1. 根据周期数对抗体进行分组。
      2. 对于具有特定循环数的给定一组抗体，确保强信号在光学上不接近弱信号，以尽量减少信号溢出。
3. 验证各个 IBEX 面板，以确保每个面板都能产生所需的结果。
   1. 准备幻灯片。
      1. 使用切片机创建连续切片，每个多重 IBEX 面板一个，并标有要使用的 IBEX 面板顺序。
      2. 让载玻片在室温下干燥过夜。如果仅使用表面标记，请让载玻片在 60 ^°C 下烘烤至少 20 分钟以软化蜡。如果使用核标记，请让载玻片在 60 ^°C 下烘烤过夜。
   2. 设置自动染色器。
      1. 对于第一个面板，设置自动染色程序，无需额外的抗原修复步骤。
      2. 对于第二个面板，在第一个抗体之前引入额外的变性步骤，等于第一个面板中的变性步骤数。对于具有五种抗体的示例组合 1，请参阅 表 2 ，对于具有四种抗体的示例组合 2，请参阅 表 3 。确保在所有步骤之间进行三个洗涤步骤。
      3. 根据需要对其他 IBEX 面板重复此作，添加更多变性步骤。
   3. 从自动染色机中取出载玻片并将它们放入 PBS 中，直到准备好安装。
   4. 使用水性封片介质（与 IBEX 子弹相同）和 #1.5 盖玻片安装载玻片，以获得最佳成像效果。
   5. 使用每张图像和每种 TSA 染料的最佳曝光时间在落射荧光显微镜上对载玻片进行成像。
   6. 评估所有面板是否正确显示。如果是这样，请转到 IBEX 成像。如果没有，请重新解决信号平衡和检索周期。
      注意： 可以在单个面板内进行一些调整，以优化信号并防止“雨伞效应”。一些高度丰富的信号可以阻断下游信号的染色。在给定的面板内查看，首先使用更稀疏的染色剂（见 图 2）。

2. 使用TSA试剂和全玻片成像平台与自动染色机进行IBEX适应（图3）

注意：有关本协议中使用和讨论的两种经过验证的自动染色剂的比较，请参见 表 4。

1. 准备 IBEX 运行的所有幻灯片。
   1. 使用切片机在带正电的载玻片上创建FFPE切片。确保为每个实验样品包括一张载玻片，已知含有要成像的抗原的组织切片的阳性对照载玻片，以及使用PBS代替所有一抗的阴性对照载玻片。
      注意：如果分批工作，请包括批次对照样品。批次对照样品是单个FFPE组织块，被切片并包含在每批实验样品中，用于归一化和控制批次染色样品之间的实验变化。仅当并非所有样品都一起处理时，才需要这样做。
   2. 让载玻片在室温下干燥过夜。如果仅使用表面标记，请让载玻片在 60 ^°C 下烘烤至少 20 分钟以软化蜡。如果使用核标记，请让载玻片在 60 ^°C 下烘烤过夜。
2. 为第一个要成像的 IBEX 组合制备抗体和染料。
3. 设置自动染色程序。有关 5 标记面板的示例，请参见 表 2 。确保每步之间洗涤三次。
4. 将样品和抗体加载到自动染色仪中，并运行程序对样品进行染色。
5. 从自动染色器中取出载玻片，并使用适用于多光谱成像的水性封片介质和#1.5盖玻片涂上盖玻片。
6. 在染色后 2 天内对载玻片进行成像
7. 落射荧光或荧光载玻片扫描仪上的荧光成像
   1. 从控制良好的阳性对照样品开始，将阳性对照样品加载到显微镜中。
      1. 在样品中找到要成像的每种不同抗原的阳性信号。
      2. 设置曝光时间以确保捕获污渍的动态范围，同时通过从低曝光开始逐渐增加曝光时间直到出现信号来最大限度地减少背景。对每种染料单独执行此作。
         注意：测试标记物是否存在高表达和低表达，以确保捕获完整的动态范围。
   2. 保存用于阳性对照样品的设置，并将其用于所有进一步的成像步骤。
   3. 使用阳性对照样品确定的设置加载阴性对照样品和所有实验样品并对其进行成像。
   4. 在继续后续步骤之前，请验证图像是否具有最佳质量。
8. 盖玻片去除
   1. 将载玻片浸入装有去离子水的 Coplin 罐中。将 Coplin 罐放入设置为 65 °C 的水浴中 15-20 分钟，以促进盖玻片的自然去除。或者，如果使用水基封片剂或封片剂已完全硬化，则通过在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或去离子水中浸泡过夜来去除盖玻片，让盖玻片自然脱落。
9. 用 LiBH₄ 漂白
   1. 在通风橱中，制备浓度为 1mg/mL 的 LiBH₄ 去离子水新鲜溶液。制作足够的量来覆盖每个样品 3 倍。
      注意：由于 LiBH₄ 与水反应，一次制备不要超过 10 mL。使用去离子水而不是毫孔/纳米纯水以获得最佳漂白活性。
   2. 让溶液静置20分钟。会形成气泡。
   3. 将 1 mL LiBH₄ 溶液移液到通风橱染色室中的每张载玻片上。让溶液在载玻片上静置 10-15 分钟。
   4. 通过移液载玻片取出 LiBH₄ ，并用新鲜的 1 mL LiBH_{4 替换。} 让溶液静置10-15分钟。
   5. 通过移液载玻片取出 LiBH₄ ，并用新鲜的 1 mL LiBH_{4 替换。} 让溶液静置10-15分钟。
   6. 通过移液从载玻片中取出 LiBH₄ ，并将载玻片浸入去离子水或 PBS 中进行短期储存（不超过 1 天）。
   7. 一天之内，进入下一轮 IBEX 染色。
   8. 可选：湿式安装载玻片并在落射荧光示波器上进行快速可视化，以验证漂白成功。
10. 将载玻片湿式安装到自动染色机中，并进行第二次 IBEX 染色运行
    1. 为自动染色机准备所有抗体和 TSA 染料溶液。
    2. 对于 Ventana 自动染色机：
       1. 当准备好开始自动染色时，将大约 1 mL 的自动染色洗涤缓冲液移液到载玻片上，以防止湿式安装座变干。
       2. 将湿安装的载玻片装入自动染色机中。
    3. 对于 Bond Rx：
       1. 将盖板放在幻灯片上。
       2. 在盖板顶部，移液 300 μL 洗涤缓冲液，让溶液流入样品和盖板之间的空间。
       3. 将样品加载到自动染色机上。
    4. 按照 表 2 中的示例设置自动染色程序，将 N 设置为组合中的抗体数量。
    5. 从自动染色器中取出载玻片，并使用适用于多光谱成像的水性封片介质和#1.5盖玻片涂上盖玻片。
    6. 按照步骤2.7中描述的样品程序，在染色后2天内对载玻片进行成像，以设置成像会话和收集图像。
    7. 成像后，按照步骤2.8-2.9中所述漂白样品。
11. 对所需的所有 IBEX 面板重复此作。

3. 使用市售软件分析样品

1. 在进行对齐之前，完成染色载玻片的整张载玻片扫描。
2. 如果软件允许，通过扫描功能内置的自动解混功能执行光谱解混，包括去除自发荧光光谱。如果这是正在使用的软件的功能，请选择解混选项并使用标准设置和预设染料运行
   注意：大多数允许取消混合的软件都可以生成自定义取消混合。为了创建文库，将用单个荧光团染色的单个组织切片添加到软件的测量中。还扫描未染色或自发荧光组织的区域以表征自发荧光光谱，并使用自发荧光工具进行选择。这些光谱通过点击“准备图像”在程序中编译，然后导出到特定于项目的解混库。然后在取消混合选项中选择此库作为取消混合库。
3. 将扫描的载玻片导入市售的图像分析软件进行对齐。
4. 多轮 IBEX 轮次的幻灯片注册
   1. 选择要注册的 IBEX 轮次的两次迭代。
   2. 右键单击两个并选择 注册 选项。
   3. 选择“ 具有高分辨率注册的默认注册 ”以进行初始注册。
   4. 或者，从选项中选择“ 单通道注册” ，然后选择在所有 IBEX 运行中保持一致的单个通道。
      注意：此选项对于耐漂白的染料很有用（参见染料不漂白的材料）。
5. 图像对齐
   1. 打开其中一张已注册的图像。
   2. 在 “工具” 选项卡的 “图像注册”下，选择 “注册工具” 以打开所有已注册的图像。
   3. 在 注册工具 选项卡中，选择 地标功能。
   4. 使用 地标 功能微调整个幻灯片的对齐方式。
      1. 手动在一张幻灯片图像上标记地标。
      2. 在其他 IBEX 图像上，标记相同的地标。程序将使用已识别的地标细化路线。重复此作以微调对齐方式。
   5. 对对齐感到满意后，使用 Fuse |串行染色功能。
   6. 对任何其他 IBEX 成像轮次重复此过程，直到完成所有图像的最终合成。
6. 图像分析
   1. 细胞分割
      1. 在“ 分析 ”选项卡下，选择并打开 HighPlex 模块，然后选择用于细胞鉴定的 表型模块 。
         1. 加载所有标记，然后首先使用 Highplex 模块中的核检测选项卡查找所有细胞核。在“染料选择”选项卡中加载标记。使用 DAPI 染色剂识别细胞。
         2. 在 “分析 ”选项卡中，使用以下关键参数打开“ 实时调谐”工具 ：设置为滤除背景信号的“最小核强度”;最大图像亮度设置为控制整体信号可见性;核分割侵略性设置为细化检测到的原子核的边界。
         3. 仔细调整每个参数以确保准确分割。
   2. 检测细胞质和膜标志物。
      1. 导航到膜 和细胞质检测 选项卡。
      2. 将 最小细胞质半径 设置为适合样品的值，以达到预期的细胞大小。
      3. 在 “膜染料 ”选项下，指定哪些通道是膜标记。
         注意：这应该可以更好地分割单个细胞以进行进一步分析。
   3. 标记阈值和表型分配
      1. 对于每个标记，设置正信号与负信号的阈值。在为每个标记生成的选项卡下执行此作。
      2. 对每个标记进行手动阈值以识别群体。
      3. 或者，使用基于生物信息学的自动化阈值方法。在 高级 |存储对象（单元格）数据，将该选项切换为 True。导出中 |对象数据，导出数据集以获取每个已识别单元格的标记表达式信息。
      4. 将这些数据导入到其他软件中，以进行进一步的定制分析。用于进一步分析的软件选项见 表 5。

结果

我们提供了一个在Autostainer 2上使用基于TSA的试剂的IBEX组合的示例（图4）。每个标记都可以清晰地划定，并且标记之间的渗漏最小。图像是通过两轮染色收集的。样本是 感染结核分枝杆菌后的肺组织。使用市售软件示例对两个 IBEX 染色面板进行对齐。使用带有优化的 TSA 试剂（如此处所述）的 IBEX 方法，可以看到和欣赏免疫细胞、炎症标志物和特殊肺细胞的空间组织。适当的优化允许标记以最少的背景轻松出现。

图 1：使用发射 520 nm 两种不同抗原的荧光团进行抗原修复测试。 使用保守的暴露时间对 RAGE 和 CD3e 进行成像。这种 RAGE 抗体的表位高度敏感，容易受到重复抗原修复的影响，随着随后的抗原修复，检测灵敏度会迅速下降。相反，CD3e 测定灵敏度随着多轮抗原修复而提高。比例尺 = 50 μm。缩写：RAGE = 晚期糖基化终产物受体。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：序列开发相对于伞效应的重要性示例。 RAGE 是 AT1 细胞中高表达的标志物，与 CD31 结合可有效阻断 SARS-CoV-2 免疫反应性。然而，当首先进行 SARS-CoV-2 IHC 时，所有信号都可以可视化。比例尺 = 25 μm。缩写：RAGE = 晚期糖基化终产物受体;AT1 = 肺泡 1 型;SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2;IHC = 免疫组织化学。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：使用 IBEX 协议自动染色设备的过程概述。 湿式安装用于第 2 轮或更高级别的染色过程，以防止组织变干。缩写：IBEX = 迭代漂白扩展了多重性。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：IBEX 在感染 结核分枝杆菌的肺部使用来自自动染色剂 2 的 TSA 染料的示例。 图 1 包含所有染料，图 2 包含可漂白的染料。显示肺部图像完整 IBEX 中所有通道的合并图像。比例尺 = 200 μm。缩写：IBEX = 迭代漂白扩展了多重性;TSA = 酪胺信号放大。 请点击此处查看此图的大图。

表 1：用于验证循环数对 1、3 和 6 周期测试抗体影响的示例方案。请按此下载此表。

表 2：用于面板验证的 IBEX 自动染色机的五种抗体的示例面板 1。请按此下载此表。

表 3：示例面板 2，其中包含用于用于面板验证的 IBEX 自动染色器的四种抗体。请按此下载此表。

表4：两种自动染色剂的比较。 总结了 Ventana Autostainer 和 Bond Rx 优缺点的表格。 请点击此处下载此表。

表 5：图像分析的软件摘要。 表格总结了一些可用于分割后图像分析的分析方法和软件工具。 请按此下载此表。

讨论

在这里，我们提供了通过应用自动染色设备和优化 IBEX 协议中基于 TSA 的试剂，将 IBEX 协议调整到核心病理设施中的注意事项。我们演示了如何最好地优化反复轮次的抗原修复和第 2 轮或更高级别的正确加载到自动化设备上。此外，我们还演示了一种使用核心设施中可能提供的 Halo 软件执行对齐的另一种方法。这些方法已被证明可用于确定 SARS-CoV-2 感染后非人灵长类动物组织肺部环境的差异⁵。

这项工作的一个关键组成部分是强调在实验组织染色之前对 IBEX 面板设计进行广泛优化的必要性。特别是，在使用基于 TSA 的试剂时，必须考虑基本 IBEX 方法中未看到的一些注意事项。首先是多轮抗原修复对抗体敏感性的影响。使用基于 TSA 的试剂，每次新的抗体开发之前都会发生抗体变性。一些抗体/抗原对将容易受到额外几轮抗原修复的影响并降低测定灵敏度，而有些抗体/抗原对将通过重复变性/抗原修复获得增强的灵敏度。在设计组合之前，仔细测试靶组织中的每种抗体对于确保最佳染色实践并告知抗体和荧光染料的序列顺序非常重要。对缓冲液（包括柠檬酸盐基 （pH 6.0）和基于 Tris-EDTA 基 （pH 9.0） 的缓冲液进行所有抗体测试，以确定最佳抗原修复条件。这涉及系统地评估每种缓冲液，以确定哪一种缓冲液可以最大限度地提高给定抗体的抗原暴露量。此外，优化温度（例如，20-37 °C）、孵育时间（通常为 30-60 分钟）和封闭条件，以减少非特异性背景染色并确保一抗和二抗的特异性结合（如有必要）。在一抗和二抗之前进行封闭可能包括使用市售的封闭试剂来解释组织特异性自发荧光或非特异性相互作用。在最终确定 IBEX 面板之前必须优化的其他重要考虑因素包括伞效应，如果顺序不满足所提出的特定研究问题，则可能会发生表位屏蔽⁶。为避免荧光渗漏，通常将高表达的抗原靶标放入480-520 nm范围内渗漏最少、标记较弱的远红通道中，鉴于这些荧光染料是最亮的⁷，因此具有最佳的信噪比。然而，应注意在此范围内可能最亮的高度自发荧光组织样品;我们建议通过不使用任何染料对组织进行成像来解决这个问题，以解决潜在的自发荧光水平。这些优化步骤与通常使用 IBEX 完成的所有正常优化和控制一起进行，可以为使用 TSA 试剂的 IBEX 的正确组合设计提供信息。

在这种方法中，我们演示了两种常见的自动染色剂的使用。然而，这些方法也可以应用于其他自动染色方法。这里的关键部分是最佳去除盖玻片和额外染色轮的湿载荷。此外，我们没有指定任何特定的显微镜设置。尽管试剂盒可能建议与某些成像系统一起使用以获得最佳载玻片扫描，但任何显微镜设置，特别是带有兼容滤光片立方体和广谱 LED 光源的落射荧光显微镜，都应该有效。有些染料需要多光谱检测器或专门的滤光片立方体，这些可能并非在所有实验室中都可用，并且由于光谱重叠，与标准滤光片立方体一起使用时可能会带来挑战。使用多光谱成像系统或高度特异性的滤光片可以更好地分离这些染料。一些荧光团超出了传统远红滤光片（通常为 ~700 nm）的范围，需要能够捕获近红外信号的专用滤光片立方体或检测器。专用显微镜是用这些滤光片制造的，但也有替代品。这些需要额外的优化，以确定染料在给定显微镜配置中的表现。

强烈建议对多重荧光 IHC 进行多光谱解混，特别是在处理容易发生自发荧光的组织时，因为它可以有效地将真实信号与背景噪声分离。自发荧光通常与常用荧光团的发射光谱重叠（特别是在更高能量波长的通道中），可能会遮挡或干扰特定信号，从而降低准确性。光谱解混在数学上解开重叠的发射光谱，分离出真实的荧光信号，同时“清理”不需要的自发荧光。光谱解混在 IBEX 工作流程中特别有价值，由于染色和成像过程的迭代性，获得尽可能干净的信号至关重要。在 IBEX 中，来自多轮染色的信号被成像、漂白并堆叠在一起以创建合成图像。任何在一轮中仍未解析的自发荧光或渗漏都可以通过堆叠图像传播，使下游分析复杂化并降低标记定位的可信度。光谱解混可有效地将真实荧光信号与背景自发荧光隔离开来，确保在每一轮中检测出更清晰、更准确的信号。这种信号清晰度对于生成可靠的复合图像至关重要，其中多个标记物在轮次中一起分析，从而实现可靠的表型分析和空间分析。用于该协议的成像平台具有板载解混功能，但需要更多的解混选项才能与其他荧光全载玻片成像平台兼容。

此外，这项工作的局限性是自动染色剂的专有性质，因为它们的相关试剂和洗涤缓冲液针对这些系统进行了优化，但具体配方仍未公开。此外，我们只专注于一种用于全玻片图像分析的市售图像分析软件，并承认软件许可证的成本可能会给某些实验室带来财务障碍。其他分析软件 ^8,9 和 R 中的选项似乎很有前途;特别是 Bodenmiller Group¹⁰，他们创建了一个似乎最适合内核的包集，因为 IMCDataAnalysis¹¹ 旨在用于 R 中多路复用图像下游分析的可重复工作流程。然而，未来需要努力开发和表征可访问且具有成本效益的全玻片 IBEX 分析替代方案，以确保在资源有限的环境中更广泛地采用。此外，这种使用IBEX自动染色器的方法可以适用于IBEX中更传统的染色，包括使用荧光偶联一抗，或者如果组织具有足够高的质量和最佳的固定时间以允许良好的信号，则使用不含TSA染料的标准二抗。

总的来说，我们希望这项工作将有助于使用常规使用的病理学核心设施设备应用基于TSA的多重荧光IHC，以更广泛地使IBEX适应这些环境。这种类型的应用真正凸显了 IBEX 方案的多功能性，并展示了其在困难组织样本或大批量方法中的实用性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
染色试剂 Alexa TSA套件	热扑鱼		如果没有蛋白石显微镜滤镜，可以选择替代的TSA染料。包括Alexa Fluor 488（蓝绿通道）、Alexa Fluor 555或568（红通道）、Alexa Fluor 647（远红通道）、Alexa Fluor 750（近红外，若配备适当滤镜）。nbsp;
抗体 Arg1	细胞信号传导	93668	图4中1：100处的使用情况
材料 刀刃	徕卡生物系统		或者类似，高低的结构取决于组织类型
抗体 CD11b	阿布卡姆	AB133357	图4中1：2000处的使用情况
抗体 CD163	阿布卡姆	ab182422	图4中1：500处的使用情况
抗体 CD31	细胞信号传导	77699S	图2 1：100处的使用情况
抗体 CD3e	达科	A045201-2	图1 1：100处的使用情况
工具 科普林罐	费舍尔科学	01-816-21	或类似情况
材料 覆盖滑	VWR	V48393-026	或类似情况
抗体 CX3CR1	阿布卡姆	AB308613	图4在1：450处使用
染色<> DAPI	阿古谷	FP1490
Software FIJI			用于测量信号强度
Slide Fisher超前滑梯	费舍尔科学	22-037-246	或者类似的
软件 HALO	印迪卡实验室		市面上可用的图像分析软件示例。用于对齐和分析图像。
抗体 Iba1	细胞信号传导	17191	图4在1：800处使用
Software inForm	阿古谷		用于测量信号强度
抗体 iNOS	阿布卡姆	AB283655	图4中1：400处的使用情况
仪器 徕卡粘胶处方（或RXm）	徕卡生物系统	21.2201	文本中称为“Autostainer 1”。确保所有相关试剂也都备齐，包括染色盒和散装溶液。
试剂 LiBH4	西格玛-奥尔德里奇	62460-5G-F	保持在无水环境中
乐器 咒语响指	阿古谷		需要多光谱荧光显微镜来鉴定染料。示例显微镜可用于检测蛋白石染料。
工具 切片机	徕卡生物系统		或者类似的，但配上更喜欢的配件，比如刷子
染色试剂 Opal IHC 480套件	阿古谷	FP1500001KT	图4中的使用
染色试剂 Opal IHC 6-plex 套件	阿古谷	NEL821001KT	520和620不漂白，图1、2和4中使用
染色试剂 Opal IHC 780套装	阿古谷	FP1501001KT	图4中的使用
工具<热/>烤箱	米利波尔西格玛	Z683329	或者类似的，也可以在自动污渍上完成
抗体 全细胞角蛋白	阿布卡姆	AB9377	图4中1：50处的使用情况
试剂 PBS（可选）	费舍尔科学	AAJ61196AP
仪器 表型成像仪	阿古谷		软件中包含多光谱全片影像，并集成了内置光谱去混合功能
试剂 ProLong 金防褪入剂	费舍尔科学	P36961	或者类似的水相附介质
抗体 ProSP-C n端（ProSPC）	七山生物试剂	WRAB-9337	图4在1：250处使用
抗体 RAGE	R&D	MAB1179	图1和图2中1：50的使用情况
试剂 反应缓冲液	罗 氏	NC1895692	用于Ventana自动染色
抗体 SARS-CoV-2-N	细胞信号传导	68344	图2 1：1000处的使用
载玻片 TOMO 粘附 CC 显微镜载玻片-WH	前锋	SKUSL6519-1	如果组织附着性是个问题
仪器 Ventana Discovery Ultra	罗 氏		文中称为“Autostainer 2”。确保所有相关试剂也都备齐，包括染色盒和散装溶液。
试剂 洗涤缓冲剂	徕卡生物系统	AR9590	用于徕卡邦德自动染色机
试剂 水	费舍尔科学	15-230-147	DI最好，而不是千层
工具 水浴	徕卡生物系统	140607020C1	或类似情况