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迭代漂白结合染色自动化技术扩展核心设施中的多重检测能力

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DOI：

10.3791/67853

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2025年8月6日

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1National Emerging Infectious Diseases Laboratories (NEIDL), Boston University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, 3Department of Virology, Immunology and Microbiology, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, 4Florida Research and Innovation Center, Cleveland Clinic Foundation

本文内容

摘要

本文介绍了迭代漂白扩展多重性（IBEX）方法的应用，该方法利用市售的自动化组织染色仪，并针对基于酪酰胺信号放大技术的试剂在使用过程中的优化因素进行了探讨。

摘要

迭代漂白扩展多重性（IBEX）是一种高灵敏度的基于酪胺信号放大（TSA）的多轮荧光成像技术，通过反复进行漂白、重染色和图像共定位，可在单个组织样本中对多种蛋白质生物标志物进行详细分析。尽管该技术在实现高度多重免疫染色方面正被日益广泛采用，但在核心设施中以自动化方式实施IBEX可带来诸多优势，包括提高通量、增强可重复性以及提升实验室人员的整体工作效率。本文展示了IBEX在两种广泛应用的自动染色平台上的成功应用，并讨论了针对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本使用基于TSA反应进行抗体组合设计时的重要优化考量。这些内容包括测试抗体与抗原修复敏感性的方法学，这是在确定抗体开发顺序时进行IBEX抗体组合设计的重要考虑因素。此外，我们还展示了利用市售全片扫描仪进行的下游成像方法，并使用市售细胞表型分析软件演示了高质量的图像对齐与分析。通过这些方法的详细描述及配套视频，我们旨在突出IBEX技术的灵活性与操作便捷性，为核心病理实验室将其整合到现有自动化染色平台提供实用指导。

引言

迭代漂白扩展多重性（IBEX）是基于高灵敏度TSA的多轮荧光免疫组织化学技术的一项重大进展，能够在单个组织样本中实现多种生物分子的详细可视化与定量分析。通过反复进行漂白和重染色循环，IBEX能够以前所未有的深度和清晰度解析复杂的细胞微环境，使其成为免疫染色和多重成像领域中一种强大的工具1,2。

许多学术机构、政府机构和行业单位设有核心病理学平台，致力于支持多种基于组织的研究方法，旨在生成定性和定量的形态分子数据集。这些平台是重要的资源，可提供专业的组织学服务，使研究实验室能够将复杂且耗时的分子病理学流程外包出去，并在实验设计、检测方法开发和数据分析方面直接咨询病理学家。为了确保实验结果的一致性并减少实验间变异，这些核心设施通常依赖 commercially available autostainers——即设计用于执行标准化染色方案的自动化仪器，具有高度可重复性和高效性3。

尽管自动染色机已成为核心设施中免疫染色的支柱，能够实现高通量和结果的一致性，但其尚未适应诸如IBEX等较新的技术进展。此外，在使用基于酪胺信号放大（TSA）的试剂时，对多联抗体组合设计需要具备专业知识4，这进一步增加了复杂性，限制了IBEX在常规研究流程中的广泛应用。因此，希望利用IBEX高分辨率、多重成像能力的研究人员，往往受限于其核心设施现有的设备条件。这种创新成像技术与核心设施实际运行之间的差距，凸显了IBEX在学术研究中广泛采用所面临的一个障碍。本研究旨在通过展示IBEX在常见自动染色平台上的成功应用，来克服这一障碍，重点探讨使用基于TSA的试剂对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织进行染色的可行性。我们首先介绍构建基于TSA染料的IBEX多联抗体组合所需的关键步骤，并展示这些组合在两种不同商用自动染色机上的覆盖性应用。整体内容为抗体-抗原修复敏感性测试提供了实用指导，讨论了优化多联抗体组合设计的关键考量因素，并提供了一种利用商业软件进行组合校准的替代方法，该软件可能已在核心病理实验室中配备使用。

方案

​1. 使用基于TSA的染料构建IBEX面板

注意：始终使用新配制的抗体和染料，并在不使用时于 4 °C 保存。

  1. 抗原修复敏感性测试
    1. 切片制备
      1. 使用切片机从同一石蜡包埋（FFPE）组织中连续切取三张切片，分别用于每种待测抗体，并将它们分别贴附于三个带正电荷的载玻片上。
      2. 在载玻片上标记待测抗体名称以及拟进行的抗原修复循环次数：1次循环、3次循环和6次循环。
      3. 将切片在室温下干燥过夜。若仅检测表面标志物，则在60 oC下烘烤至少20分钟以软化石蜡；若检测核内标志物，则在60 oC下烘烤过夜。
    2. 在自动染色仪上设置不同循环次数的程序，确保每一步之间包含三次洗涤步骤。1次、3次和6次循环测试的示例方案参见表1。
      注意：针对每种单个抗体，应保持抗体孵育时间和TSA荧光染料应用时间的一致性。
      ​对于基于TSA的染料应用，除在室温下静置3-10分钟外，也可选择在37 °C下孵育20分钟。
    3. 将样本加载至自动染色仪，并运行对应循环次数的程序。
    4. 对每种需验证和测试的单个抗体，重复步骤1.1.1至1.1.3。
    5. 从自动染色仪中取出切片并将其置于PBS中。
    6. 使用水溶性封片剂（与IBEX轮次所用相同）和#1.5盖玻片封片，以获得最佳成像效果。
    7. 使用落射荧光显微镜对1次循环的切片进行TSA染料和DAPI成像，记录可视化信号所需的曝光时间。
    8. 对3次循环和6次循环的切片重复上述成像过程，记录可视化TSA染料信号所需的曝光时间。
    9. 比较不同循环次数下的曝光时间。示例参见图1。确保所有步骤之间进行三次洗涤。
      1. 若曝光时间随循环次数增加而减少，则将该抗体及其染色安排在后续步骤中。
      2. 若曝光时间随循环次数增加而增加，则将该抗体安排在较早步骤中。
      3. 若曝光时间无显著变化，则该抗体可安排在任意步骤。
      4. 根据循环需求对抗体进行分组，用于IBEX面板的初步设计。
        注意：为获得最佳结果，应对特定IBEX面板中所有目标标志物进行此验证。每次更换组织类型或使用不同批次号的多克隆一抗时，均应重新进行此验证。
  2. 通过评估信号强度，解决光谱邻近染料之间的信号串扰问题。
    1. 根据前述确定的最佳抗原修复循环次数（1次、3次或6次循环组），将抗体分组为潜在的IBEX面板。
    2. 切片制备
      1. 使用切片机从FFPE样本中连续切取切片，每种抗体对应一张切片，用于单个IBEX面板。
      2. 在每张切片上标记IBEX面板中拟使用的单个抗体名称。
      3. 将切片在室温下干燥过夜。若仅检测表面标志物，则在60 oC下烘烤至少20分钟以软化石蜡；若检测核内标志物，则在60 oC下烘烤过夜。
    3. 对于1次、3次和6次循环组，使用表1中的单循环设置。确保所有步骤之间进行三次洗涤
      1. 根据每种抗体的最佳染色时间调整染色程序。
      2. 所有抗体使用相同的TSA染色时间。
    4. 在自动染色仪上对样本进行染色。
    5. 取出样本并将切片置于PBS中。
    6. 使用水溶性封片剂（与IBEX轮次所用相同）和#1.5盖玻片封片，以获得最佳成像效果。
    7. 使用落射荧光显微镜对切片进行成像，每张图像采用最佳曝光时间。
    8. 确定信号强度：曝光时间短的切片信号强度高，曝光时间长的切片信号强度低。
    9. 结合信号强度和循环次数设计IBEX面板。
      1. 根据循环次数对抗体进行分组。
      2. 对于具有特定循环次数的一组抗体，应确保强信号与弱信号在光学上不相邻，以最小化信号溢出。
  3. 验证各个IBEX面板，确保每个面板均可实现预期结果。
    1. 制备切片。
      1. 使用切片机连续切取切片，每个多重IBEX面板对应一张切片，并标记其IBEX面板顺序。
      2. 将切片在室温下干燥过夜。若仅检测表面标志物，则在60 oC下烘烤至少20分钟以软化石蜡；若检测核内标志物，则在60 oC下烘烤过夜。
    2. 设置自动染色仪。
      1. 对于第一个面板，在自动染色仪程序中不添加额外的抗原修复步骤。
      2. 对于第二个面板，在第一个抗体之前引入额外的变性步骤，其数量等于第一个面板中的变性步骤总数。示例参见表2（含五种抗体的面板1）和表3（含四种抗体的面板2）。确保所有步骤之间进行三次洗涤。
      3. 根据需要为其他IBEX面板重复此操作，逐步增加更多变性步骤。
    3. 从自动染色仪中取出切片，并置于PBS中直至准备封片。
    4. 使用水溶性封片剂（与IBEX轮次所用相同）和#1.5盖玻片封片，以获得最佳成像效果。
    5. 使用落射荧光显微镜对切片进行成像，每张图像和每种TSA染料均采用最佳曝光时间。
    6. 评估所有面板是否正常显示。若是，则进入IBEX成像阶段；若否，则需重新调整信号平衡和抗原修复循环次数。
      注意：可在单个面板内进行某些调整以优化信号并防止"伞状效应"。某些高丰度信号可能阻碍后续信号的染色。应检查特定面板内染色分布较稀疏的标志物优先使用（参见图2）。

2. 使用TSA试剂和全切片成像平台在自动染色仪上进行IBEX方法的改进（图3）

注意：有关本方案中使用和讨论的两种经验证的自动染色机的比较，请参见表4。

  1. 准备所有用于 IBEX 运行的载玻片。
    1. 使用切片机在带正电荷的载玻片上制备 FFPE 切片。确保为每个实验样本准备一张载玻片，同时包括已知含有待成像抗原的组织切片作为阳性对照，以及用 PBS 替代所有一抗的阴性对照载玻片。
      注：若分批操作，需包含一个批次对照样本。批次对照样本是指一个单一的 FFPE 组织块，在每批实验样本中均进行切片并加入，用于染色样本批次间变异的归一化和对照。仅当并非所有样本将同时处理时才需要此步骤。
    2. 将载玻片在室温下干燥过夜。若仅检测表面标志物，将载玻片在 60 oC 下烘烤至少 20 分钟以软化石蜡；若检测核内标志物，则在 60 oC 下烘烤过夜。
  2. 准备第一轮 IBEX 面板的抗体和染料，用于成像。
  3. 设置自动染色程序。参见 表 2 中一个 5 标志物面板的示例。确保每一步之间进行三次洗涤。
  4. 将样本和抗体加载至自动染色仪中，并运行程序以对样本进行染色。
  5. 从自动染色仪中取出载玻片，并使用适用于多光谱成像的水性封片介质和 #1.5 盖玻片进行封片。
  6. 在染色后 2 天内完成载玻片的成像。
  7. 在落射荧光显微镜或荧光切片扫描仪上进行荧光成像
    1. 从严格控制的阳性对照样本开始，将阳性对照样本载入显微镜。
      1. 在样本中定位每种待成像不同抗原的阳性信号。
      2. 通过从低曝光时间开始并逐步增加曝光时间，直至信号显现，设置曝光时间以确保捕获染色的动态范围，同时最小化背景。对每种染料分别进行此操作。
        注：测试标志物高表达和低表达的存在情况，以确保完整动态范围的捕获。
    2. 保存阳性对照样本所用的成像参数，并在后续所有成像步骤中使用相同设置。
    3. 使用由阳性对照样本确定的参数，加载并成像阴性对照样本及所有实验样本。
    4. 在进入下一步之前，确认图像质量达到最佳。
  8. 去除盖玻片
    1. 将载玻片浸入盛有去离子水（DI 水）的 Coplin 瓶中。将 Coplin 瓶置于 65 °C 水浴中 15–20 分钟，以促进 盖玻片自然脱落。或者，若使用水性封片介质或封片介质已完全硬化，可通过将载玻片在磷酸盐缓冲液（PBS）或去离子水中浸泡过夜，使盖玻片自然脱落。
  9. 使用 LiBH4 进行漂白
    1. 在通风橱中，用去离子水新鲜配制浓度为 1 mg/mL 的 LiBH4 溶液。配制量应足以覆盖每个样本三次。
      注：由于 LiBH4 会与水发生反应，每次配制量不应超过 10 mL。为获得最佳漂白效果，应使用去离子水而非 Millipore/nanopure 水。
    2. 让溶液静置 20 分钟，期间会产生气泡。
    3. 在通风橱中的染色室中，向每张载玻片上加入 1 mL LiBH4 溶液。让溶液在载玻片上静置 10–15 分钟。
    4. 用移液器吸除 LiBH4 溶液，并更换为新鲜的 1 mL LiBH4 溶液。静置 10–15 分钟。
    5. 再次用移液器吸除 LiBH4 溶液，并更换为新鲜的 1 mL LiBH4 溶液。静置 10–15 分钟。
    6. 用移液器吸除载玻片上的 LiBH4 溶液，随后将载玻片浸入去离子水或 PBS 中进行短期保存（不超过 1 天）。
    7. 在 1 天内，进入下一轮 IBEX 染色步骤。
    8. 可选：湿封载玻片并在落射荧光显微镜下快速观察，以验证漂白效果。
  10. 将载玻片湿封后装入自动染色仪，进行第二轮 IBEX 染色
    1. 为自动染色仪准备所有抗体和 TSA 染料溶液。
    2. 对于 Ventana 自动染色仪：
      1. 准备开始自动染色时，向载玻片上加入约 1 mL 自动染色仪洗涤缓冲液，以防止湿封样本干燥。
      2. 将湿封的载玻片装入自动染色仪中。
    3. 对于 Bond Rx：
      1. 在载玻片上放置覆盖片（cover tiles）。
      2. 在覆盖片顶部加入 300 µL 洗涤缓冲液，使液体流入样本与覆盖片之间的空隙。
      3. 将样本加载至自动染色仪中。
    4. 根据 表 2 的示例设置自动染色仪程序，其中 N 为面板中抗体的数量。
    5. 从自动染色仪中取出载玻片，并使用适用于多光谱成像的水性封片介质和 #1.5 盖玻片进行封片。
    6. 在染色后 2 天内完成成像，成像过程遵循步骤 2.7 中所述的样本操作流程进行成像设置和图像采集。
    7. 成像完成后，按照步骤 2.8–2.9 所述方法对样本进行漂白。
  11. 根据需要重复上述步骤，完成所有 IBEX 面板的染色。

3. 使用市售软件分析样本

  1. 在进行配准之前，完成所有染色切片的全片扫描。
  2. 如果软件支持，通过扫描功能中内置的自动解混函数进行光谱解混，包括去除自发荧光光谱。如果所使用的软件具备此功能，请选择解混选项，并使用标准设置和预设染料运行
    注：大多数支持解混的软件均可创建自定义解混库。为建立解混库，需将仅用单一荧光染料染色的组织切片加入软件测量中。同时扫描未染色或具有自发荧光的组织区域，以表征自发荧光光谱，并使用自发荧光工具选中该光谱。在程序中点击"准备图像"，将这些光谱整合后导出至项目专用的解混库。随后在解混选项中选择该库作为解混参考库。
  3. 将扫描后的切片导入商用图像分析软件中进行配准。
  4. 多轮 IBEX 切片的配准
    1. 选择两轮需进行配准的 IBEX 迭代图像。
    2. 右键点击这两个图像，选择 配准 选项。
    3. 首次尝试配准时，选择 默认配准结合高分辨率配准 选项。
    4. 或者，从选项中选择 单通道配准，并选择在所有 IBEX 运行中保持一致的单一通道。
      注：此选项适用于抗漂白染料（参见材料部分中不发生漂白的染料）。
  5. 图像对齐
    1. 打开其中一个已完成配准的图像。
    2. 在 工具 选项卡下的 图像配准 菜单中，选择 配准工具 以打开所有已配准的图像。
    3. 在 配准工具 选项卡中，选择 标记点功能。
    4. 使用 标记点 功能精细调整全切片的对齐效果。
      1. 手动在一个切片图像上标记关键解剖或结构标记点。
      2. 在其他 IBEX 图像上标记相同位置的标记点。程序将利用这些标记点优化对齐效果。重复此过程以进一步微调对齐。
    5. 当对齐效果满意后，使用 融合 | 连续染色功能 将切片融合。
    6. 对所有额外的 IBEX 成像轮次重复此过程，直至完成所有图像的最终合成图像。
  6. 图像分析
    1. 细胞分割
      1. 在 分析 选项卡下，选择并打开 HighPlex 模块，然后选择 表型分析模块 进行细胞识别。
        1. 加载所有标记物，并在 Highplex 模块的 核检测 选项卡中开始通过 DAPI 染色识别所有细胞核。在 染料选择 选项卡中加载各标记物通道。
        2. 在 分析 选项卡中，启用 实时调节工具，关键参数设置如下：最小核强度用于过滤背景信号；最大图像亮度用于控制整体信号可见性；核分割激进度用于优化检测到的细胞核边界。
        3. 仔细调节每个参数，以确保分割结果准确。
    2. 检测细胞质和膜标记物。
      1. 进入 膜与细胞质检测 选项卡。
      2. 将 最小细胞质半径 设置为与样本中预期细胞大小相适应的数值。
      3. 在 膜染料 选项下，指定哪些通道为膜标记物。
        注：此设置有助于更精确地分割单个细胞，以便后续分析。
    3. 标记物阈值设定与表型分配
      1. 针对每个标记物，在其对应的选项卡中设置阳性与阴性信号的阈值。
      2. 对每个标记物进行手动阈值设定，以识别不同细胞群。
      3. 或者，采用基于生物信息学的自动阈值方法。在 高级 | 存储对象（细胞）数据 中，将选项切换为 True。在 导出 | 对象数据 中导出数据集，以获取每个已识别细胞的标记物表达信息。
      4. 将这些数据导入其他软件进行进一步和定制化分析。可用于进一步分析的软件选项见 表5。

结果

我们提供了一个在 Autostainer 2 上使用基于 TSA 试剂的 IBEX 面板示例（图 4）。每个标记物均可清晰分辨，且标记物之间几乎无串色。该图像经过两轮染色采集获得。样本为感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）后的肺组织。两个 IBEX 染色面板使用示例中的商业软件进行对齐。采用此处所述的优化 TSA 试剂的 IBEX 方法，可清晰观察并解析免疫细胞、炎症标志物以及特化肺细胞的空间分布。适当的优化可使标记物信号明显呈现，同时背景干扰极低。

小鼠肺组织中RAGE、CD3e的免疫荧光分析，猴脾脏组织；抗原修复研究。
图1：使用发射波长为520 nm的荧光染料对抗原修复效果的检测，针对两种不同抗原。 RAGE和CD3e的成像采用相同的曝光时间。该RAGE抗体所识别的表位对抗原修复处理极为敏感，重复进行抗原修复会导致检测灵敏度迅速下降。相反，CD3e的检测灵敏度则随着多次抗原修复处理而提高。比例尺 = 50 µm。缩写：RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示RAGE与SARS-CoV-2核蛋白相互作用的免疫荧光显微镜图像，细胞染色。
图2：序列开发对伞状效应重要性的示例。RAGE是肺泡I型（AT1）细胞中高表达的标志物，与CD31联合使用时，可有效阻断SARS-CoV-2的免疫反应性。然而，当先进行SARS-CoV-2免疫组织化学（IHC）染色时，所有信号均可被可视化。比例尺 = 25 µm。缩写：RAGE = 晚期糖基化终产物受体；AT1 = 肺泡I型细胞；SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2；IHC = 免疫组织化学。请点击此处查看该图的放大版本。

组织切片与染色示意图；显微镜成像；自动染色仪；LiBH4 脱色。
图3：使用自动染色设备进行IBEX方案的流程概览。 在第二轮或更高轮次的染色过程中采用湿封片法，以防止组织干燥。缩写：IBEX = Iterative Bleaching Extends Multiplicity（迭代脱色扩展多重性）。请点击此处查看该图的放大版本。

Multiplex immunofluorescence; diagram; markers DAPI, iNOS, CD11b; 480-780 nm spectral analysis.
图4：使用自动染色机2对感染肺组织进行基于TSA的染料IBEX示例 结核分枝杆菌. 图1包含所有染料，图2包含适用于漂白的染料。展示了肺组织IBEX全周期所有通道的合并图像。比例尺 = 200 µm。缩写：IBEX = iterative bleaching extends multiplicity；TSA = Tyramide Signal Amplification。 请点击此处以查看此图的放大版本。

表1：用于验证循环次数对抗体在1、3和6个循环测试中影响的示例实验方案。 请点击此处下载该表格。

表2：用于IBEX自动染色机进行面板验证的包含五种抗体的示例面板1。 请点击此处下载该表格。

表3：用于IBEX自动染色机进行面板验证的含四种抗体的示例面板2。 请点击此处下载该表格。

表4：两种自动染色机的比较。 本表总结了Ventana Autostainer与Bond Rx的优缺点。请点击此处下载该表格。

表5：图像分析软件概览。 本表总结了图像分割后可用于分析的一些分析方法和软件工具。请点击此处下载该表格。

讨论

本文提供了将IBEX方案引入核心病理实验室的若干考虑因素，包括在IBEX方案中应用自动化染色设备以及优化基于TSA的试剂。我们展示了如何在第二轮或更高轮次的抗原修复和上样过程中，针对自动化设备进行最佳优化。此外，我们还介绍了一种利用核心实验室可能配备的Halo软件进行图像配准的附加方法。这些方法已被证明在确定非人灵长类动物组织在SARS-CoV-2感染后肺部微环境差异方面具有实用价值5。

本研究的一个关键环节是强调在对实验组织进行染色前，必须对IBEX面板设计进行充分优化。特别是使用基于TSA的试剂时，需考虑一些在基础IBEX方法中未出现的因素。首先是多轮抗原修复对抗体敏感性的影响。在使用TSA试剂时，每一轮新抗体的孵育前均需进行抗体变性处理。某些抗体-抗原组合可能因多次抗原修复而变得不稳定，导致检测灵敏度下降；而另一些组合则可能因重复的变性/抗原修复过程而提高灵敏度。因此，在设计面板之前，必须在目标组织中对每种抗体进行仔细测试，以确保最佳染色效果，并指导抗体及荧光染料的使用顺序。需对所有抗体测试包括柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）和Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）在内的不同缓冲体系，以确定最佳的抗原修复条件。这需要系统性地评估每种缓冲液，找出最有利于特定抗体暴露抗原表位的条件。此外，还需优化温度（例如20–37 °C）、孵育时间（通常为30–60分钟）以及封闭条件，以降低非特异性背景染色，并确保一抗和二抗（如适用）的特异性结合。在一抗和二抗孵育前的封闭步骤中，可使用商业化的封闭试剂，以消除组织特异性自发荧光或非特异性相互作用。在最终确定IBEX面板前，还需优化其他重要因素，例如“伞效应”（umbrella effect），即若抗体顺序未针对具体研究问题进行优化，可能导致表位被屏蔽6。为避免荧光串色，通常建议将高表达的抗原靶标安排在远红通道（串色最少），而将表达较弱的标记物安排在480–520 nm范围的通道，因为这些荧光染料亮度最高，信噪比最佳7。然而，对于在此波长范围内自发荧光较强的组织样本应格外注意；我们建议通过不加任何染料的组织成像来评估潜在的自发荧光水平。综合这些优化步骤，并结合IBEX实验中常规进行的所有优化与对照措施，可为使用TSA试剂的IBEX实验提供合理的面板设计依据。

在本方法中，我们展示了两种常用自动染色机的使用。然而，这些方法也可应用于其他自动染色系统。其中关键步骤在于盖玻片的最佳去除以及湿载状态下进行后续染色循环。此外，我们并未指定任何特定的显微镜配置。尽管试剂盒可能推荐使用特定成像系统以实现最佳玻片扫描效果，但任何显微镜配置，尤其是配备兼容滤光片组和宽谱LED光源的落射荧光显微镜，均应可用。某些染料需要多光谱探测器或专用滤光片组，而这些设备并非所有实验室都具备；由于光谱重叠问题，使用标准滤光片组时可能会遇到困难。此类染料更适合采用多光谱成像系统或高度特异性的滤光片进行分离。一些荧光染料的发射波长超出常规远红滤光片范围（通常约为700 nm），需要具备近红外信号检测能力的专用滤光片组或探测器。虽然有专门配备此类滤光片的显微镜，但也存在替代方案。这些替代方案需要额外优化，以确定染料在特定显微镜配置下的表现。

对于多重荧光免疫组化（IHC），尤其是处理易产生自发荧光的组织时，强烈推荐使用多光谱解卷积技术，因为它能有效将真实信号与背景噪声分离。自发荧光通常与常用荧光染料的发射光谱重叠（特别是在较高能量的波长通道中），可能掩盖或干扰特异性信号，从而降低检测准确性。光谱解卷积通过数学方法分离重叠的发射光谱，从而分离出真实的荧光信号，同时“清除”不需要的自发荧光。在IBEX工作流程中，光谱解卷积尤为重要，因为染色与成像过程具有迭代性，获得尽可能纯净的信号至关重要。在IBEX中，多轮染色的信号依次成像、漂白并叠加，形成一幅复合图像。若某一轮中未解决的自发荧光或串色信号残留，将在叠加图像中传播，增加下游分析的复杂性，并降低标志物定位的可信度。光谱解卷积能有效将真实的荧光信号与背景自发荧光分离，确保每一轮单独成像时信号更纯净、更准确。这种信号清晰度对于生成可靠的复合图像至关重要，使得多轮间多个标志物可被联合分析，从而实现可靠的表型鉴定与空间分析。本实验方案所使用的成像平台具备内置解卷积功能，但为了与其他荧光全切片成像平台兼容，仍需提供更多解卷积选项。

此外，本研究的一个局限性在于自动染色仪的专有性质，因为其配套的试剂和洗涤缓冲液均针对这些系统进行了优化，但具体的配方尚未公开。同时，我们仅专注于一种 commercially available 图像分析软件用于全切片图像分析，并承认软件许可费用可能对部分实验室构成经济障碍。其他分析软件8,9以及R语言中的选项也显示出良好的应用前景；特别是Bodenmiller Group10开发的一套工具包，似乎非常适合组织芯样本，其中IMCDataAnalysis11旨在为R语言中多重图像下游分析提供可重复的工作流程。然而，未来仍需进一步努力，开发并验证适用于全切片IBEX分析的可及性强且成本较低的替代方案，以确保该技术在资源有限的环境中得到更广泛的应用。此外，本研究中结合自动染色仪进行IBEX操作的方法也可适用于更传统的IBEX染色方式，包括使用荧光标记的一抗，或在组织质量足够高且固定时间适当时，使用不含TSA染料的标准二抗进行染色，以获得良好的信号。

总体而言，我们希望本研究能够促进基于TSA的多重荧光免疫组化技术在常规病理核心设施设备上的应用，从而更广泛地将IBEX技术引入这些实验环境中。此类应用充分体现了IBEX方案的多功能性，并证明了其在处理困难组织样本或进行大规模批量分析时仍具有重要应用价值。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

Emily Speranza 获得了克利夫兰诊所基金会启动资金的支持。本研究使用了通过美国国立卫生研究院 SIG 资助（S10OD026983 & S10OD030269，授予 N.A.C.）获得的仪器。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
染色试剂
Alexa TSA 试剂盒		ThermoFisher若无 Opal 显微镜滤光片，可选用其他 TSA 荧光染料，包括 Alexa Fluor 488（蓝/绿通道）、Alexa Fluor 555 或 568（红色通道）、Alexa Fluor 647（远红通道）、Alexa Fluor 750（近红外通道，需配备相应滤光片）。 
抗体
Arg1		Cell Signaling93668图4中使用稀释比例为1:100
材料
刀片		Leica Biosystems或类似产品，高型或低型取决于组织类型
抗体
CD11b		Abcamab133357图4中使用稀释比例为1:2000
抗体
CD163		Abcamab182422图4中使用稀释比例为1:500
抗体
CD31		Cell Signaling77699S图2中使用稀释比例为1:100
抗体
CD3e		DakoA045201-2图1中使用稀释比例为1:100
工具
Coplin 染色缸		Fischer Scientific01-816-21或类似产品
材料
盖玻片		VWRv48393-026或类似产品
抗体
CX3CR1		Abcamab308613图4中使用稀释比例为1:450
染料
DAPI		AkoyaFP1490
软件
FIJI		用于测量信号强度
载玻片
Fisher Superfront 载玻片		Fisher Scientific22-037-246或类似产品
软件
HALO		Indica Labs示例商业化图像分析软件，用于图像配准与分析
抗体
Iba1		Cell Signaling17191图4中使用稀释比例为1:800
软件
inForm		Akoya用于测量信号强度
抗体
iNOS		Abcamab283655图4中使用稀释比例为1:400
仪器
Leica Bond Rx（或 RXm）		Leica Biosystems21.2201文中称为“Autostainer 1”。确保所有相关试剂（包括染色盒和大量溶液）均可用。 
试剂
LiBH4		Sigma-Aldrich62460-5G-F需保存于无水环境中
仪器
Mantra Snap		Akoya需配备多光谱荧光显微镜以检测染料。此为可用于检测 Opal 染料的显微镜示例。
工具
切片机		Leica Biosystems或类似设备，建议配备刷子等附件
染色试剂
Opal IHC 480 试剂盒		AkoyaFP1500001KT用于图4
染色试剂
Opal IHC 6-plex Plex 试剂盒		AkoyaNEL821001KT520 和 620 通道不褪色，用于图1、图2和图4
染色试剂
Opal IHC 780 试剂盒		AkoyaFP1501001KT用于图4
工具
烘箱		Millipore SigmaZ683329或类似设备，也可在自动染色仪上完成
抗体
全细胞角蛋白		Abcamab9377图4中使用稀释比例为1:50
试剂
PBS（可选）		Fisher ScientificAAJ61196AP
仪器
PhenoImager		Akoya具备全片多光谱成像功能，软件内置光谱解混功能
试剂
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂		Fisher ScientificP36961或类似的水性封片介质
抗体
ProSP-C N端（ProSPC）		Seven Hills BioreagentsWRAB-9337图4中使用稀释比例为1:250
抗体
RAGE		R&DMAB1179图1和图2中使用稀释比例为1:50
试剂
反应缓冲液		RocheNC1895692用于 Ventana 自动染色仪
抗体
SARS-CoV-2-N		Cell Signaling68344图2中使用稀释比例为1:1000
载玻片
TOMO Adhesion CC 显微载玻片-WH		AvantikSKUSL6519-1若存在组织附着问题时使用
仪器
Ventana Discovery Ultra		Roche文中称为“Autostainer 2”。确保所有相关试剂（包括染色盒和大量溶液）均可用。 
试剂
洗涤缓冲液		Leica BiosystemsAR9590用于 Leica Bond 自动染色仪
试剂
水		Fisher Scientific15-230-147去离子水最佳，非 Millipore 水
工具
水浴锅		Leica Biosystems140607020C1或类似设备

参考文献

  1. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nature Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  2. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  3. Prichard, J. W. Overview of automated immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med. 138, 1578-1582 (2014).
  4. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, 46-58 (2014).
  5. Speranza, E., et al. Age-related differences in immune dynamics during SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques. Life Sci Alliance. 5, 4(2022).
  6. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers (Basel). 12 (2), 255(2020).
  7. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the Basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
  8. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
  9. Feng, Y., et al. Spatial analysis with SPIAT and spaSim to characterize and simulate tissue microenvironments. Nat Commun. 14, 2697(2023).
  10. Meyer, L., Eling, N., Bodenmiller, B. cytoviewer: an R/Bioconductor package for interactive visualization and exploration of highly multiplexed imaging data. BMC Bioinformatics. 25, 9(2024).
  11. Windhager, J., et al. An end-to-end workflow for multiplexed image processing and analysis. Nat Protoc. 18 (11), 3565-3613 (2023).

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