高盐饮食条件下盐敏感大鼠肠道微生物细胞外囊泡的分离和差异表征

摘要

该方案描述了使用密度梯度离心法从喂食 HSD 的盐敏感大鼠中分离肠道微生物 EV。通过纳米颗粒示踪、TEM、LPS/BCA 测定和 16S rRNA 测序对 EVs 进行表征，以分析其大小、形态、组成和微生物群来源。

摘要

高盐摄入量是高血压的主要危险因素，其潜在机制可能与肠道微生物群分泌的细胞外囊泡 （EV） 密切相关。这些由肠道微生物群产生的 EV 携带各种生物活性成分，这些成分可能在高盐饮食 （HSD） 诱导的高血压发展中起关键作用。为了研究这种机制，我们开发了一种基于密度梯度离心的高效提取方法，以从喂食 HSD 的盐敏感大鼠的肠道微生物群中分离 EV。通过粒径分析、透射电子显微镜 （TEM） 和脂多糖 （LPS） 检测，我们确定了肠道菌群 EVs 的梯度分布并实现了精确提取。此外，采用 16S rRNA 基因测序分析正常组和 HSD 组之间 EVs 的来源和组成差异，揭示高盐摄入量对肠道菌群 EVs 遗传特征的影响。这项研究为盐诱导高血压的肠道微生物群机制提供了有价值的工具和科学见解，并为预防和治疗相关疾病提供了新的视角。

引言

肠道微生物群，也称为肠道微生物群或肠道微生态学，是位于生物胃肠道中的数万种微生物的复合体，在维持人类健康中起着至关重要的作用¹。近年来，随着进一步的研究，发现肠道微生物群可以产生细胞外囊泡 （EV）²。EV 是细胞释放的小囊泡，在细胞中携带各种分子，例如蛋白质、核酸和脂质 ^3,4。它们可以与其他微生物⁵、肠上皮细胞，甚至远处组织和器官⁶ 相互作用，从而影响人体的健康 ^7,8。这些肠道微生物群产生的 EV 与饮食之间存在紧密联系⁹。

肠道微生物群产生的 EV 可能是高盐饮食 （HSD） 影响身体健康的重要因素。HSD 不仅直接破坏肠道菌群的平衡¹⁰，导致有益菌（如乳酸菌）的数量显着减少¹¹，而且还促进有害菌（如拟杆菌等）的增殖¹². 这种不平衡会降低肠道屏障功能并增加肠道炎症的风险。此外，HSD 还通过改变肠道微生物群的代谢活动¹³ 进一步影响肠道中的酸碱平衡和营养吸收，例如减少具有多种生理功能的短链脂肪酸^14,15 的产生。

这些变化不仅影响肠道健康，还可能间接调节 EV 的产生和释放，并改变 EV 的成分和功能。高盐环境可能会影响肠道细胞的正常生理功能，包括 EVs 的释放和运输，从而干扰 EVs 在细胞间信息传递和免疫调节中的作用。同时，肠道炎症可能促进多种具有特殊功能的^EV16，并通过肠器官轴等方式扩散到全身^17,18，这与高血压^19,20、心血管²¹和脑血管疾病^22,23、肥胖^24,25、糖尿病²⁶的发生发展密切相关和其他慢性疾病。

因此，本研究的总体目标是开发一种高效可靠的方法，从喂食 HSD 的盐敏感大鼠的肠道微生物群中提取 EV，并系统研究它们的物理特性、组成和功能。由于高盐饮食后血压显着升高的特点，选择盐敏感大鼠，通过构建高效的提取方法揭示 HSD 对肠道菌群 EV 的影响。该方法基于密度梯度离心，并结合了各种动态鉴定技术，如粒度检测、LPS/BCA 测量、透射电子显微镜和蛋白质组学分析。该方案旨在揭示 HSD 对肠道微生物群 EV 的影响及其在心血管疾病中的机制。该方法具有高效、重现性和广泛的适用性，不仅为探索肠道菌群 EVs 在盐诱导高血压中的机制提供了重要工具，也为制定基于 EVs 的疾病干预策略奠定了理论基础。通过这项研究，我们希望为预防和治疗心血管疾病（如高血压）开辟新的途径^27,28。

方案

本动物实验研究符合相关伦理准则和国际标准。涉及动物的研究得到了成都中医药大学实验动物福利和伦理委员会（机构：成都中医药大学;方案编号：2018-21）的批准。

1. 动物准备和饮食制度

1. 通过在 50% ± 10% 湿度下饲养，使 6 周龄雄性 Dahl 盐敏感大鼠适应，体重 180-200 克;12 小时/12 小时光照循环;在无特定病原体的条件下，20.0 ± 2.0 °C 持续 1 周。
2. 随后，将大鼠平均分成两组 （n = 6）。为每组提供持续 6 周的不同饮食：含 0.5% 氯化钠的正常盐饮食 （NSD） 和含 8% 氯化钠的 HSD，这在已发表的研究中常用 29,30,31。在整个研究过程中，小鼠可以无限制地获得食物和水。

2. 监测血压

注意：尾袖体积描记法用作血压测量的非侵入性方法，当从尾血容量测量血压时，使用体积压力记录 （VPR）。

1. 将大鼠单独放在装有锯末的小笼子中，在大约 37 °C 下加热 10 分钟，然后放置在带有可调节鼻子和门的定制啮齿动物约束装置中，以便动物进入。将大鼠放在加热垫上，俯卧位，以保持体温在 37 °C。
2. 将 VPR 传感器连接到尾部底部，并设置至少 10 个适应周期以稳定 BP²⁸。
   1. 将充气袖带填充在尾根上，并将体积描记传感器（或光电传感器）放在下方。缓慢充气至收缩压以上（通常为 200 mmHg），然后缓慢释放。仪器自动检测脉搏波消失（收缩压）和恢复（舒张压）的压力值。连续测量 3-5 次，取平均值。
3. 训练所有大鼠适应约束程序，并在上午 9 点左右在安静的实验室中进行这项研究，以尽量减少昼夜节律变化的影响。
4. 在牺牲前每隔一天测量一次收缩压 （SBP） 和舒张压 （DBP）。根据 SBP 和 DBP 估计平均动脉压 （MAP）
   映射 = （SBP + 2 DBP）/3

3. EV 的提取

1. 样本采集
   1. 将无菌棉签浸入 75% 酒精中，然后用它来刺激大鼠的肛门。刺激旨在促进肠道蠕动和放松肛门括约肌，从而促进排便。排出粪便后，使用无菌镊子将它们收集到适当大小的无菌容器中，并立即将它们储存在 -80 °C。
2. 样品制备
   1. 用勺子将 5 g 粪便转移到预先称重的 50 mL 离心管中。向试管中加入 50 mL 预热的 37 °C 无内毒素 PBS（最大样品浓度 10%）并旋转 30 分钟。将高速离心机冷却至 4 °C。
   2. 对称放置样品后，以 8,000 x g 离心 15 分钟，使离心机平衡。离心后，吸出上清液并将其转移到新的无菌离心管中。
   3. 再次以 8,000 x g 离心 15 分钟。吸出上清液并将其用于进一步分析。
3. 粗提物制备
   1. 使用无菌的 0.22 μm 过滤器装置。将过滤器装置放在冰上并牢牢握住真空泵。将获得的上清液转移到过滤器的顶部。打开真空泵以收集过滤后的样品。
   2. 将滤液转移至离心过滤器 （10 kDa， 15 mL） 中，在 4 °C、3,000 x g 下离心 30 分钟，并将样品浓缩至至少 1400 μL。
   3. 收集浓缩的样品，必要时使用预冷的无内毒素 PBS 将其稀释至 1400 μL。稀释后立即将样品放在冰上。
      注意：粗提取物可以立即使用或在 -80 °C 下储存数月。
4. 电动汽车的分离
   1. 如下所述准备梯度缓冲液 A 和梯度缓冲液 B。提前一天准备缓冲液，因为化合物需要几个小时才能完全溶解。制备的缓冲液可在 4 °C 下储存 6 个月。
      1. 梯度缓冲液 A 的制备：通过磁力混合器搅拌，将 0.25 M 蔗糖、6 mM EDTA 和 60 mM Tris 溶解在 800 mL 无内毒素的水中，并使用盐酸将 pH 值调节至 7.4。用无内毒素的水稀释至 1 L。使用 0.22 μm 瓶顶过滤器过滤缓冲液。
      2. 梯度缓冲液 B 的制备：通过磁力混合器搅拌，将 0.25 M 蔗糖、1 mM EDTA 和 10 mM Tris 溶解在 800 mL 无内毒素的水中，用盐酸将 pH 值调节至 7.4。用无内毒素的水稀释至 1 L。使用 0.22 μm 瓶顶过滤器过滤缓冲液。
   2. 混合 1 体积的梯度缓冲液 A 和 5 体积的密度梯度培养基（培养基为 60% 碘克沙醇溶液）以制备工作溶液。
   3. 碘克沙醇溶液（10%、20%、40%）的制备：要制备 10% 碘克沙醇溶液，请混合 1 个单位的工作溶液和 4 个单位缓冲液 B;对于 20% 碘克沙醇溶液，混合 2 个单位的工作溶液和 3 个单位的缓冲液 B;对于 40% 碘克沙醇溶液，混合 4 个单位的工作溶液和 1 个单位的缓冲液 B。准备每种溶液新鲜并储存在冰上。
      注意：应为每次实验准备新鲜的工作溶液，并且可以准备额外 10% 体积的溶液以解决实验误差。
   4. 将步骤 3.3.3 中制备的溶液与 7 mL 密度梯度培养基混合，制成 50% 碘克沙醇溶液。
   5. 为了制备密度梯度，将台盼蓝溶液添加到 40% 溶液和 10% （wt/vol） 碘克沙醇溶液中，以在不同层之间提供清晰的轮廓。
   6. 将 8 mL 50% 碘克沙醇溶液转移到薄壁聚丙烯离心管的底部。将试管倾斜 70°，将 8 mL 40% 碘克沙醇溶液转移到液体表面。加入 8 mL 20% 碘克沙醇溶液，然后加入 7 mL 10% 碘克沙醇溶液，最后加入 2 mL 无内毒素 PBS。
      注意：准备密度梯度需要练习。密度梯度的质量对实验结果有很大影响。在添加过程中的不同步骤之间不要将试管直立放置，因为这会对密度梯度的质量产生负面影响。
   7. 提前预冷离心机，并将制备好的密度梯度放入超速离心机中。开始输入参数，参数值：100,000 x g，20 h，10 °C。
   8. 对于手动梯度密度分离，从系统表面中心缓慢吸取 2 mL 溶液，总共含有 34 mL 液体。每 2 mL 是一个梯度，因此将密度梯度溶液分为 17 个梯度。
   9. 使用移液管将密度分数转移到无菌样品管中，并立即将它们放在冰上。用拇指和食指夹住离心管，确保其保持直立。
5. 电动汽车的回收
   1. 使用全自动 EVs 提取系统，通过超滤芯片上的双耦合超声振荡系统施加负压振荡，通过纳米孔去除样品中的核酸和蛋白质杂质并拦截 EV，从而富集和纯化 EV。
      1. 去除步骤 3.4.7 中的滤液，并将其添加到超滤芯片中。
      2. 根据仪器说明作仪器，收集过滤后的滤液，即富含外泌体的溶液。主要过程如图 1 所示。

4. 电动汽车识别

1. 粒度和浓度检测
   1. 使用基于电阻脉冲传感 （RPS） 的纳米库仑计数器评估尺寸分布和 zeta 电位。为本实验选择测量范围为 60-200 nm 的纳米孔芯片。此外，使用纳米库计数器评估 EV 的粒度分布和 zeta 电位。
      1. 取适量 EVs 溶液，稀释成 （1/10， 1/100， 1/1000， 1/10000）。
      2. 将不同稀释的 EV 溶液放在仪器上进行测试。
      3. 选择稳定性较好的稀释倍数并再次测试，以获得更准确的数据。
2. LPS 和 BCA 检测
   1. BCA 检测：使用 RIPA 缓冲液裂解 EV，然后分离蛋白质。使用 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒测定 EV 的蛋白质含量。
   2. LPS 检测：使用内毒素检测试剂盒，根据试剂盒步骤添加样品、内毒素检测器和显色剂。测量 545 nm 处的吸光度，并根据标准曲线计算外部囊泡的 LPS 表达。
3. TEM 评估：对于阴性染色和 TEM 分析，将样品涂在涂有连续碳膜的发光铜格栅上，并用 0.75% 甲酸铀酰染色。对于冷冻电镜，将 EV 吸收到具有亲水表面的 300 目 EM 碳网格中，并在液氮中冷冻。使用冷冻透射电镜观察和分析网格，并以 22,000 倍放大倍数记录图像³²。
4. 蛋白质表征：使用 RIPA 缓冲液裂解 EV，然后分离蛋白质。使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，通过 SDS-PAGE 从每个样品中分离等量的蛋白质，并在电泳后用考马斯蓝染料溶液染色以可视化蛋白质谱^33,34。
5. S 测序和分析：使用粪便 DNA 提取试剂盒从粪便样本中提取基因组 DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计评估 DNA 的完整性和浓度。用通用引物扩增 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域，纯化 PCR 产物，定量，并在 Illumina 平台上进行测序。使用 QIIME2 管道³⁵ 执行数据分析。
   1. 使用 DADA2 对扩增子序列变体 （ASV） 进行分类，并使用 VSEARCH 算法与 Silva 数据库进行匹配。使用 α-Diversity 分析来评估样品中的物种丰富度和多样性，主要使用 Shannon 指数和 Chao1 指数等指数。β多样性分析比较样品之间的微生物群落组成，通常通过主坐标分析 （PCoA） 进行可视化。使用差异分析方法，例如线性判别分析效应大小 （LEfSe） 和火山图分析，以识别条件显著不同的微生物分类群或组间微生物分类群。

结果

以不同的馏分测定 EV 浓度（图 2A）。实验结果表明，EV 的浓度在一系列密度梯度溶液中表现出典型的正态分布模式（图 2B）。具体来说，在馏分 9 中，EV 的浓度达到最高点 （3.85 x 10⁹），表明 EV 的主要分布分数可能是 9³⁶。

为了测定蛋白质含量，使用 BCA 试剂盒评估不同组分中的蛋白质含量（图 2C）。在该方法中，馏分 9 中的蛋白质含量为 0.417 μg/μL，这进一步证明了 EV 的分布。由于 LPS 是革兰氏阴性菌^37,38 的独特成分，因此还使用内毒素检测试剂盒来确定 LPS 的表达（图 2D），以评估 EV 在不同组分中的分布...

讨论

在这项研究中，我们专注于 HSD 盐敏感大鼠的肠道微生物群 EV，并取得了一系列关键成就。首先，成功构建了一种基于密度梯度离心的高效提取方法，从 HSD 上的盐敏感大鼠肠道微生物群中分离 EV，并通过细致、标准化的动物实验作和样品处理过程分离了大多数非 EV 成分。密度梯度离心法的 EVs 提取方法高效且重现性好，优于常规超速离心法，能更好地保留 EVs 的完整性和功能性，保证样品质量和研究可行性。

其次，通过各种动态技术对 EVs 进行全面鉴定：粒径和浓度检测表明 EVs 具有特定的粒度分布;LPS 和 BCA 测量量化 EV 的蛋白质含量和 LPS 表达;TEM 清楚地显示了 EV 的形态结构;和蛋白质特性定义了蛋白质谱。这些鉴定结果全面揭示了 EVs 的物理和生化特性，为后续研究提供了可靠的数据支持。

此外，16S rRNA 基因测序技术通过深入分析正常和 HSD EVs 的来源和组成之间的差异，以及α多样性分析和β多样性分析表明，高盐摄入量显著影响肠道...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Essential Supplies
心过滤器 （10nkDa 2 mL）	Millipore	UFC903096
离心机 Tude（50 mL）	BKMAN	20220404
离心机 Tudes	BECKMAN COULTER	Z30815SCA
真空过滤系统	Biosharp	24902581
Reagents
色 LAL 内毒素检测试剂盒	Beyotime	022124240705
考马斯蓝快速染色溶液	Beyotime	Z972241010
EDTA	Damas-β	P3117308
增强型 BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime	A006241112
乙醇	KESH
HCl
OptiPrep（60% wt/vol，碘沙醇）	Serumwerk	00124
PBS Labshark		130114005
磷钨酸	RUIXIN
蔗糖	Damas-β	P1917057
Tris （VWR）	Damas-beta	P3061764
台盼蓝染色液 （0.4%）	Beyotime	BD07242904
Equipment
Absorbance Microplate Reader	SpectraMax	ABP01690
Biomicroscope	Motic	BA210
数字台式离心机	Cence	CHT210R
台式高速微量离心机	DLAB	D3024
定角铝转子 + 500 mL 离心杯	Cence
高精度电子天平	SKR	BN-200
层流柜	仪器有限公司	SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti 摆动铲斗转弯+ SW 32.1 Ti 转子铲斗	贝克曼库尔特
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1400FLASH
管式旋转器
超速离心机	贝克曼库尔特	Optima XE-100
超纯水系统	ULPHW	UPR-II-15TNZ
水务多功能真空泵		SHZ-D（III）