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方法文章

高盐饮食条件下盐敏感大鼠肠道微生物胞外囊泡的分离与差异表征

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DOI：

10.3791/68279

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2025年6月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了采用密度梯度离心法从高盐饮食喂养的盐敏感型大鼠中分离肠道微生物胞外囊泡（EVs）的方法。通过纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜（TEM）、脂多糖（LPS）/BCA检测以及16S rRNA测序对EVs进行表征，以分析其大小、形态、组成及微生物来源。

摘要

高盐摄入是高血压的主要风险因素，其潜在机制可能与肠道微生物群分泌的细胞外囊泡（EVs）密切相关。这些由肠道微生物群产生的EVs携带多种生物活性成分，可能在高盐饮食（HSD）诱导的高血压发生过程中发挥关键作用。为探究这一机制，我们建立了一种基于密度梯度离心的高效提取方法，用于从饲喂高盐饮食的盐敏感型大鼠肠道微生物群中分离EVs。通过粒径分析、透射电子显微镜（TEM）和脂多糖（LPS）检测，我们确定了肠道微生物群EVs的梯度分布，并实现了精确提取。此外，采用16S rRNA基因测序分析正常组与HSD组之间EVs的来源及组成差异，揭示了高盐摄入对肠道微生物群EVs遗传特征的影响。本研究为阐明高盐诱导高血压中肠道微生物群的作用机制提供了有价值的工具和科学依据，并为相关疾病的预防与治疗提供了新的视角。

引言

肠道微生物群，也称为肠道菌群或肠道微生态，是定植于生物体胃肠道内数以万计微生物组成的复杂群落，在维持人体健康方面发挥着至关重要的作用1。近年来，随着研究的深入，发现肠道微生物群能够产生细胞外囊泡（EVs）2。EVs 是细胞释放的小囊泡，可携带细胞内的多种分子，如蛋白质、核酸和脂质3,4。它们能够与其他微生物5、肠上皮细胞，甚至远端组织和器官相互作用6，从而影响人体健康7,8。这些肠道微生物群产生的 EVs 与饮食之间存在密切关联9。

肠道微生物群产生的细胞外囊泡（EVs）可能是高盐饮食（HSD）影响机体健康的重要媒介。高盐饮食不仅直接破坏肠道微生物群的平衡10，导致有益菌（如Lactobacillus）数量显著减少11，还会促进有害菌（如拟杆菌属等）的增殖12。这种失衡会削弱肠道屏障功能，增加肠道炎症风险。此外，高盐饮食还通过改变肠道微生物群的代谢活性13，进一步影响肠道的酸碱平衡和营养吸收，例如减少具有多种生理功能的短链脂肪酸的生成14,15。

这些变化不仅影响肠道健康，还可能间接调控细胞外囊泡（EVs）的产生与释放，并改变EVs的组成和功能。高盐环境可能影响肠道细胞的正常生理功能，包括EVs的释放与转运，从而干扰EVs在细胞间信息传递和免疫调节中的作用。同时，肠道炎症可能促进多种具有特殊功能的EVs的产生。16 并通过肠-器官轴等途径扩散至全身17,18，这与高血压的发生和发展密切相关19,20心血管21 脑血管疾病22,23，肥胖24,25糖尿病26 及其他慢性疾病。

因此，本研究的总体目标是建立一种高效且可靠的方法，用于从高盐饮食（HSD）喂养的盐敏感型大鼠肠道微生物群中提取细胞外囊泡（EVs），并系统研究其物理特性、组成及功能。由于盐敏感型大鼠在高盐饮食后表现出显著的血压升高特征，本研究选用该模型，并通过构建高效的提取方法，揭示HSD对肠道微生物群EV的影响。该方法基于密度梯度离心，并结合多种动态鉴定技术，如粒径检测、LPS/BCA测定、透射电子显微镜和蛋白质组学分析。本实验方案旨在揭示HSD对肠道微生物群EV的影响及其在心血管疾病中的作用机制。该方法具有高效性、可重复性和广泛适用性，不仅为探索肠道微生物群EV在盐诱导性高血压中的机制提供了重要工具，也为基于EV开发疾病干预策略奠定了理论基础。通过本研究，我们希望为高血压等心血管疾病的预防和治疗开辟新的途径27,28。

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方案

本动物实验研究符合相关伦理准则和国际标准。涉及动物的研究已获得成都中医药大学实验动物福利与伦理委员会的批准（机构：成都中医药大学；方案编号：2018-21）。

1. 动物准备与饮食方案

  1. 将6周龄雄性Dahl盐敏感型大鼠（体重180-200 g）置于特定病原体阴性条件下，于50% ± 10%湿度、12小时光照/12小时黑暗循环、20.0 ± 2.0 °C环境中饲养1周以适应环境。
  2. 随后将大鼠均分为两组（n = 6），每组给予不同的饮食，持续6周：一组为含0.5%氯化钠的正常盐饮食（NSD），另一组为含8%氯化钠的高盐饮食（HSD），后者在已发表的研究中常用29,30,31。实验期间，大鼠可自由摄食和饮水。

2. 血压监测

注意：采用尾套容积描记法作为无创性血压测量方法，当从尾部血容量测量血压时，使用容积压力记录法（VPR）。

  1. 将大鼠单独放入铺有木屑的小笼中，在约 37 °C 条件下加热 10 分钟，然后将其置于可调节鼻部和动物入口门的定制啮齿类动物固定装置中。将大鼠以俯卧位放置在加热垫上，以维持其体温在 37 °C。
  2. 将 VPR 传感器连接至尾巴底部，并设置至少 10 次适应性循环，以使血压（BP）28 稳定。
    1. 向尾根部的可充气袖带充气，并将体积描记传感器（或光电传感器）置于其下方。缓慢充气至高于收缩压的水平（通常为 200 mmHg），然后缓慢放气。仪器将自动检测脉搏波消失时的压力值（收缩压）和恢复时的压力值（舒张压）。连续测量 3–5 次，取平均值。
  3. 训练所有大鼠适应固定操作，并在安静的实验室环境中于上午 9 点左右进行本实验，以尽量减少昼夜节律变化的影响。
  4. 在处死前每隔一天测量一次收缩压（SBP）和舒张压（DBP）。根据 SBP 和 DBP 估算平均动脉压（MAP）
    MAP = (SBP + 2 DBP)/3

3. EV 的提取

  1. 样品采集
    1. 将无菌棉签浸入75%酒精中，用其刺激大鼠肛门。该刺激旨在促进肠道蠕动并松弛肛门括约肌，从而促进排便。粪便排出后，使用无菌镊子将其收集至适当大小的无菌容器中，并立即于-80 °C保存。
  2. 样品制备
    1. 用勺子将5 g粪便转移至已预称重的50 mL离心管中。向管中加入50 mL预热至37 °C的无内毒素PBS（最大样品浓度为10%），旋转混匀30 min。将高速离心机预冷至4 °C。
    2. 将样品对称放置，待离心机平衡后，在8,000 x g条件下离心15 min。离心结束后，吸除上清液，并将其转移至新的无菌离心管中。
    3. 再次在8,000 x g条件下离心15 min。吸除上清液，用于后续分析。
  3. 粗提物制备
    1. 使用无菌0.22 µm滤器装置。将滤器置于冰上，并牢固固定真空泵。将获得的上清液转移至滤器顶部，开启真空泵以收集滤过样品。
    2. 将滤液转移至离心滤器（10 kDa，15 mL）中，在4 °C、3,000 x g条件下离心30 min，将样品浓缩至至少1400 µL。
    3. 收集浓缩样品，必要时用预冷的无内毒素PBS稀释至1400 µL。稀释后立即置于冰上。
      ​注意：粗提物可立即使用，或于-80 °C保存数月。
  4. EVs的分离
    1. 按以下方法配制梯度缓冲液A和梯度缓冲液B。缓冲液需提前一天配制，因化合物完全溶解需数小时。配制好的缓冲液可在4 °C保存6个月。
      1. 梯度缓冲液A的配制：在800 mL无内毒素水中，通过磁力搅拌器搅拌溶解0.25 M蔗糖、6 mM EDTA和60 mM Tris，用盐酸调节pH至7.4，再用无内毒素水定容至1 L。使用0.22 µm瓶顶滤器过滤缓冲液。
      2. 梯度缓冲液B的配制：在800 mL无内毒素水中，通过磁力搅拌器搅拌溶解0.25 M蔗糖、1 mM EDTA和10 mM Tris，用盐酸调节pH至7.4，再用无内毒素水定容至1 L。使用0.22 µm瓶顶滤器过滤缓冲液。
    2. 将1体积梯度缓冲液A与5体积密度梯度介质（介质为60%碘克沙醇溶液）混合，配制成工作液。
    3. 碘克沙醇溶液（10%、20%、40%）的配制：配制10%碘克沙醇溶液时，将1份工作液与4份缓冲液B混合；配制20%碘克沙醇溶液时，将2份工作液与3份缓冲液B混合；配制40%碘克沙醇溶液时，将4份工作液与1份缓冲液B混合。每种溶液需新鲜配制，并置于冰上保存。
      注意：每次实验均应新鲜配制工作液，可额外多配制10%体积以弥补实验误差。
    4. 将步骤3.3.3中配制的溶液与7 mL密度梯度介质混合，制成50%碘克沙醇溶液。
    5. 为制备密度梯度，在40%溶液和10%（wt/vol）碘克沙醇溶液中加入台盼蓝溶液，以清晰区分不同层。
    6. 将8 mL 50%碘克沙醇溶液转移至薄壁聚丙烯离心管底部。将离心管倾斜至70°，将8 mL 40%碘克沙醇溶液沿液面缓慢加入。随后依次加入8 mL 20%碘克沙醇溶液、7 mL 10%碘克沙醇溶液，最后加入2 mL无内毒素PBS。
      注意：密度梯度的制备需要练习。密度梯度的质量对实验结果影响显著。在加样过程中不同步骤之间不得将离心管直立，以免影响密度梯度质量。
    7. 提前预冷离心机，将制备好的密度梯度放入超速离心机中。输入参数启动离心，参数设置为：100,000 x g，20 h，10 °C。
    8. 对于手动梯度密度分离，从总体积为34 mL的体系表面中心缓慢吸取2 mL溶液。每2 mL为一个梯度，共将密度梯度溶液分为17个梯度。
    9. 使用移液器将各密度组分转移至无菌样品管中，并立即置于冰上。用拇指和食指夹住离心管，确保其保持直立。
  5. EVs的回收
    1. 使用全自动EVs提取系统，该系统通过双耦合超声振荡系统在超滤芯片上施加负压振荡，使核酸和蛋白质杂质通过纳米孔滤除，而EVs被截留，从而实现EVs的富集与纯化。
      1. 将步骤3.4.7中的滤液收集并加入超滤芯片中。
      2. 按照仪器说明书操作仪器，收集滤过的滤液，即外泌体富集溶液。主要过程如图1所示。

4. 细胞外囊泡（EVs）鉴定

  1. 颗粒大小和浓度检测
    1. 使用基于电阻脉冲传感（RPS）的纳米库仑计数器评估粒径分布和Zeta电位。本实验选择测量范围为60–200 nm的纳米孔芯片。此外，使用纳米库仑计数器进一步评估细胞外囊泡（EVs）的粒径分布和Zeta电位。
      1. 取适量EVs溶液，用稀释液进行适当稀释（1/10、1/100、1/1000、1/10000）。
      2. 将不同稀释倍数的EVs溶液置于仪器中进行检测。
      3. 选择稳定性较好的稀释倍数，重复测试以获得更准确的数据。
  2. LPS和BCA检测
    1. BCA检测：使用RIPA裂解液裂解EVs，分离蛋白质。利用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定EVs中的蛋白含量。
    2. LPS检测：按照内毒素检测试剂盒的操作步骤，加入样品、内毒素检测试剂和显色剂。在545 nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算细胞外囊泡的LPS表达水平。
  3. 透射电镜（TEM）评估：进行负染色和TEM分析时，将样品滴加至覆盖连续碳膜的发光铜网上，用0.75%甲酸铀酰染色。进行冷冻电镜（cryo-EM）分析时，将EVs吸附于具有亲水表面的300目EM碳载网上，随后在液氮中快速冷冻。使用冷冻透射电镜（Cryo-TEM）观察并分析载网，在22,000倍放大倍数下采集图像32。
  4. 蛋白质表征：使用RIPA缓冲液裂解EVs，分离蛋白质。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE对各样品等量蛋白进行分离，电泳后用考马斯亮蓝染色液染色，以显示蛋白质谱型33,34。
  5. 测序与分析：使用粪便DNA提取试剂盒从粪便样本中提取基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计评估DNA的完整性和浓度。使用通用引物扩增16S rRNA基因的V3–V4区，纯化PCR产物，定量后在Illumina测序平台上进行测序。使用QIIME2分析流程进行数据分析35。
    1. 使用DADA2对扩增子序列变体（ASVs）进行分类，并通过VSEARCH算法比对Silva数据库。采用α多样性分析评估样本内的物种丰富度和多样性，主要使用Shannon指数和Chao1指数。β多样性分析用于比较样本间微生物群落组成，通常通过主坐标分析（PCoA）进行可视化。采用差异分析方法，如线性判别分析效应大小（LEfSe）和火山图分析，识别在不同条件或组间具有显著差异的微生物类群。

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结果

不同组分中的EVs浓度被测定（图2A）。实验结果表明，在一系列密度梯度溶液中，EVs的浓度呈现出典型的正态分布模式（图2B）。具体而言，在第9组分中，EVs浓度达到最高值（3.85 × 109），提示EVs的主要分布组分可能为第9组分36。

为测定蛋白质含量，采用BCA试剂盒评估不同组分中的蛋白质含量（图2C）。该方法显示，第9组分的蛋白质含量为0.417 µg/µL，进一步证明了细胞外囊泡（EVs）的分布情况。由于脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌特有的组分37,38，因此也使用内毒素检测试剂盒检测各组分中LPS的表达水平（图2D），以评估EVs在不同组分中的分布...

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讨论

本研究聚焦于高盐饮食（HSD）下盐敏感型大鼠肠道微生物群的细胞外囊泡（EVs），并取得了一系列关键成果。首先，我们成功建立了一种基于密度梯度离心的高效提取方法，用于分离高盐饮食下盐敏感型大鼠肠道微生物群的EVs，并通过精细、标准化的动物实验操作和样本处理流程，有效去除了大部分非EV成分。该密度梯度离心EVs提取方法高效且可重复，优于传统的超速离心法，能更好地保持EVs的完整性和功能活性，从而确保样本质量和研究的可行性。

其次，通过多种动态技术对细胞外囊泡（EVs）进行了全面鉴定：颗粒大小和浓度检测表明，EVs具有特定的尺寸分布；LPS和BCA检测定量了EVs的蛋白质含量及LPS表达水平；透射电子显微镜（TEM）清晰展示了EVs的形态结构；蛋白质特征分析则界定了EVs的蛋白质谱。这些鉴定结果全面揭示了EVs的物理和生物化学特性，为后续研究提供了可靠的数据支持。

此外，利用16S rRNA基因测序技术深入分析正常饮食与高盐饮食来源的细胞外囊泡（EVs）在组成和来源上的差异，α多样性分析和β多样性分析结果表明，高盐摄入显著影响肠道微...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（82205240）、四川省自然科学基金（2025ZNSFSC1836）以及四川省骨科医院临床基础项目（PY202414）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
必备耗材
离心过滤器（10 kDa，2 mL）MilliporeUFC903096
离心管（50 mL）BKMAN20220404
离心管BECKMAN COULTERZ30815SCA
真空过滤系统Biosharp24902581
试剂
显色基质鲎试剂内毒素检测试剂盒Beyotime022124240705
考马斯亮蓝快速染色液BeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
增强型BCA蛋白检测试剂盒BeyotimeA006241112
乙醇KESH
HCl
OptiPrep（60% 质量/体积，碘克沙醇）Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
磷钨酸RUIXIN
蔗糖Damas-betaP1917057
Tris（VWR）Damas-betaP3061764
台盼蓝染色液（0.4%）BeyotimeBD07242904
仪器设备
吸光度酶标仪SpectraMaxABP01690
生物显微镜MoticBA210Digital
台式离心机CenceCHT210R
台式高速微量离心机DLABD3024
固定角铝转子 + 500 mL 离心杯Cence
高精度电子天平SKRBN-200
超净工作台南通湖南科学仪器有限公司SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti 摆桶转子 + SW 32.1 Ti 转子吊篮BECKMAN COULTER
透射电子显微镜JEOLJEM-1400FLASH
管式旋转混合器
超速离心机BECKMAN COULTEROptima XE-100
超纯水系统ULPHWUPR-II-15TNZ
水循环多功能真空泵强强SHZ-D(III)

参考文献

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肠道微生物囊泡密度梯度离心透射电子显微镜纳米颗粒追踪脂多糖检测16S rRNA测序高血压机制
高盐饮食条件下盐敏感大鼠肠道微生物胞外囊泡的分离与差异表征
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