本方案描述了采用密度梯度离心法从高盐饮食喂养的盐敏感型大鼠中分离肠道微生物胞外囊泡（EVs）的方法。通过纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜（TEM）、脂多糖（LPS）/BCA检测以及16S rRNA测序对EVs进行表征，以分析其大小、形态、组成及微生物来源。
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方法文章
高盐饮食条件下盐敏感大鼠肠道微生物胞外囊泡的分离与差异表征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
高盐摄入是高血压的主要风险因素，其潜在机制可能与肠道微生物群分泌的细胞外囊泡（EVs）密切相关。这些由肠道微生物群产生的EVs携带多种生物活性成分，可能在高盐饮食（HSD）诱导的高血压发生过程中发挥关键作用。为探究这一机制，我们建立了一种基于密度梯度离心的高效提取方法，用于从饲喂高盐饮食的盐敏感型大鼠肠道微生物群中分离EVs。通过粒径分析、透射电子显微镜（TEM）和脂多糖（LPS）检测，我们确定了肠道微生物群EVs的梯度分布，并实现了精确提取。此外，采用16S rRNA基因测序分析正常组与HSD组之间EVs的来源及组成差异，揭示了高盐摄入对肠道微生物群EVs遗传特征的影响。本研究为阐明高盐诱导高血压中肠道微生物群的作用机制提供了有价值的工具和科学依据，并为相关疾病的预防与治疗提供了新的视角。
引言
肠道微生物群，也称为肠道菌群或肠道微生态，是定植于生物体胃肠道内数以万计微生物组成的复杂群落，在维持人体健康方面发挥着至关重要的作用1。近年来，随着研究的深入，发现肠道微生物群能够产生细胞外囊泡（EVs）2。EVs 是细胞释放的小囊泡，可携带细胞内的多种分子，如蛋白质、核酸和脂质3,4。它们能够与其他微生物5、肠上皮细胞，甚至远端组织和器官相互作用6，从而影响人体健康7,8。这些肠道微生物群产生的 EVs 与饮食之间存在密切关联9。
肠道微生物群产生的细胞外囊泡（EVs）可能是高盐饮食（HSD）影响机体健康的重要媒介。高盐饮食不仅直接破坏肠道微生物群的平衡10，导致有益菌（如Lactobacillus）数量显著减少11，还会促进有害菌（如拟杆菌属等）的增殖12<....
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方案
本动物实验研究符合相关伦理准则和国际标准。涉及动物的研究已获得成都中医药大学实验动物福利与伦理委员会的批准（机构：成都中医药大学；方案编号：2018-21）。
1. 动物准备与饮食方案
- 将6周龄雄性Dahl盐敏感型大鼠（体重180-200 g）置于特定病原体阴性条件下，于50% ± 10%湿度、12小时光照/12小时黑暗循环、20.0 ± 2.0 °C环境中饲养1周以适应环境。
- 随后将大鼠均分为两组（n = 6），每组给予不同的饮食，持续6周：一组为含0.5%氯化钠的正常盐饮食（NSD），另一组为含8%氯化钠的高盐饮食（HSD），后者在已发表的研究中常用29,30,31。实验期间，大鼠可自由摄食和饮水。
2. 血压监测
注意：采用尾套容积描记法作为无创性血压测量方法，当从尾部血容量测量血压时，使用容积压力记录法（VPR）。
- 将大鼠单独放入铺有木屑的小笼中，在约 37 °C 条件下加热 10 分钟，然后将其置于可调节鼻部和动物入口门的定....
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结果
不同组分中的EVs浓度被测定（图2A）。实验结果表明，在一系列密度梯度溶液中，EVs的浓度呈现出典型的正态分布模式（图2B）。具体而言，在第9组分中，EVs浓度达到最高值（3.85 × 109），提示EVs的主要分布组分可能为第9组分36。
为测定蛋白质含量，采用BCA试剂盒评估不同组分中的蛋白质含量（图2C）。该方法显示，第9组分的蛋白质含量为0.417 µg/µL，进一步证明了细胞外囊泡（EVs）的分布情况。由于脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌特有的组分37,38，因此也使用内毒素检测试剂盒检测各组分中LPS的表达水平（图2D），以评估EVs在不同组分中的分布.......
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讨论
本研究聚焦于高盐饮食（HSD）下盐敏感型大鼠肠道微生物群的细胞外囊泡（EVs），并取得了一系列关键成果。首先，我们成功建立了一种基于密度梯度离心的高效提取方法，用于分离高盐饮食下盐敏感型大鼠肠道微生物群的EVs，并通过精细、标准化的动物实验操作和样本处理流程，有效去除了大部分非EV成分。该密度梯度离心EVs提取方法高效且可重复，优于传统的超速离心法，能更好地保持EVs的完整性和功能活性，从而确保样本质量和研究的可行性。
其次，通过多种动态技术对细胞外囊泡（EVs）进行了全面鉴定：颗粒大小和浓度检测表明，EVs具有特定的尺寸分布；LPS和BCA检测定量了EVs的蛋白质含量及LPS表达水平；透射电子显微镜（TEM）清晰展示了EVs的形态结构；蛋白质特征分析则界定了EVs的蛋白质谱。这些鉴定结果全面揭示了EVs的物理和生物化学特性，为后续研究提供了可靠的数据支持。
此外，利用16S rRNA基因测序技术深入分析正常饮食与高盐饮食来源的细胞外囊泡（EVs）在组成和来源上的差异，α多样性分析和β多样性分析结果表明，高盐摄入显著影响肠道微.......
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（82205240）、四川省自然科学基金（2025ZNSFSC1836）以及四川省骨科医院临床基础项目（PY202414）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 必备耗材 | |||
| 离心过滤器（10 kDa，2 mL） | Millipore | UFC903096 | |
| 离心管（50 mL） | BKMAN | 20220404 | |
| 离心管 | BECKMAN COULTER | Z30815SCA | |
| 真空过滤系统 | Biosharp | 24902581 | |
| 试剂 | |||
| 显色基质鲎试剂内毒素检测试剂盒 | Beyotime | 022124240705 | |
| 考马斯亮蓝快速染色液 | Beyotime | Z972241010 | |
| EDTA | Damas-beta | P3117308 | |
| 增强型BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | A006241112 | |
| 乙醇 | KESH | ||
| HCl | |||
| OptiPrep（60% 质量/体积，碘克沙醇） | Serumwerk | 00124 | |
| PBS | Labshark | 130114005 | |
| 磷钨酸 | RUIXIN | ||
| 蔗糖 | Damas-beta | P1917057 | |
| Tris（VWR） | Damas-beta | P3061764 | |
| 台盼蓝染色液（0.4%） | Beyotime | BD07242904 | |
| 仪器设备 | |||
| 吸光度酶标仪 | SpectraMax | ABP01690 | |
| 生物显微镜 | Motic | BA210Digital | |
| 台式离心机 | Cence | CHT210R | |
| 台式高速微量离心机 | DLAB | D3024 | |
| 固定角铝转子 + 500 mL 离心杯 | Cence | ||
| 高精度电子天平 | SKR | BN-200 | |
| 超净工作台 | 南通湖南科学仪器有限公司 | SW-CJ-2FDS | |
| SW 32.1 Ti 摆桶转子 + SW 32.1 Ti 转子吊篮 | BECKMAN COULTER | ||
| 透射电子显微镜 | JEOL | JEM-1400FLASH | |
| 管式旋转混合器 | |||
| 超速离心机 | BECKMAN COULTER | Optima XE-100 | |
| 超纯水系统 | ULPHW | UPR-II-15TNZ | |
| 水循环多功能真空泵 | 强强 | SHZ-D(III) |
参考文献
- Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
- Aschtgen, M. S., et al. Rotation of Vibrio fischeri Flagella Produces Outer Membrane Vesicles That Induce Host Development. J Bacteriol. 198 ....
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重印与许可
