本方案描述了如何测量小鼠的膝关节痛觉过敏。我们展示了急性膝关节疼痛小鼠模型以及骨关节炎（OA）模型中的示例。
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摘要
摘要
评估膝关节痛觉过敏可为测量膝关节周围敏化提供一种可靠的检测方法，并且代表了一种在关节炎啮齿类动物模型中可使用的、具有临床相关性的疼痛依赖性行为。已有多种方法被报道用于确定啮齿类动物对膝关节压迫反应的阈值。本文旨在改进现有方法，建立一种使用压力应用测量（PAM）装置评估成年小鼠膝关节痛觉过敏的标准化方法。本方案包含详细的操作步骤、针对新实验人员的培训建议以及获得稳定结果的实用技巧。我们提供了新实验者最佳培训方案的建议。最后，展示了短暂性痛觉过敏急性模型和以慢性疼痛为特征的实验性骨关节炎（OA）模型的典型结果。该方法对药理学干预高度敏感，适用于评估细胞因子等介质的作用，也适合用于中等通量的药物筛选实验。总之，所述方法为定量评估膝关节痛觉过敏提供了一种可靠且具有临床相关性的手段。
引言
骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，其特征为进行性软骨退化、滑膜炎、骨重塑和骨赘形成1，临床表现为疼痛和关节功能丧失。OA 是全球慢性疼痛的主要病因之一，由于活动能力下降以及焦虑、抑郁等相关健康问题，严重影响患者的生活质量2,3。临床上常用于缓解 OA 疼痛的药物包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、黏弹性补充剂、皮质类固醇和阿片类药物，但其疗效有限，长期使用还可能带来严重不良反应或成瘾风险1,4。
近年来，大规模队列研究已尝试系统描述进展期骨关节炎（OA）患者所经历的疼痛5。作为这一研究方向的一部分，多项研究在OA患者中开展了定量感觉测试（QST），旨在识别感觉神经敏化现象，并确定QST指标与OA症状、严重程度以及治疗反应之间的关联（详见综述6）。国际疼痛研究协会将敏化定义为伤害性感受神经元对其正常传入刺激的反应性增强，和/或对原本低于阈值的刺激产生反应的现象7。越来越多的证据表明，敏化是OA慢性疼痛发生的关键机制。其中一项能够可靠区分症状性OA患者与对照组的QST发现是疼痛压力阈值（PPT）降低。一项针对1003名参与者（包括膝关节OA患者与非患者）的PPT值荟萃分析显示，OA患者与对照组在膝关节局部及远离膝关节部位的PPT之间均存在显著的标准均数差（SMD，即均数之差除以标准差）8。
观察到骨关节炎（OA）患者对机械刺激表现出敏感化，表现为在关节施加外力时疼痛压力阈值降低，这提示了疼痛通路改变所导致的外周和中枢敏感化机制的存在6。这些变化的分子和细胞基础可在OA的啮齿类动物模型中进行研究。近年来，已开发出复杂的OA小鼠模型，以模拟膝关节OA缓慢进展的特征，该方法揭示了不同疼痛机制以时间依赖性方式发挥作用，可能具有重要的转化意义9。例如，在手术诱导的实验性膝关节OA过程中，小鼠在疾病早期即出现患侧后肢的机械性异常性疼痛，而负重能力的缺陷仅在疾病晚期才变得明显9。
与骨关节炎患者相似，在实验性膝骨关节炎早期，实验性骨关节炎小鼠对膝关节施加疼痛刺激的痛阈降低10这表明膝关节支配的伤害性感受器发生了致敏，这一点确实可以通过以下方法进行可视化和量化： 体内 腰段背根神经节的钙成像11评估膝关节痛觉过敏为测量外周敏化提供了一种可靠且相对简便的检测方法，因而代表了一种可在关节炎啮齿类动物模型中使用的、具有临床相关性的疼痛依赖性行为。已有多种方法被用于测定啮齿类动物对膝关节压迫反应的阈值。早期研究报道通过拇指与食指夹压膝关节，并记录动物出现的主观回缩反应或发声反应。12,13,14 2007年，Barton等人报道了压力应用测量法（PAM），作为一种新的行为学技术，用于记录炎症性关节炎大鼠膝关节的机械性痛觉过敏15随后在膝关节抗原诱导性关节炎的小鼠模型中验证了该方法 16PAM 是一种利用力传感器对受累膝关节施加逐渐增加的力，同时提供视觉反馈的技术，从而以可重复的方式实现膝关节的压缩，提高其敏感性和可重复性。此前发表的这两项研究主要聚焦于炎症性关节炎模型，其中膝关节肿胀较为明显。因此，我们旨在对这些方法进行改进和应用。15,16 建立一种评估小鼠膝关节痛觉过敏的标准化方法，该方法可便捷地应用于骨关节炎（OA）模型，并对药物干预具有高度敏感性，如本文所述。
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方案
所有实验方案均经拉什大学机构动物照护与使用委员会批准，归类为E类。本方案用于评估雌雄成年C57BL/6小鼠（10周龄至2岁）右膝在机械刺激下的膝关节痛觉过敏反应。如需测量左膝的痛觉过敏，需更换操作手。
1. 设置压力应用测量（PAM）设备
- 将一根电缆从PAM设备连接到计算机，再将第二根电缆从PAM设备连接到力传感器。
- 打开计算机并启动 PAM 软件。将最大压力设置为 450 g。
注意：该软件和小型换能器的测量上限为 500 g。因此，实验人员可在 450 g 至 500 g 范围内选择任意平台值，但在同一实验中最大截止值不得更改。 - 将小鼠置于测试室内15-30分钟，直至其适应环境并安静下来。确保测试室与小鼠饲养室分开，且环境安静。整个研究过程中应使用同一间测试室。
- 如有需要，可在研究开始前进行预适应，以使小鼠镇静——在此情况下，用左手握住小鼠背部，同时用第四指和第五指牢固压住尾巴，将动物固定th 和 5th 手指（如同正式实验时一样），在首次测试日前2天进行，以使小鼠适应检测环境。在同一实验中，所有小鼠的适应过程应保持一致。
- 适应环境后，确保小鼠处于安静状态，且在固定时不会挣扎。若小鼠未能保持安静，应将其放回笼中，并将测试推迟数日。
2. 膝关节痛觉过敏测量的训练
- 从未经处理的动物开始，学习识别动物在安静状态下的反应。这有助于实验者判断在该检测中何种反应属于正常反应。
- 使用一个由经验丰富的测试者已表征过膝关节痛觉过敏的实验模型，以明确预期结果。需认识到，在实验性骨关节炎模型中，动物的反应可能不如急性模型或炎症模型中那样明显。
- 使用利多卡因或阿片类药物以逆转疼痛相关行为，从而帮助评估如何区分应激反应与真正的疼痛相关反应。
- 所有测试均应以对分组情况设盲的方式进行。使用已知镇痛药物在对照溶剂实验中开展骨关节炎模型实验，并确认测试者能够区分这些组别并获得可重复的测量结果。
- 预期完成培训可能需要数周时间。
使用PAM对膝关节痛觉过敏进行基线测量
注意：许多炎症性关节炎或骨关节炎的实验模型为单侧性（例如，手术诱导的膝关节骨关节炎）。为了评估这些模型中的膝关节痛觉过敏，我们总是首先测量所有待测小鼠对侧膝关节的缩膝阈值，之后再检测同侧膝关节。例如，本方案可用于测量由DMM诱导的实验性骨关节炎中的膝关节痛觉过敏。在此模型中，关节损伤伴随膝关节痛觉过敏，术后第2周开始出现，并可持续至第16周17。
- 用左手托住小鼠，固定其背部，并用第四指 firmly 按住尾巴th 和 5th 手指
- 用另一只手（右手）的食指穿过换能器的系带形成环扣图1A）。然后，将带有换能器的食指插入一个透明塑料袋中（例如， 一个三明治袋）。这可以防止传感器被污染，例如被小鼠尿液弄脏。
注意：换能器较为脆弱，若未防止液体接触或施加过大的力，容易损坏。 - 用右手拇指和中指抓住右腿，并用中指轻轻将足部按压在左手大鱼际上图1B膝关节在测试开始时的正确位置约为90°屈曲。
- 膝关节屈曲90°，右手拇指置于膝关节外侧，示指接触换能器内侧，缓慢向膝关节施加压力。根据计算机软件提示（图中蓝线），以恒定速率（30 g/s）逐渐增加力量，直至达到450 g，或小鼠出现与疼痛相关的行为（如发声、肌肉抽搐、身体扭动或胡须运动）为止。
- 一旦小鼠出现与疼痛相关的行为，立即将带有传感器的手指从膝关节处撤回，并记录屏幕上显示的压力值（图1C当达到450 g时，若小鼠未表现出与疼痛相关的行为，仍应松开传感器，并将该次测试的缩足阈值记为450 g。
注意：每只小鼠表达疼痛反应的方式各不相同。因此，测试者需确定每只个体小鼠所表现出的与疼痛相关的行为。然而，部分小鼠完全不表现出与疼痛相关的行为；在此情况下，测试者可选择在数天后重新检测对侧膝关节，以确定该小鼠个体的疼痛反应，或继续测量同侧肢体并确定其行为模式。后者需要大量实践经验，因此建议初学者采用前一种方法。 - 将小鼠放回笼中，然后测试下一只小鼠。当所有小鼠的一侧膝关节测试完成后，返回第一只小鼠并重复测试过程。每侧膝关节测试2次，取两次结果的平均值作为最终结果，该数值称为缩足阈值。
- 如果两次测量之间的差异≥ 60 gst 和 2nd 测量时，取 3rd 测量并取三次测量结果的平均值作为最终数据。尽量避免使小鼠紧张，不要对同一只小鼠进行多次连续测量。因此，每次连续测量之间需间隔一定时间。
- 在盲法条件下测试膝关节痛觉过敏，以避免偏倚。使用单独的耳标以方便实施盲法。判断小鼠行为是否提示疼痛需要实践、经验和信心，因为测试者必须依靠自身判断。因此，对实验分组实施盲法至关重要。
4. 在急性膝关节疼痛模型中测量膝关节痛觉过敏
- 在测定膝关节痛觉过敏的基线值后，剃除膝关节周围毛发。
- 使用异氟烷麻醉动物，并通过脚趾夹捏反射确认麻醉效果。麻醉期间在眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。使用 Hamilton 注射器配合 30G 针头，经髌腱将 5 µL Pam3CSK4（1 µg 或 3 µg 溶于无菌水）或溶剂对照（5 µL）注射至右侧或左侧膝关节关节腔内。
- 在注射后 1 h、2 h、4 h、6 h 和 24 h，在盲法条件下评估膝关节痛觉过敏情况。
- 为评估利多卡因的作用，在 Pam3CSK4 注射后 4 h，向关节腔内注射利多卡因（20 mg/kg，生理盐水配制）或生理盐水。随后在注射后 0.5 h、2 h 和 20 h 评估膝关节痛觉过敏。
5. 在骨关节炎延长模型中对膝关节痛觉过敏的纵向评估
- 评估12周龄雄性C57BL/6小鼠的基础膝关节痛觉过敏状态。
- 对单侧膝关节进行内侧半月板失稳术（DMM）或假手术，操作步骤如文献18所述。
- 在术后2周、4周、8周、12周和16周评估膝关节痛觉过敏情况。
- 为评估关节内注射利多卡因的效果，在DMM术后4周评估膝关节痛觉过敏，随后在异氟烷麻醉下注射利多卡因（20 mg/kg，5 µL）或生理盐水，操作如步骤4所述。
- 在利多卡因注射后20分钟、120分钟和240分钟评估膝关节痛觉过敏情况。
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结果
急性膝关节疼痛模型中膝关节痛觉过敏的时间进程
所有展示的结果此前已由本研究团队报道，详细描述请参见文献10。第一个示例展示了一种诱导急性、短暂性膝关节痛觉过敏的模型。在本实验中，我们使用 Hamilton 注射器和 30G 针头，在异氟烷麻醉下，将 Pam3CSK4（一种合成的 Toll 样受体 2（TLR2）配体，1 µg 或 3 µg，溶于无菌水）以 5 µL 体积注射至 10 周龄未经处理的雄性 C57BL/6 小鼠膝关节腔内。该处理以剂量依赖性方式诱导膝关节痛觉过敏（图 2A），在注射后 4 小时达到峰值，并于 24 小时恢复至基线水平。为了验证该行为由关节内伤害性感受器介导，我们在 Pam3CSK4 诱导的膝关节痛觉过敏达到峰值时，向关节腔内注射利多卡因（5 µL，200 mg/mL）。该操作导致膝关节痛觉过敏被逆转（图 2B）。
实验性骨关节炎中膝...
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讨论
测量小鼠膝关节痛觉过敏为评估实验性关节炎相关的膝关节痛觉过敏提供了一种相对快速且简便的方法。从所示的代表性结果可以看出，该检测方法能够检测到急性发作且短暂的痛觉过敏（图2A）。我们已报道过向膝关节注射多种介质后可引发此类行为反应，包括聚集蛋白聚糖片段10、神经营养因子神经生长因子（NGF）19以及TLR4配体脂多糖（LPS）20。重要的是，该检测方法可用于实验性骨关节炎（OA）模型中膝关节痛觉过敏的纵向监测，如图3A所示。我们在其他OA模型中也报道过这一现象，包括部分半月板切除模型21,22以及闭合性损伤前交叉韧带断裂模型23。在小鼠原发性年龄相关性OA中，双侧膝关节均会发生OA病变
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披露
AMM 是诺华、默克、Roivant 和 Averitas 的顾问。她已从 Orion 和礼来公司获得研究资助。SI 和 REM 无可披露。
致谢
我们的研究由关节炎与肌肉骨骼及皮肤病国家研究所资助，资助/奖项编号：P30AR079206（AMM）、R01AR060364（AMM）、R01AR064251（AMM）、UC2AR082186（AMM）、R21AR085242-01（AMM）和 R01AR077019（REM）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C-C趋化因子2受体拮抗剂（CCR2RA） | Tocris | RS 504393 | |
| 计算机（任意类型） | 最低配置：Windows 7 | ||
| 利多卡因 | Sigma | L5647 | |
| 压力应用测量系统（P.A.M） | Ugo Basile | 38500 | 包含换能器、计算机和连接线缆 |
| 三明治袋 | Whole Foods Market | 6-1/2 x 5-7/8 | 用于覆盖换能器 |
| Toll样受体2配体 Pam3CSK4 | Invitrogen | tlrl-pms |
参考文献
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