使用压力应用测量评估小鼠膝关节痛觉过敏

摘要

该协议描述了如何测量小鼠的膝关节痛觉过敏。我们在急性膝关节疼痛的小鼠模型以及骨关节炎 （OA） 模型中展示了示例。

摘要

膝关节痛觉过敏的评估为测量膝关节的外周敏化提供了一种可靠的检测方法，并代表了一种临床相关的疼痛依赖性行为，可用于关节炎的啮齿动物模型。据报道，有几种方法可以确定啮齿动物对膝关节压迫的反应阈值。在这里，我们旨在调整现有方法，以开发一种标准化方法，使用压力应用测量 （PAM） 设备评估成年小鼠膝关节痛觉过敏。该方案包括详细步骤、针对新实验者的培训建议以及获得一致结果的技巧。我们为新实验者的最佳培训提供建议。最后，为以慢性疼痛为特征的急性急性痛觉过敏模型和实验性骨关节炎 （OA） 模型提供了代表性结果。该方法对药物干预高度敏感，使其适用于评估细胞因子等介质的作用和中等通量药物筛选测定。总之，所描述的方法为量化膝关节痛觉过敏提供了一种稳健且临床相关的方法。

引言

骨关节炎 （OA） 是最常见的关节炎形式，其特征是进行性软骨退化、滑膜炎、骨重塑和骨赘生长¹，临床表现为疼痛和关节功能丧失。OA 是世界上慢性疼痛的主要来源之一，由于行动不便以及焦虑和抑郁等相关健康问题，对患者的生活产生了深远的影响 ^2,3。治疗 OA 疼痛的常用处方药包括非甾体抗炎药 （NSAID）、粘液补充剂、皮质类固醇和阿片类药物，但它们的疗效有限，并且长期使用与严重的不良反应或成瘾风险有关^1,4。

近年来，大型队列研究试图仔细描述进行性 OA⁵ 期间经历的疼痛。作为这项工作的一部分，几项研究对 OA 受试者进行了定量感觉测试 （QST），其总体目标是确定致敏性并确定 QST 测量与 OA 症状和严重程度之间的关联，以及对治疗的反应^{（6 中}已论述）。国际疼痛研究协会将致敏定义为伤害性神经元对其正常输入的反应性增加，和/或募集对正常亚阈值输入的反应⁷。越来越明显的是，致敏是 OA 慢性疼痛的关键过程。有力区分症状性 OA 受试者与对照组的一个特定 QST 发现是疼痛压力阈值 （PPT） 的降低。对 1,003 名患有和不患有膝关节 OA 的参与者的 PPT 值（膝盖和远离膝关节的部位）的荟萃分析报告称，OA 患者和对照组之间的 PPT 存在显着的标准均数差（SMD，均值差异除以标准差）⁸。

观察到 OA 患者对机械刺激敏感，表现为当对关节施加力时疼痛压力阈值降低，这表明疼痛通路变化导致外周和中枢敏化的潜在机制⁶。这些变化的分子和细胞基础可以在 OA 的啮齿动物模型中进行研究。近年来，已经开发了复杂的小鼠模型来模拟膝关节 OA 的缓慢进展性质，这种方法揭示了不同的疼痛机制以时间依赖性方式运作，这可能具有重要的转化意义⁹。例如，在手术诱导的实验性膝关节 OA 过程中，小鼠在病程早期手术后爪出现机械性异常性疼痛，而负重缺陷仅在疾病晚期才变得明显⁹。

与 OA 患者一样，患有实验性 OA 的小鼠在实验性膝关节 OA¹⁰ 过程的早期对膝关节施加的疼痛阈值降低。这表明膝关节支配伤害感受器的敏化，这确实可以通过腰椎背根神经节的体内钙成像来可视化和量化¹¹。膝关节痛觉过敏的评估为测量外周敏化提供了一种稳健且相对简单的检测方法，因此代表了可用于关节炎啮齿动物模型的临床相关疼痛依赖性行为。据报道，有几种方法可以确定啮齿动物对膝关节压迫的反应阈值。较早的研究报告了用拇指和食指挤压膝盖，并记录动物的主观退缩反应或发声反应 12,13,14 2007 年，Barton 等人报道了压力应用测量 （PAM） 是一种新的行为技术，用于记录炎症性关节炎大鼠膝盖的机械超敏反应 ¹⁵.该方法随后在患有抗原诱导的膝关节关节炎的小鼠中进行了验证 ¹⁶。PAM 是一种使用力传感器对受影响的膝关节施加越来越大的力，同时提供视觉反馈的技术，从而能够以可重复的方式压缩膝关节，从而提高其敏感性和可重复性。这两项先前发表的研究侧重于炎症性关节炎的模型，其中膝关节肿胀很突出。因此，我们旨在调整这些方法^15,16 以开发一种评估小鼠膝关节痛觉过敏的标准化方法，该方法可以很容易地应用于 OA 模型，并且对药物干预高度敏感，如此处所述。

方案

所有实验方案均已获得拉什大学机构动物护理和使用委员会的批准。所描述的方案是评估右膝对任一性别的成年 C57BL/6 小鼠（10 周 - 2 岁）的机械刺激的反应性膝关节痛觉过敏。要测量左膝膝关节痛觉过敏，请换手。

1. 设置压力应用测量 （PAM） 设备

1. 将一根电缆从 PAM 设备连接到计算机，将另一根电缆从 PAM 设备连接到力传感器。
2. 打开计算机并启动 PAM 软件。将最大压力设置为 450 g。
   注意：软件和小型传感器可以测量高达 500 g 的重量。因此，实验者可以选择 450 g 到 500 g 之间的任何平台，但最大临界值在实验中不应改变。
3. 将小鼠留在测试室 15-30 分钟，直到它们适应并安定下来。确保测试室与饲养小鼠的地方是单独的房间，并且房间很安静。在整个研究过程中使用相同的测试室。
4. 如果需要，在研究开始前进行预适应以使小鼠平静下来 - 在这种情况下，通过左手握住鼠标、束缚背部并用^第 4^{和第 5 根} 手指牢牢按住尾巴来约束动物（就像它们在测试中一样），在第一个测试日之前 2 天，以使小鼠适应测定。在给定的实验中，以相同的方式适应所有小鼠。
5. 适应后，确保鼠标平静，被束缚时不会扭动。如果鼠标不冷静，请将其放回笼子并推迟测试几天。

2. 膝关节痛觉过敏的测量训练

1. 从天真的动物开始，学习如何在动物平静时识别反应。这将通知实验者识别该测定的正常反应。
2. 使用由经验丰富的测试人员表征膝关节痛觉过敏的实验模型，以了解会发生什么。认识到在实验性 OA 中，反应可能不如急性模型或炎症模型明显。
3. 使用利多卡因或阿片类药物来逆转疼痛行为 - 这将有助于评估如何区分压力反应与真正的疼痛相关反应。
4. 以对组分配不知情的方式执行所有测试。在载体对照实验中使用已知的镇痛药进行 OA 模型实验。确认测试仪可以区分这些组并获得可重复的测量结果。
5. 预计完成培训可能需要几周时间。

3. 使用 PAM 测量膝关节痛觉过敏的基线

注意：炎症性关节炎或骨关节炎的许多实验模型是单侧的（例如，手术诱导的膝关节 OA）。为了评估这些模型中的膝关节痛觉过敏，我们总是首先测量所有待测小鼠对侧膝关节的膝关节退出阈值。之后，我们测试同侧膝关节。例如，该协议可用于测量 DMM 诱导的实验性 OA 中的膝关节痛觉过敏。在该模型中，关节损伤伴有膝关节痛觉过敏，在手术后第 2 周发展，并持续到第 16 周¹⁷。

1. 用左手托住鼠标，束缚鼠标背部，用^第 4^根和第 5 根手指牢牢按住尾巴。
2. 将另一只手（右手）的食指穿过换能器的领带（图 1A）。然后，将带有换能器的食指放入透明塑料袋（例如，三明治袋）中。这将防止换能器被弄脏，例如被老鼠尿液弄脏。
   注意：传感器很脆弱，如果不能防止液体接触或施加过大的力，很容易破裂。
3. 用右手拇指和中指握住右腿，用中指轻轻地将爪子固定在左手的鱼际上（图 1B）。测试开始时膝关节的正确位置是屈曲 90° 左右。
4. 膝盖屈曲 90° 时，右手拇指接触膝盖的外侧。用食指触摸换能器的内侧，慢慢地对膝盖施加压力。按照计算机软件的指示（图表上的蓝线），以恒定速率 （30 g/s） 施加增加的力，最高可达 450 g，或直到鼠标出现与疼痛相关的行为，例如发声、肌肉抽搐、身体蠕动或胡须运动。
5. 一旦鼠标出现与疼痛相关的行为，用换能器从膝盖上缩回手指并记录屏幕上显示的压力（图 1C）。如果鼠标在达到 450 g 时没有表现出与疼痛相关的行为，则仍松开换能器并分配 450 g 的值作为该测试的退出阈值。
   注意：每只小鼠都以自己的方式表达疼痛反应。因此，测试者必须确定个体小鼠表达了哪些与疼痛相关的行为。然而，有些小鼠根本不表达与疼痛相关的行为，在这种情况下，测试人员可以在几天后重新测试对侧膝关节以确定小鼠的个体疼痛反应，或者继续测量同侧并确定行为模式。后一个选项需要很多小时的经验，因此建议初学者使用第一个选项。
6. 将鼠标放回固定架，然后继续测试下一个鼠标。当所有小鼠都测试了一个膝盖后，回到第一只小鼠并重复测试。测试每个膝盖 2 次，并将两个测试结果的平均值作为最终结果。这个数字称为提款阈值。
   1. 如果^第 1 次和^{第 2 次} 测量之间相差 ≥ 60 g，则进行^{第 3 次} 测量，并使用三次测量的平均值作为最终结果。尽量不要给小鼠带来压力，并避免在同一只鼠标中进行多次连续测量。这就是为什么每次连续测量之间必须有一些时间。
7. 在盲条件下测试膝关节痛觉过敏，以避免偏倚。使用单独的耳标以方便致盲。确定鼠标的行为是否表明疼痛需要练习、经验和信心，因为测试人员必须使用他们的判断力。这就是为什么对实验组不知情很重要的原因。

4. 在急性膝关节疼痛模型中测量膝关节痛觉过敏

1. 在基线测量膝关节痛觉过敏后，剃掉膝盖周围的皮毛。
2. 用异氟醚麻醉动物，并使用脚趾捏反射检查适当的麻醉。在麻醉下在眼睛上使用兽医软膏以防止干燥。使用带有 30G 针头的汉密尔顿注射器，通过髌腱将 5 μL 的 Pam3CSK4（1 μg 或 3 μg 溶于无菌水中）或载体对照 （5 μL） 注射到右膝或左膝关节的关节内间隙。
3. 在盲法条件下，注射后 1 小时、 2 小时、 4 小时、 6 小时和 24 小时评估膝关节痛觉过敏。
4. 为了评估利多卡因的效果，在注射 Pam3CSK4 后 4 小时关节内注射利多卡因（20 mg/kg 盐水中）或生理盐水。然后，在 0.5 小时、 2 小时和 20 小时后评估膝关节痛觉过敏。

5. 长期 OA 模型中膝关节痛觉过敏的纵向评估

1. 评估雄性 12 周龄 C57BL/6 小鼠的基线膝关节痛觉过敏。
2. 如第¹⁸ 条所述，对一个膝关节进行内侧半月板不稳定 （DMM） 或假手术。
3. 在手术后 2 周、 4 周、 8 周、 12 周和 16 周评估膝关节痛觉过敏。
4. 为了评估关节内注射利多卡因的效果，在 DMM 后 4 周评估膝关节痛觉过敏，然后在异氟醚麻醉下注射利多卡因（20 mg/kg 在 5 μL）或生理盐水，如步骤 4 所述。
5. 评估利多卡因注射后 20 分钟、 120 分钟和 240 分钟的膝关节痛觉过敏。

结果

急性膝关节疼痛模型中膝关节痛觉过敏的时间进程
显示的所有结果均已由我们小组之前报告过，我们参考¹⁰进行详细说明。第一个例子显示了一个诱发急性、短暂性膝关节痛觉过敏的模型。在本实验中，我们在异氟醚麻醉下使用带有 30G 针头的汉密尔顿注射器，将 5 μL 的合成 Toll 样受体 2 （TLR2） 配体 （1 μg 或 3 μg，溶于无菌水中） Pam3CSK4 注射到 10 周龄幼稚雄性 C57BL/6 小鼠的膝腔中。这导致膝关节痛觉过敏呈剂量依赖性（图 2A），注射后 4 小时达到峰值，并在 24 小时时恢复到基线。为了证明这种行为是由关节内伤害感受器介导的，我们进行了一项实验，在 Pam3CSK4 诱导的膝关节痛觉过敏的峰值处关节内注射利多卡因（5 μL 200 mg/mL）。这导致膝关节痛觉过敏的逆转（图 2B）。

讨论

测量小鼠膝关节痛觉过敏提供了一种相对快速和直接的方法来评估与实验性关节炎相关的膝关节痛觉过敏。从所示的代表性结果中可以看出，该测定可以检测急性发作和短暂的痛觉过敏（图 2A）。我们已经报道了这种行为对注射到膝关节的几种介质的反应，包括聚集蛋白聚糖片段¹⁰、神经营养因子、神经生长因子 （NGF）¹⁹ 和 TLR4 配体脂多糖 （LPS）²⁰。重要的是，该测定可用于实验性 OA 模型中膝关节痛觉过敏的纵向监测，如图 3A 所示。我们还在其他 OA 模型中报道了这一点，包括部分半月板切除术模型^21,22 和闭合损伤前交叉韧带断裂模型²³。在小鼠的原发性年...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C-C趋化因子2受体拮抗剂（CCR2RA）	托克里斯	RS 504393
计算机（任何类型）			Windows 7 最低要求
利多卡因	西格马	L5647
压力施加测量（P.A.M）	乌戈·巴西勒	38500	包括传感器、计算机、电缆
三明治袋	全食品市场	6-1/2 x 5-7/8	盖住换能器
Toll样受体2配体Pam3CSK4	Invitrogen	TLRL-PMS