Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.
Abstract
Óptico de imagem (OI) é uma ferramenta fácil, rápida e barata para a monitorização in vivo de terapias à base de células-tronco novo. A técnica é baseada na rotulagem ex vivo de células-tronco com um corante fluorescente, injeção intravenosa subsequente das células rotuladas e visualização de sua acumulação em órgãos-alvo específicos ou patologias. A técnica apresentada demonstra como nós rotulamos células-tronco mesenquimais (hMSC) por incubação simples com o corante lipofílico fluorescente DiD (C67H103CIN2O3S) e como nós rotulamos células-tronco embrionárias (CTEh) com o FDA aprovou o corante fluorescente indocianina verde (ICG). O mecanismo de absorção é através de adesão e difusão do corante lypophilic através da bicamada fosfolipídica da membrana celular. A eficiência de marcação é normalmente melhorado se as células são incubadas com o corante, isento de soro de mídia em vez de incubação em soro contendo mídia. Além disso, a adição do sulfato de protamina transfecção agente melhora significativamente a absorção de agente de contraste.
Protocol
Rotulagem de células-tronco mesenquimais com o corante fluorescente DiD Para iniciar o procedimento para a rotulagem de células-tronco mesenquimais, trypsinize e contar as células para obter uma suspensão com um número definido de células. Tome as células fora da incubadora e aspirar a media de idade dos frascos contendo as células a serem rotulados Lavar as células com 10 ml de Mg / Ca-free PBS. Aspirar o PBS. O Mg e Ca inibiria o Tripsina, portanto usamos PBS sem eles. …
Discussion
OI é uma relativamente nova técnica de imageamento, com base na detecção de fluorescência. OI é tão sensível quanto técnicas de radiofármaco baseado em imagem, mas não associados com a exposição a irradiação. OI fornece um meio eficaz de rastreamento de células não-invasiva e repetidamente, assim, fornecendo informações sobre a migração celular para o site de destino. Uma grande limitação da técnica é a penetração nos tecidos limitado de sondas fluorescentes in vivo. Assim, um acúmulo de marcador nos tecidos prof…
Acknowledgements
Este projeto foi suportado por uma concessão SEED Leon J. Thal do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia. Tobias Henning foi financiado por uma bolsa de Pesquisa do alemão Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Queremos agradecem Meneses Juanito para o seu conselho sobre a cultura de células estaminais embrionárias humanas.
Boddington, S., Henning, T. D., Sutton, E. J., Daldrup-Link, H. E. Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging. J. Vis. Exp. (14), e686, doi:10.3791/686 (2008).