利用荧光显微镜追踪脂质双层中的单蛋白

Summary

本文详细介绍了如何在固体支持脂质双层中创建单蛋白追踪样品。它还解释了一种单分子灵敏度和高速帧率的简单荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的过程。

Abstract

直接观察是科学发现和理解的基本方法。延时单分子荧光成像允许观察单个蛋白质的运动和与周围环境的相互作用，使通常在集合测量中隐藏的状态变得可见。单蛋白跟踪特别适合研究膜蛋白，其二维特性使得快速、广域成像且单荧光团灵敏度高。使用模拟跨膜或外周膜蛋白（如质膜或不同细胞类型细胞器膜）的人工脂质双层，可以测量近天然环境中的特定相互作用。它还允许逐步增加复杂度，一次只添加一个组件，同时抑制荧光和拉曼散射带来的背景干扰。通过增加温度控制，也可以确定单颗粒相互作用的热力学性质。本研究描述了利用Aquaporin-4进行样品制备、数据收集、单分子荧光追踪及脂质双层膜蛋白轨迹分析的方案。这项工作是基础性的例子，可以适配于不同的蛋白质和双层组成。

Introduction

在自然生物条件下，膜蛋白被广泛的相互作用网络包围，包括其他膜蛋白、细胞内外液体中的蛋白质、各种脂质和胆固醇、底物或配体、溶液相互作用以及细胞内外基质之间的相互作用。一种经典的生物物理学方法，旨在更好地理解具体和集体的相互作用，从单一组成部分开始，逐步引入额外组件，直到复杂度反映本地环境——这是一种“分而治之”的生物物理学方法。现代分子尺度研究这些相互作用的方法是通过利用延时单分子荧光成像直接观察，追踪单个蛋白质的运动和与环境相互作用。本文介绍了该方法的基本步骤，包括在石英覆盖层上形成脂质双层，以及以适合单蛋白成像的方式将大型膜蛋白插入这些预制双层。随后将采用“工作马”方案，用于追踪支持双层中的单一蛋白。

本文介绍了如何利用在亲水石英覆盖层上破裂的小型单层囊泡（SUV）制造固态支撑脂质双层。石英表面通过酸洗或紫外线臭氧清洗处理。用于生成SUV的脂质应尽可能匹配目标生物膜的主要化学成分（例如，水滴素-4（AQP4）存在于星形胶质细胞的细胞膜中，主要成分为POPC（46.4%）、POPE（8.5%）、PS（5.6%）、胆固醇（30%）、PI（2.5%）和SM（5.6%）^1,2。为防止与固体基底相互作用，将聚乙二醇（PEG）等添加剂嫁接到脂质上，使双层脱离表面 ^3,4。每种添加剂的用量必须仔细调整，以确保蛋白质扩散不受阻碍，同时提供足够的支撑以将膜从底物表面抬起。像环乙酰化脂质这样的添加剂通常表现出两个阶段：“刷相”和“蘑菇相”。刷相发生在PEG浓度高时，使聚合物直立以减少立体障碍。蘑菇相发生在低浓度下，当聚合物分离到可以随机形成螺旋时。一般来说，灌木阶段会阻碍扩散，但蘑菇阶段支持有限。刷相和蘑菇相之间的浓度最佳，提供支撑且对扩散影响最小，^3,4。

有些膜蛋白会自发插入固态支持的脂质膜中，如P450和细胞色素P450还原^酶5，而另一些则需要使用洗涤剂插入，这是一个复杂的过程。需要仔细清洗以去除这些洗涤剂以及任何可能干扰单蛋白追踪的未掺入蛋白质——这一过程将在后文详细描述。本文的主要重点是利用延时荧光成像制备单分子追踪（SMT）样品。这需要高倍率和数值孔径（NA）的物镜——通常为100倍和1.45纳米油^浸物镜6,7。它还需要高速、高灵敏度的相机（EMCCD、CMOS或ICCD相机）和激光激发。激光激发需要覆盖足够大的视场以测量蛋白质的长轨迹，这通常通过全内反射实现约50微米×100微米的消逝场，或利用束流整形光学（高斯到顶帽）约80微米×⁸⁰微米的上射照明，或采用高倾角层压光学片（HILO），其场域类似TIRF。全内反射荧光（TIRF）显微镜具有减少背景信号的优点。下面介绍了一种简单且相对廉价的TIRF显微镜设计。通过添加温度控制，可以测量多种热力学性质，如焓、熵和吉布斯自由能⁹。该技术还要求对膜蛋白进行荧光标记，标记程度足以确保大多数膜蛋白携带荧光标签。

本文关注的跨膜蛋白是AQP4。AQP4是一种水通道，极化于星形胶质细胞的末足及中枢神经系统血管的其他^区域。它每秒可运输多达30亿个水分子，参与水的稳态、细胞迁移、脑水肿、学习以及通过突触可塑性实现记忆形成¹¹。AQP4功能失调与多种神经系统疾病有关，包括脑水肿、视神经脊髓炎和癫痫12,13,14,15。AQP4是一种32-37 kD蛋白，取决于其异构体，具有四聚体四级结构，由八个疏水膜结构域通过连接环连接，一个细胞内N端结构域和一个大型细胞内C端结构域¹⁶。AQP4主要有两种同构型，分别是M1和M23;区别在于从甲硫氨酸1残基或甲硫氨酸23残基起始。研究表明，M1同工型可以根据其棕榈酰^化态与自身形成二元或三元组。M23同构体组装成大型蛋白质聚集体，称为正交粒子阵列（OAPs）。当M1同工型共表达时，通过在其外部形成外围蛋白涂层来限制OAP的生长，17,18,19。OAP聚集的动态可能是调节大脑水渗透性和稳态的关键因素。本文介绍了追踪膜中单个AQP4并观察单蛋白-蛋白质相互作用的必要步骤。

Protocol

1. 制备小型单层囊泡

1. 把脂质汤溶液从冰箱取出，让它们恢复到室温。
2. 取出一个干净的10毫升小瓶，冷却至室温。
3. 将900微升光谱级氯仿和100微升光谱级甲醇加入冷却圆底瓶中，然后在混合物中加入相应量的脂质。搅拌瓶子，确保脂质充分混合。
   注：其他作者使用不同的氯仿与甲醇比例，但我们发现形成均匀脂质饼的最佳比例为9：1。
   补充 文件1中提供了用于计算正确脂质含量的电子表格。如果准备脂质以验证基底表面脂质双层的形成，可以使用荧光标记脂质。
4. 如 图1所示，将真空蒸馏连接器放置在圆底烧瓶顶部，并将其连接到氮气管线（干燥装置）。
   注意：使用纯化N₂（g），并通过0.22微米滤纸后再连接到干燥装置。
5. 打开N₂（g），调整压力，使流量几乎感觉不到手背。
   注意：润湿手背有助于感知蒸发。
6. 让样品在N₂（g）流量下干燥2.5-3小时，定期检查氮气是否持续流动。样品很可能在半小时内看起来干燥;但继续用氮气流动2-2.5小时，以去除剩余溶剂。
   注意：样品也可以过夜干燥。
7. 在圆底瓶中每5.0微溶尔总脂质加入1毫升缓冲液。
   注：本研究所用缓冲剂包括100 mM HEPES、5 mM CaCl₂和140 mM NaCl;这也是样品制备过程中使用的缓冲液。
8. 在烧瓶上放一个玻璃塞，用石蜡膜包裹。
9. 将烧瓶夹在环形支架上，并将瓶底浸入设定在60°C的超声波器浴中。 让瓶子孵育1小时，每15分钟轻轻旋转一次，形成多层状脂质体，呈现为不透明溶液，瓶体上无脂质。
10. 孵育1小时后，打开超声波器（~35 kHz），并将振幅调至最高档。然后，在浴缸中移动瓶子，找到搅拌最剧烈的位置，使溶液在瓶内碰撞和喷射。用超声波治疗30分钟，想从不透明变为透明且略带乳白色的效果。
11. 将脂质溶液从烧瓶中取出，放入微型离心管中，然后在4°C下以100,000× 克 离心1小时。 将上清液从微离心管中取出。
    注意：管底可能会形成一个小颗粒。如果颗粒较大，丢弃并重复此过程。
12. 离心后使用SUV，保存在4°C下一周，或者保持-80°C加一些海藻糖。
    注意：推荐的海藻糖含量为每毫升脂质溶液1毫克。为了获得最佳效果，新的SUV可以每周制造并存放在冰箱中。
    注意：这只是准备SUV的一种方法。除了SUV外，还可以通过挤出或巨型单层脂质体通过电成法制备小、中、大单层囊泡20,21,22,23。

2. 蛋白质标记

注意：使用各种轭轭物（如NHS酯和马雷米胺）标记蛋白质的做法已有充分文献和理解。然而，标记程度（DOL）在单蛋白追踪中尤为重要。本研究关键在于确定每个AQP4四聚体上被标记的跨膜蛋白比例及荧光团的分布。

1. 将一根透析管放入含有0.1 M磷酸盐缓冲液、pH值为8.3的烧杯中，该缓冲液经过0.22微米过滤器。然后，让它倒置在缓冲液中过夜，让膜得到调节。
2. 第二天，将透析管内的缓冲液替换为蛋白质溶液。
   注意：蛋白质溶液的体积应在20-250微升之间。溶液中应含有约1-5毫克的溶解蛋白。
3. 蛋白质放入透析管后，倒置置于0.1 M磷酸缓冲液中过夜。
4. 透析后，将蛋白质转移到微离心管中。
5. 通过重复步骤2.1准备新的透析管。
6. 将NHS染料置于一小块称重纸上，然后转移到1.5毫升微离心管中，溶解于100微升DSMO中。随后在DMSO中进行两次1 mL 10倍稀释，利用最终稀释通过紫外-可见光谱确定每个样品的浓度。为了达到平均2-3的DOL，向蛋白质溶液中加入三倍摩尔的活性染料，同时轻轻摇晃。
   注意：标准紫外可见光谱仪即可满足此需求，尽管小体积光谱仪因样品量较大而更具优势。
7. 将活性染料加入含有蛋白质的微离心管中，体积相等。当活性染料和蛋白质加入后，至少让它吸动8小时。
8. 在核动后，将标记的蛋白质转移到步骤2.5中准备的透析管，并将其放入含有新鲜磷酸盐缓冲液的烧杯中。在缓冲液中放入搅拌棒，轻轻旋转6小时，然后更换缓冲液，再进行6小时透析。
9. 两次缓冲液交换后，将含有标记蛋白的透析管放入装有最终缓冲液的干净烧杯中。
   注：本研究使用的最终工作缓冲液为100 mM HEPES、5 mM CaCl₂和140 mM NaCl，pH值为7.4。
10. 透析后，使用紫外可见光谱仪测量DOL值。
    注意：遵循标准测量劳工时间（DOL）的方法非常重要。以下是计算方程。
    （1）
    其中染料峰值处测量的吸收度为 ，280 nm处的蛋白质峰为 。蛋白质的消光系数由 染料制造商提供（根据蛋白质分子量计算），而 和 则由染料制造商提供。

3. 制备直径25毫米的石英盖玻片

注意：以下是两种不同的方法：

1. 酸洗
   注意：已有多种已发表的酸洗工艺，包括食人鱼和碱蚀。我们发现，以下程序能提供极其干净且亲水的表面，无需刻蚀，这对于使用荧光成像进行单分子研究更为有利。
   1. 酸洗法需要在加热溶液时使用排风罩和个人防护装备（护目镜、实验服、手套）。烟斗内应备有碳酸氢钠喷射瓶以防泄漏。
   2. 将盖片放入烧杯中，注入纳米纯水、30%过氧化氢和浓硝酸，按体积比例（1：1：1溶液）等量填充。
   3. 将盖套在该溶液中加热30分钟，直到溶液开始起泡。
   4. 检查溶液，每10分钟轻轻旋转一次，防止封套粘在一起。搅拌溶液时，观察滑水滑开然后分离。一旦分离，逐渐减速以保持分离，让冒泡的溶液包裹着滑浆。
      注意：溶液不应加热过猛，因为反应会产生热量。将热板调节到轻微冒泡，通常调到最低档。在这些设置下，溶液温度保持在~70°C。 还建议使用新鲜的双氧水。
   5. 30分钟后或溶液停止起泡后，让1：1：1溶液冷却至室温，然后用纯净水轻轻搅拌彻底冲洗盖玻片。
2. 紫外臭氧
   1. 用 正己烷和甲醇用镜头纸巾清洁石英封套。
   2. 将盖套放入紫外线臭氧清洁剂中，待处理表面朝向灯具。
   3. 以5 psi压力将氧气注入腔室，持续5分钟;然后，关闭氧气流。
   4. 接着，开紫外线灯15分钟，让盖子至少放置10分钟，让臭氧逸出。
   5. 使用任一清洁方法后，务必立即使用清洗过的盖片。如果使用之前清理过的滑块，重复该过程以恢复表面。
      注意：紫外臭氧处理需要持续循环以去除空气中的臭氧。该系统应置于空气处理通气管下方或排气罩内。

4. AQP4的双层形成及被纳入双层膜

注：本研究使用的缓冲液包括100 mM HEPES、5 mM CaCl₂和140 mM NaCl，pH值为7.4。

1. 将刚清洗好的盖片放入25毫米样品架，使用1/4英寸SM1镜头管。然后，切出直径8毫米的双层防腐垫片，并将其定位在样品架中央（见 图3）。
2. 将50微升的SUV液滴滴到8毫米垫片中心，密封后在37°C下孵育1小时。
   注意：这使得脂质体能够与亲水性石英表面融合并破裂，形成连续的双层。
   垫片区域添加的脂质体数量可能不同，而较大的垫片可能需要更多脂质体才能形成连续的双层。然而，步骤4.2中规定的量几乎总是促进连续双层的形成。
3. 培养后，用移液器冲洗样品以去除溶液。然后，向双层中加入50微升新鲜缓冲液。然后，重复这个过程总共10次。
   注意：移液器尖端必须避免接触脂质双层，并且必须留有部分溶液以保持双层水分。当尖端接触液滴顶部时，你会看到它接触到。通过保持与液滴表面的最小接触，你可以去除溶液而不损坏双层。最终，液滴会反转并向垫片方向渗透;这是停止清除溶液的最佳时机。反射光应该会在此变化，并作为停止信号。如果你担心去除过多溶液，清洗时降低移液器的设置，留出适量的缓冲液，覆盖脂质双层。
   在这些条件下，脂质双层形成的完整性可以通过光漂白后荧光恢复（FRAP）提前评估。这需要脂质混合物中含有荧光标记为^{6、7、24、25}的成分。
4. 完成最终清洗后，再次取出缓冲液，并在该浓度或其胶囊浓度以下的洗涤剂中加入50微升所需蛋白质。在37°C下，蛋白质掺入至少1小时。
   注意：洗涤剂会温和地软化双层，帮助蛋白质融入膜中。该方案中使用的洗涤剂为50 μM n-十二烷基-β-D-硫麦芽苷（DOTM），一种非离子洗涤剂，蛋白质浓度为2 nM。
5. 一小时后，用缓冲液冲洗样品，去除未掺入的蛋白质和洗涤剂。
6. 向样品中加入5毫克保暖聚苯橡胶珠（生物珠），静置至少1小时后取出。样本随后即可进行成像（见下文）。

5. 防衰减添加剂

1. 将5毫克Trolox和80毫克D-葡萄糖溶解在10毫升缓冲液中（见上文）。摇晃并旋转，直到没有固体残留。在黑暗中过夜反转，然后用0.22微米滤网过滤溶液。每周准备新鲜食材。
2. 将6.5毫克葡萄糖氧化酶（1650微型）和8微升过氧化氢酶（29,200 U/mL缓冲液）溶解于92微升缓冲液中。轻柔混合溶液，避免涡旋，然后离心，将上清液转移到新管子中。保存温度为4°C，并避免光照。
   注意：这种溶液可以在冰箱中保存数月;但如果出现浑浊，应将其丢弃，准备新的溶液。
3. 将5.1的99微升溶液与步骤5.2的1微升溶液混合到新管中。样品最后冲洗后，在样品表面加入抗衰变溶液（称为成像溶液）。
   注意：抗淡化溶液可以改变跨膜蛋白的功能;验证与系统的兼容性非常重要。

6. 显微镜设置与设置

注：本次单分子研究使用了定制的TIRF显微镜。本节介绍了适用于快速延时摄影（图4）的基础荧光显微镜的主要组件和关键对准技术，该仪器是可靠的。

1. 使用633纳米的He：Ne激光激发样品。激光器通过带通滤波器和1/4波片，精细激光线，将激发从线偏振光转换为圆偏振光。
   注意：圆偏振会减少探针方向的影响。
2. 光束通过300毫米透镜和633纳米激光线滤光片，反射到633纳米长通二向色镜，聚焦于100倍、1.45牛顿·安油显微镜的背面。将光束对准，确保它平稳穿过物镜中心，并在离开物镜时保持直线。
   注意：此时显微镜已配置为上荧光（epi）。可以在底部透明的奶油汁中加入少量奶粉。然后将白油放在显微镜物镜上，中间滴入一滴浸油。这样你就能观察到光束是直接穿过物镜的。
3. 荧光标记蛋白的发射通过物镜、二色镜、长通滤光片和300毫米透镜，然后被成像到EMCCD相机上。使用更长焦距的管状镜头放大相机上的图像，提升超定位精度，这对缓慢移动的跨膜蛋白和聚集体非常有益。一定要把相机像素校准到纳米级。
   注意：不过，使用物镜制造商指定的管状透镜可实现1倍放大，通过将荧光聚焦到更少像素，提高信噪比。常见焦距包括200毫米、180毫米、165毫米和164.5毫米镜头。我们建议使用1951年美国空军的放大靶。在该配置中使用300毫米镜头，测量到74纳米像素校准，总放大倍率为170倍。
4. 使用物镜套和配备佩尔帖加热/^{冷却器的样品}架控制样品温度。
   注意：保持温度稳定对于确保显微镜的热稳定性、实现准确的温度相关测量和仪器聚焦至关重要。
5. 压电执行器将样品沿XYZ方向移动。样品聚焦后，利用连接在最终旋转镜上的舞台将光束调整到显微镜物镜的边缘（见 图4），直到达到临界角度。这会产生一个消逝激发场。显微镜现已设定在TIRF中。
   注意：当激光反射的反射为直线（而非斑点）且样品背景强度减弱并拉长时，你可以判断显微镜处于TIRF状态。

7. 数据收集

注意：摄像头必须设置以便快速收集数据。

1. 将垂直像素移位速度设为约600纳秒，并超频垂直时钟电压（通常为+4）。然后，将水平像素读出设置为最大值（本例中为30 MHz，16位）。将前置放大器增益调整为2，并将放大器输出配置为电子倍增。最后，将电子倍增器增益设为最高。
2. 将曝光设置为25毫秒。在25毫秒曝光时，确保帧率略长（此处所用相机为25.802毫秒）。
3. 调整激光功率，使信号清晰地高于背景。
   注意：调节激光功率可能具有挑战性。太高，探针会很快漂白;太低，信噪比会让追踪变得困难。我们建议将功率设置为信号比背景高出3-5倍，尤其是信号最弱的粒子。第二部分解释了分子亮度为何呈现出分布。
4. 收集足够的数据，每个采样至少提供1000条音轨。

8. 跟踪分析

注意：在我们的实验室中，单粒子跟踪分析通常基于Crocker和Grier的工作，并由作者修改的MATLAB定制脚本进行，3^、26、27。以下是使用 ImageJ 的描述，ImageJ 是一款面向研究社区的免费软件。两种方法的结果完全相同。

1. 裁剪数据集到一致大小后，用ImageJ进行背景校正。
   注意：如果收集的数据在不同组之间相同，则无需裁剪。通常只有当相机传感器上的关注区域在数据采集之间发生了移动时才会这样做。ImageJ 的功能可以通过插件大幅扩展。一种选择是安装并使用 FIJI，它包含一套标准插件的 ImageJ。这些插件中有TrackMate，将用于^28,29号协议。
   ImageJ 维基网站提供了许多插件的攻略和示例。它还包含视频教程。
2. 在FIJI内，拖拽电影或堆叠的*.tif文件进行分析（见 补充文件2）。
3. 接下来是像素校准细节。在 “分析 ”标签页中，选择 设置缩放 ，并应用仪器的像素-距离校准。
4. 保存一份副本，以便跟踪与原版的更改。
5. 从所选窗口中减去背景，并将其应用到原始数据的保存副本上。在 “进程 ”标签页中，选择 “减去背景”。
   注意：这将根据数据进行优化。一个好的起点是使用比被成像粒子更大的“滚动球”。
6. 在 插件 标签页中，选择 “跟踪|”TrackMate。这会打开 TrackMate 对话框，引导用户完成追踪流程。
   注意：跟踪完成后，可以导出轨道以便在ImageJ之外进行进一步分析。

9. 数据处理

注意：本文讨论了如何处理代表性数据，以及如何计算步长分布和获得平均扩散常数。

1. 将图片堆栈拖拽到FIJI中;然后进行校准（74 nm/像素）。
2. 用滚动球减法减去背景，宽度为5像素。将田地裁剪为四个独立的11微米×11微米区块，并单独分析。
   注意：这是为了在追踪膜蛋白时，最小化因激发场引起的阈值方差。
3. 启动 TrackMate 插件。确认校准已应用于像素（见 补充文件3），且时间覆盖所需范围。
   1. 在TrackMate中，选择高斯拉普拉斯算子（LoG）作为粒子的检测方法，使用预处理中位数滤波器估计直径为350纳米。点击 预览 按钮以验证检测到的粒子是否合理。
      注意：有些粒子可能明显在背景中;不用担心这些——它们会在下一步被消除。
   2. 当计数设置满意后，处理剩余的堆栈，然后进行阈值检测。使用自动阈值设置或拖动选择框来调整阈值。
   3. 在选择如何可视化检测到的粒子后，选择跟踪方法：该数据集的高级卡尔曼跟踪器，设置如下：搜索半径为350纳米，最大帧间隙为2帧。
      注意：还可以添加罚分、赛道分割和赛道并入。该数据集仅进行了跟踪。
   4. 决定如何筛选和可视化这些轨道。
      注意：在本数据集中仅显示检测到的斑点（见 补充文件4）。
   5. 处理完各轨道后，将跟踪数据导出为XML文件，用于电子表格编辑软件（参见 补充文件5）。

Results

如协议第2节所述，赖氨酸通过与荧光染料分子（NHS-染料）共軛的NHS酯进行标记。与蛋白质结合后，使用紫外可见光谱仪测量DOL。在本次实验中，AQP4四聚体的DOL为4.12。接着，利用下方提供的泊松分布确定每个AQP4四聚体至少含有一个染料分子的概率。

（2）

其中P为每个AQP4被标记的概率，使用公式 2，每个AQP4四聚体带有荧光标记的概率为98%。图 2 显示了每粒四聚体标签的分布，反映了样品中观察到的亮度分布。

本例数据中，单一荧光团的信噪比比为背景的8-9倍，最亮粒子则高出15-20倍以上。这种差异来自激发束中的位置以及协议步骤2中描述的DOL。

在生成的XML文件中，感兴趣的列分别是J、K、L和M，分别对应粒子编号ID、粒子被检测的帧、粒子的X位置和Y的位置（参见 补充文件6）。在文件的第二张图中，计算了步长分布和平均扩散系数，步长为粒子在帧间移动的距离，平均扩散由方程 3给出：

（3）

其中D_ave是平均扩散系数，Δt是帧率。该方程假设布朗运动，通常适用于小位移，可以通过分析单个轨迹^样本中的均方位移与时间标签来^验证。

步长直方图显示扩散粒子的分布，这可归因于不同尺寸的OAP（见图5）。

图1：脂质干燥装置。 该装置由一个10毫升圆底烧瓶组成，带有真空蒸馏连接器。氮气以低压通过0.2微米的注射器过滤器进入，过滤器带有一根针头连接到黄色合成帽，并连接到真空蒸馏连接器。压力通过连接在带有截断针头的注射器上的Tygon管释放。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：使用方程2的每个AQP4单元荧光标记的预期分布。 最可能的荧光团数量为4个，且98%的AQP4会带有荧光标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：样品架组件。 该组件由一根1英寸SM1透镜筒组成，去除了公螺纹并进行了斜角处理，以防止干扰显微镜物镜。包含石英盖片和防腐垫片。整个组件由SM1卡环固定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：显微镜。 右侧是显微镜的简化示意图;绿色线表示激光发出的激发光。从右侧开始，激光光线穿过一个1/4波片，然后被一个300毫米透镜聚焦。光线通过长通二色镜反射到物镜上，聚焦到后光圈。通过使用平移镜移动激发光束，将光束定位在物镜口径边缘，在样品中形成消逝场。对焦发出的光被物镜收集，并用红线表示。发射的光随后通过二色性滤镜，再经过长通滤镜，并被300毫米镜头聚焦到相机上，提供1.7倍光学放大（物镜和管状镜的总放大倍率为170倍）。左侧是显微镜的图像。请注意，还会使用额外的旋转镜来正确定位激光器。同时，检测臂被布置以最大化从荧光标记的跨膜蛋白中光子的收集。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：步长直方图。 蓝线带红圈是所有步长的直方图。黑线是多重扩散系数的拟合。步长概率分布为： 其中f_i 是每种扩散粒子的分数种群，假设每个粒子都经历布朗运动。直方图和拟合显示了慢速和高速粒子的异质分布，这归因于多个OAP尺寸的分布。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：用于计算分子浓度、总脂质含量及可选荧光/FRAP成分的电子表格计算器，用于SUV制备。请点击这里下载此文件。

补充文件2：用于轨迹追踪的原始单分子荧光显微镜延时图像栈（TrackMate教程的源文件）。请点击这里下载此文件。

补充文件3：处理前显示强度和背景的单分子原始荧光数据动画预览。请点击这里下载此文件。

补充文件4：滤波粒子路径（阈值后）动画，显示AQP4随时间的代表性轨迹。请点击这里下载此文件。

补充文件5：使用TrackMate输出显示AQP4分子全场粒子跟踪的动画叠加。请点击这里下载此文件。

补充文件6：显示用于扩散分析的提取轨迹坐标和计算步长分布的电子表格。请点击这里下载此文件。

Discussion

本文介绍了一种单颗粒追踪方法，用于直接观察单个膜蛋白在固体支持脂质双层膜中运动并相互作用的过程。AQP4被选为代表性例子，是因其能够形成由不同异构型^32、33、34调控的动态自组装。上文，我们概述了一种可靠的样品制备方法以及在毫秒级时间尺度上追踪单膜蛋白的关键参数。步骤包括：（1）准备SUV，（2）确定适当的荧光标记水平，（3）制备固体支撑，（4）在固体支持脂质双层内创建跨膜蛋白样本，（5）制备抗衰变剂，（6）构建简单的单分子显微镜，（7）收集单分子追踪数据，以及（8）使用ImageJ分析追踪数据。

所描述的分步方法在概念上非常直接;然而，每一个关键步骤都有其自身的陷阱和局限。其中，样品制备最具挑战性（步骤1-5）。因此，需要注意几个细节。第一个是如何制造固体支撑脂质双层。主要有三种方法：（1）朗缪尔-布洛杰特（LB），（2）SUV熔融与破裂，（3）35,36,37,38,39。每种方法都有其优缺点。例如，Langmuir-Blodgett 方法能更好地控制双层的性质和化学组成，包括两片叶片之间的不对称组成，并允许以受控方式形成多层。然而，使用LB槽在技术上要求高、耗时且成本高昂，获得³⁵个。自旋涂层是一种相对简单的脂质双层制造技术;然而，它倾向于产生多层材料，且需要大量材料，通常不切实际地大量。囊泡融合和破裂是简单的过程，只需少量材料。然而，形成亲水表面至关重要，有些脂质组成比其他成分更容易通过囊泡融合形成双层（例如，在我们的实验室中，我们发现净负电荷的囊泡仅通过囊泡融合加入二价阳离子和延长孵育时间后形成双层）⁴⁰。除了建立亲水表面（步骤3）外，通过囊泡融合形成固态支撑双层时，其他重要考虑因素包括在加入膜蛋白前后清洗新形成的双层。插入前清洗去除多余的SUV和较大的多层囊泡（MLV），膜插入后的最后清洗则清除未掺入的蛋白质。清洗不足可能会在跟踪研究中引入背景信号。

我们筛选了多种洗涤剂，以确定它们是否适合将跨膜蛋白插入固体支持脂质双层，包括C12E9、Tween-20、TritonX-100等多种。我们偏好用DOTM洗涤剂，因为它易于去除，且对膜最温和（不太可能破坏膜的完整性）。蛋白质的摄入量至关重要。过多的话，单线轨道将无法被观察到。在将该方法应用于其他跨膜蛋白时，需通过反复试验调整其量。然而，该程序中给出的数量是一个极好的起点。洗涤剂的用量必须保持在或低于临界胶束浓度;否则，双层将被溶解并从石英基底中去除。

膜蛋白插入支持脂质双层的过程需要针对不同实验条件进行优化。然而，有几种常见方法可以实现这一点，包括利用蛋白蛋白和将膜蛋白直接掺入预形成的双层⁴¹中。蛋白蛋白体是一种脂质体，比如SUV，里面嵌入了蛋白质。这些蛋白蛋白体可以与预先形成的固态支撑脂质双层融合，或在双层形成⁴²时与SUV同时整合。融合导致破裂，释放蛋白质进入膜中。实现简单，但会导致膜蛋白的随机取向。这可能导致与固体基体强烈相互作用，从而根据蛋白质取向的不同产生不同的扩散^特性3。该方案描述了一种利用直接掺入的方法，从而在取向上偏好蛋白^2,5,43,44一侧具有较大亲水结构域的其他膜蛋白。

直接观察是科学发现中强大的工具。动态单分子成像在膜-蛋白质生物物理学中尤为重要，通过观察单个蛋白质的运动和相互作用来检验假设或提出更准确描述蛋白质行为的新假设。本文所述的方案和方法非常适合二维固体支持脂质双层，但可扩展至具有^多组分的复杂环境，2、活细胞^{34、45、46、47}和三维⁴⁸。单分子跟踪为许多其他实验打开了大门，包括双色单分子追踪⁴⁹、单分子FRET^50,51以及动态超分辨率成像，如随机光学重建显微镜（STORM）和点积成像纳米尺度地形成像（PAINT）。通过扩展仪器以包含温度控制，还可以探索膜蛋白的热力学特性 26,43,52。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4波片	索拉布	WPQ05M-633	确保激光匹配
100倍石油目标	奥林匹斯	12-563-659	1.45 N/A 消色差
16：0-18：1 PC	Avanti极地脂质	850457	POPC磷脂
体育课18：0 PEG2000	Avanti极地脂质	880210	铵盐
300毫米镜头	索拉布	AC254-300-A-ML
633 nm He：Ne 激光	梅勒·格里奥	05-LHP-927	可以切换到其他光源和波长
633nm带通滤波器	色辉科技	633/10X	与所用激光的匹配
655nm长通滤波器	色辉科技	ET655LP	调整以匹配染料/激光的波长
安多尔·索利斯一世	安多尔	安多尔·索利斯一世	图像捕捉软件
ATTO 655及nbsp;	ATTO-TEC	公元655年	NHS-酯修饰，即任何适合单分子工艺的修饰染料都可以使用。推荐使用ATTO，但也可以使用Cy5/7
生物珠 SM-2 树脂	BioRad	1523922
氯化钙	米利波尔西格玛	C4901
过氧化氢酶	西格玛-奥尔德里奇	C3155-50MG	来自牛肝、水溶液和GE;30000单位/毫克
氯仿	费舍尔科学公司;	C547-1	HPLC或光谱级
胆固醇	西格玛-奥尔德里奇	C8667-500MG
覆盖层	ESCO光学	R525000	25毫米石英
二色分光器	塞姆罗克	FF545/650-Di01-25x36	调整以匹配染料/激光的波长
EMCCD摄像机	安多尔	iXon Ultra 888
猎鹰管 15mL	格赖纳生物一号	188261	Cellestar细胞培养管
葡萄糖氧化酶	西格玛-奥尔德里奇	G2133-50KU	来自黑曲霉属，VII型，≥100000单位/克固体（不含添加氧）
热风枪	港口货运	56434	用于加热对抗胶片，通常任何热风枪都可以使用
天哪	费舍尔生物试剂	BP310-500
低自荧光浸油	索拉布	MOIL-30
甲醇	费舍尔科学公司;	A452-1	HPLC或光谱级
微离心管	VMR	525-1126	1.5毫升
微型移液器	埃彭多夫		多种情况;1000 和微型;L、100和微型;L和10及微距;L被建议
Ø1.5英寸镜头管	索拉布	SM1.5L10	外螺纹被削短以便样品准备
光学表	纽波特	RPR信实	塔贝尔的大小取决于可用空间
光学组织	索拉布	MC-50E	清洁各类组件
副胶片	米利波尔西格玛	P7669	在过程中不要检查任何对气体发荧光的迹象
压电致动器	纽波特	PZA12
气动振动隔离器	纽波特	I-2000系列	用于稳定光学表以防不均匀
冷藏浴	费舍尔科学公司;	等温3016
快门控制器	索拉布	SC10	与影像软件相关联
氯化钠	米利波尔西格玛	S988
雄顶滤镜	米利波尔西格玛	S2GPT05RE
开关盒驱动和控制器	纽波特	PZC200	舞台控制员
注射器过滤器	J.T.贝克	SF01-98	PES 25mm 0.2 及微距;M
TEC元素	索拉布	TEC3-2.5	用于将佩尔蒂尔热泵与样品架和物镜套连接起来
温度调节器	米斯特特工程	TEC-1091
温度探测器	索拉布	TH100PT
热敏电阻	索拉布	TH10K
管透析仪	G生物科学	786-611	4K MWCO
紫外线臭氧清洁剂	诺瓦斯坎	PSDP_UV	Pro Series - Digital
Zoom 光学公司及nbsp;	索拉布	SM1NR1