脑类器官是研究线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及中风样发作（MELAS）的宝贵模型，有助于揭示其潜在的病理生理机制，并为药物筛选提供平台。源自携带不同异质性水平致病基因细胞系的类器官表现出显著的表型差异。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及类中风发作（MELAS）是一类最常见的由线粒体tRNALeu中m.3243A>G变异引起的线粒体疾病。为了研究MELAS的发病机制，我们利用来自一名携带m.3243A>G变异的MELAS患者的多个诱导性多能干细胞（iPSC）系，生成了脑类器官。这些细胞系具有相同的核遗传背景，但在涉及m.3243A>G变异的异质性水平上有所不同。我们观察到类器官在大小、形态以及神经诱导效率方面存在显著差异，且这些差异与异质性程度相关。将类器官中解离出的神经元转移至二维培养系统，该系统操作简便，适用于高通量药物筛选。此外，类器官在神经网络形成方面也表现出依赖于异质性水平的显著差异。我们的研究结果表明，来源于患者的基于iPSC的类器官模型是研究MELAS发病机制及开展药物筛选的有效平台。本视频展示了全面且易于操作的方法，包括类器官生成及表型评估的实验方案。
引言
线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）是一类以神经功能障碍、卒中样发作为特征，并伴有多种全身性症状的线粒体疾病。最常见的致病原因是线粒体亮氨酸tRNA基因MT-TL1中的m.3243A>G变异1。该变异被认为会损害反密码子上的牛磺酸修饰，从而降低亮氨酸的翻译效率，导致MELAS中的线粒体功能障碍2,3,4。值得注意的是，已有报道称高剂量牛磺酸治疗后症状有所改善5,6。然而，部分患者无治疗反应，提示在携带m.3243A>G变异的个体中，可能还存在其他尚未明确的病理生理机制参与疾病的发生发展。
为了阐明由遗传变异引起的疾病机制，理想的实验模型应确保除致病变异外所有变量均相同，从而实现准确的表型比较。对于核基因疾病，通常使用经过基因组编辑、变异已校正的细胞系和动物模型作为对照。然而，即使借助先进的基因组编辑技术，线粒体DNA（mtDNA）变异的修复在技术上仍然具有挑战性7因此，构建具有相同核背景的实验模型仍然具有挑战性。为解决这一问题，我....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
两个iPSC细胞系（2-6和2-8）来自同一位MELAS患者的成纤维细胞，采用已建立成熟的方法获得8。它们仅在异质性水平上存在差异。来源于健康个体的414C2 iPSC细胞系被用作对照。本研究采用的方案遵循北里大学医学院伦理委员会的指导方针（#G22-02）。
1. 细胞培养
- 解冻冻存的细胞
- 按照制造商说明，用层粘连蛋白包被6孔板。
- 将含10 µM ROCK抑制剂的无饲养层iPSC培养基预热至37 °C。
- 从液氮（LqN2）罐中取出冻存的iPSC冻存管，在37 °C水浴中快速解冻。
- 将解冻后的细胞悬液转移至10 mL预热的培养基中，在室温（22 °C）下以120 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液，轻轻敲击离心管使沉淀重悬。加入新鲜培养基，将细胞接种至预先用层粘连蛋白包被的6孔板中。在37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中孵育。
- 更换培养基
- 每1-2天更换一次培养基（不含ROCK抑制剂）。
2. 脑类器官的生成
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们采用基于Nakamura等人9的稍作修改的相对简单方案，生成了脑类器官并进行了二维神经元培养（图1）。先前的方案使用V型96孔板，而本研究采用U型96孔低吸附板，以使细胞在每孔中央自然聚集。利用健康对照iPSC系414C2，我们在第30天成功诱导出含有FOXG1阳性神经元的脑类器官（图2A、D、E），并在第60天获得了二维培养的神经网络（图3A）。
已利用患者来源的iPSC细胞系研究MELAS的病理生理学机制8。通过常规DNA提取结合qPCR检测，证实m.3243A>G变异的异质性水平与既往报道的数值一致8。在这些细胞系中，2-8细胞系表现为低异质性（LH）水平，而2-6细胞系则表现为高异质性（HH）水平（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由人胚胎干细胞（ESCs）/诱导多能干细胞（iPSCs）诱导生成的类器官是研究罕见难治性疾病颇具前景的疾病模型，然而脑类器官的制备通常需要长达数月的培养周期10，并依赖昂贵的设备，例如可连续搅拌培养基并为长期三维细胞培养维持稳定条件的工程化容器。在本研究中，我们利用常规细胞培养设备在较短时间内成功建立了脑类器官。通过使用携带线粒体DNA m.3243A>G变异的MELAS患者来源的iPSCs，我们成功鉴定了疾病特异性细胞表型。
我们采用 Nakamura 等人在 2019 年发表的实验方案，并进行了少量修改。在他们的原始研究中，第 0 天使用 V 型 96 孔低吸附培养板以促进 iPSCs 的聚集。然而，在本研究中，我们采用了 U 型 96 孔低吸附培养板，使细胞能够在孔的中心自然聚集。我们认为使用高质量的低吸附培养板对获得成功结果至关重要。此外，先前的研究9在分化过程中将类器官培养于摇床上。但在本方法中，我们省略了摇床的使用，因为类器官在振荡过程中容易发生聚集。在长期培养中，摇.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
414C2 诱导多能干细胞（iPSCs）由 RIKEN BRC 提供。本研究获得日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）（项目编号：24H00648 至 M.F.，23K08971 至 C.S.）以及日本医疗研究开发机构（AMED）转化研究网络计划（项目编号：25yf0126001j002 至 M.F.）的经费支持。F.B. 获得了德国学术交流中心（DAAD）奖学金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 细胞培养皿 | corning | 353003 | |
| 6 孔超低吸附表面培养板 | corning | 3471 | |
| 70 μm 细胞筛 | corning | 352350 | |
| Accutase | nacalai tesque | 12679-54 | 用于解离iPSCs的酶 |
| B27 添加剂 | Thermofischer scientific | 17504001 | |
| 不含维生素A的B27 添加剂 | Thermofischer scientific | 12587010 | |
| β-巯基乙醇 (2-ME) | sigma | M3148 | 根据机构规定进行废弃处理。 |
| 细胞培养6孔多孔板 | corning | 353046 | |
| 细胞保存吸头 | BMBio ECO | BMT-200W | 宽口移液吸头 |
| 细胞刮刀 | SUMITOMO BAKELITECO., LTD. | MS-93100 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM710 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3050 | |
| 小鼠层粘连蛋白1培养基质 | R&D | 3400-010-02 | 用于包被解离神经元二维培养的培养板 |
| DMEM/F12 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 042-30795 | |
| 荧光封片介质 | DAKO | S302380-2 | 封片介质 |
| FOXG1 抗体 | abcam | ab196868 | |
| Glutamax | Thermofischer scientific | 35050061 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | Thermofischer scientific | A32723 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555 | Thermofischer scientific | A32732 | |
| 硫酸乙酰肝素 (HS) | sigma | H7640 | |
| 高容量RNA至cDNA试剂盒 | Thermofischer scientific | 4387406 | 用于从RNA合成cDNA |
| Hoechst 33258 | Thermofischer scientific | H3569 | |
| ImageJ | 版本 1.52a | 用于测量类器官的大小和圆形度 | |
| iMatrix-511 丝蛋白 | Takara Bio Inc. | 892021 | iPSC培养用培养板包被材料 |
| 胰岛素 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 090-06481 | |
| IWP2 | Tocris Bioscience | 3533 | |
| Keyence BZ-X810 | Keyence | BZ-X810 | 用于获取图3A图像 |
| LSM710 | Carl Zeiss AG | 共聚焦显微镜 | |
| LSM980 | Carl Zeiss AG | 共聚焦显微镜 | |
| LUNA 通用qPCR预混液 | New England Biolabs | M3003 | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| N2 添加剂 | Thermofischer scientific | 17502001 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermofischer scientific | 21103049 | |
| 神经元解离溶液 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 291-78001 | |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | nacalai tesque | 06344-56 | |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch Inc. | 005000121 | |
| Nunclon Sphera 96孔圆底微孔板（U型底，经Nunclon Sphera处理） | Thermofischer scientific | 174929 | |
| 多聚甲醛 (PFA) | nacalai tesque | 09154-85 | 根据机构规定进行废弃处理。 |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | |
| PBS | nacalai tesque | 27575-31 | |
| 青霉素/链霉素 (PS) | nacalai tesque | 26253-84 | |
| 聚-L-鸟氨酸 (PO) | sigma | P3655 | |
| 聚氧乙烯(10)辛基苯基醚 (Triton) | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 168-11805 | |
| PRISM | GraphPad | 版本 9.5.0 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | 用于提取总DNA |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | 用于提取总RNA |
| SB-431542 | Cayman Chemical | 13031 | |
| 载玻片 | MATSUNAMI | CRE-05 | |
| StemFit AK02N | Takara Bio Inc. | AK02N | 用于未分化iPSCs培养以及分化第0天至第6天的培养基 |
| 蔗糖 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 196-00015 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | 4583 | 冷冻保存介质 |
| TUBB3 抗体 | Promega | G712A | |
| Y27632 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 030-24021 | ROCK抑制剂 |
| ZEN | Carl Zeiss AG | 2.3SP1(黑色版) | 用于分析共聚焦显微镜 (LSM710) 所拍摄图像的软件 |
| ZEN | Carl Zeiss AG | 2.6 (蓝色版) | 用于分析共聚焦显微镜 (LSM980) 所拍摄图像的软件 |
参考文献
- Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
- Kirino, Y., Suzuki, T.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
