脑类器官是研究线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及中风样发作（MELAS）的宝贵模型，有助于揭示其潜在的病理生理机制，并为药物筛选提供平台。源自携带不同异质性水平致病基因细胞系的类器官表现出显著的表型差异。
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摘要
摘要
线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及类中风发作（MELAS）是一类最常见的由线粒体tRNALeu中m.3243A>G变异引起的线粒体疾病。为了研究MELAS的发病机制，我们利用来自一名携带m.3243A>G变异的MELAS患者的多个诱导性多能干细胞（iPSC）系，生成了脑类器官。这些细胞系具有相同的核遗传背景，但在涉及m.3243A>G变异的异质性水平上有所不同。我们观察到类器官在大小、形态以及神经诱导效率方面存在显著差异，且这些差异与异质性程度相关。将类器官中解离出的神经元转移至二维培养系统，该系统操作简便，适用于高通量药物筛选。此外，类器官在神经网络形成方面也表现出依赖于异质性水平的显著差异。我们的研究结果表明，来源于患者的基于iPSC的类器官模型是研究MELAS发病机制及开展药物筛选的有效平台。本视频展示了全面且易于操作的方法，包括类器官生成及表型评估的实验方案。
引言
线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）是一类以神经功能障碍、卒中样发作为特征，并伴有多种全身性症状的线粒体疾病。最常见的致病原因是线粒体亮氨酸tRNA基因MT-TL1中的m.3243A>G变异1。该变异被认为会损害反密码子上的牛磺酸修饰，从而降低亮氨酸的翻译效率，导致MELAS中的线粒体功能障碍2,3,4。值得注意的是，已有报道称高剂量牛磺酸治疗后症状有所改善5,6。然而，部分患者无治疗反应，提示在携带m.3243A>G变异的个体中，可能还存在其他尚未明确的病理生理机制参与疾病的发生发展。
为了阐明由遗传变异引起的疾病机制，理想的实验模型应确保除致病变异外所有变量均相同，从而实现准确的表型比较。对于核基因疾病，通常使用经过基因组编辑、变异已校正的细胞系和动物模型作为对照。然而，即使借助先进的基因组编辑技术，线粒体DNA（mtDNA）变异的修复在技术上仍然具有挑战性7因此，构建具有相同核背景的实验模型仍然具有挑战性。为解决这一问题，我们采用了来自同一MELAS患者、仅在线粒体DNA异质性水平（即携带特定突变的线粒体DNA所占比例）上存在差异的两个诱导性多能干细胞（iPSC）系 MT-TL1 m.3243A>G 型变异8），并生成脑类器官作为疾病模型。尽管异质性水平在细胞传代或分化过程中可能发生波动，从而可能影响表型并导致实验结果出现批次间差异，但携带线粒体基因变异的患者来源细胞在研究疾病发病机制方面仍具有重要价值。
在本研究中，我们利用来自MELAS患者诱导性多能干细胞（iPSCs）生成了脑类器官，并研究其病理生理特征，以更深入地理解该疾病的发病机制。通过使用具有高和低异质性水平的两个iPSC细胞系，我们观察到神经诱导效率存在显著差异，且该差异与异质性程度相关。我们的研究结果表明，来源于患者的iPSC脑类器官为揭示MELAS的潜在机制以及推动药物筛选提供了一个有价值的平台。
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方案
两个iPSC细胞系（2-6和2-8）来自同一位MELAS患者的成纤维细胞，采用已建立成熟的方法获得8。它们仅在异质性水平上存在差异。来源于健康个体的414C2 iPSC细胞系被用作对照。本研究采用的方案遵循北里大学医学院伦理委员会的指导方针（#G22-02）。
1. 细胞培养
- 解冻冻存的细胞
- 按照制造商说明，用层粘连蛋白包被6孔板。
- 将含10 µM ROCK抑制剂的无饲养层iPSC培养基预热至37 °C。
- 从液氮（LqN2）罐中取出冻存的iPSC冻存管，在37 °C水浴中快速解冻。
- 将解冻后的细胞悬液转移至10 mL预热的培养基中，在室温（22 °C）下以120 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液，轻轻敲击离心管使沉淀重悬。加入新鲜培养基，将细胞接种至预先用层粘连蛋白包被的6孔板中。在37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中孵育。
- 更换培养基
- 每1-2天更换一次培养基（不含ROCK抑制剂）。
2. 脑类器官的生成
- 诱导分化（第0天）
- 从iPSC（约70-80%汇合度）培养板中移除培养基，用PBS洗涤细胞。
- 加入酶溶液，在37 °C孵育5分钟。
- 加入培养基以终止反应，将细胞转移至15 mL离心管中，在室温（22 °C）下以190 × g离心5分钟。
- 用1 mL含有30 µM ROCK抑制剂、5 µM SB431542和2.5 µM IWP-2的分化培养基重悬细胞沉淀。
注意：基础培养基与步骤1.1.2中所用的相同。 - 计数细胞，将3 × 103 个细胞以每孔100 µL的体积接种于U型96孔低吸附板中。在37 °C、5% CO2条件下培养6天。
- 更换培养基（第6天）
- 使用宽口移液枪头将类器官（来自步骤2.1.5）从96孔板转移至10 cm培养皿中。向新的96孔板每孔加入50 µL培养基（DMEM/F12，含1% N2、1%谷氨酰胺替代物、1% NEAA、2.5 µM IWP-2、5 µg/mL肝素硫酸盐和1%青霉素-链霉素）。
注意：在整个实验过程中转移类器官时应使用宽口移液枪头，以避免破坏其三维结构。此外，使用8通道移液器有助于快速且准确地完成操作。 - 将类器官收集至2 mL离心管中，小心移除培养基以避免吸走类器官，加入1.5 mL DMEM/F12。重复洗涤3次。
- 移除培养基，向含有类器官的离心管中加入500 µL新鲜培养基。将所有类器官转移至10 cm培养皿中，再加入5 mL培养基，以便更易挑取单个类器官。
- 使用调至50 µL的微量移液器吸取单个类器官，并转移至96孔板的一个孔中。 重复操作直至所有类器官均转移至96孔板（终体积为100 µL）。在37 °C、5% CO2条件下继续培养3天。
- 使用宽口移液枪头将类器官（来自步骤2.1.5）从96孔板转移至10 cm培养皿中。向新的96孔板每孔加入50 µL培养基（DMEM/F12，含1% N2、1%谷氨酰胺替代物、1% NEAA、2.5 µM IWP-2、5 µg/mL肝素硫酸盐和1%青霉素-链霉素）。
- 更换培养基（第9天）
- （可选）当使用8通道移液器时，将类器官转移至10 cm培养皿中。若使用单通道微量移液器，则跳过步骤2.3.1，直接进行步骤2.3.2。
- 将类器官收集至2 mL离心管中，参照步骤2.2.2的方法用DMEM/F12洗涤3次。
- 用含有1% N2、2%不含维生素A的B27、100 µM 2-巯基乙醇（ME）、2.5 µg/mL胰岛素、1%谷氨酰胺替代物、0.5% NEAA和1%基底膜提取物的分化培养基（1:1 DMEM/F12与Neurobasal混合）重悬类器官。
注意：将基底膜提取物分装为小份单次使用量，保存于-20 °C直至使用。在4 °C条件下解冻提取物，确保温度不超过8 °C，然后将其混入冷培养基中，并在室温下预热约30 分钟。 - 将约10个类器官转移至6孔板的每孔中，调整每孔终体积为2 mL。在37 °C、5% CO2条件下静态培养6天。
- 更换培养基（第15天）
- 将类器官收集至15 mL离心管中，静置直至所有类器官沉降至管底。吸除上清液，加入新鲜分化培养基（成分同步骤2.3.3，但使用含维生素A的B27）。
注意：通常情况下，类器官无需离心即可自然沉降至管底。然而，源自患者iPSC的小型类器官可能沉降效率较低。此时，可在室温下以120 × g离心3分钟以收集类器官。 - 将约10个类器官转移至6孔板的每孔中，在37 °C、5% CO2条件下静态培养15天。
- 每5-7天更换一次培养基，直至第30天。
- 将类器官收集至15 mL离心管中，静置直至所有类器官沉降至管底。吸除上清液，加入新鲜分化培养基（成分同步骤2.3.3，但使用含维生素A的B27）。
3. 脑类器官的解离以进行二维培养（第30天）
- 使用多聚-L-鸟氨酸（PO）包被培养板
- 将10 mg PO溶解于66.7 mL H₂O中，配制PO储备液2O，并分装成小份供单次使用。将其储存在 -20 °C 保存，直至使用。
- 将PO储备液用H按1:5稀释2O，并用稀释后的溶液包被培养板，37 °C孵育过夜。
- 层粘连蛋白包被
- 移除PO，用PBS洗涤孔板，每次5分钟，共洗3次。
- 加入层粘连蛋白（1:1,000，溶于PBS），37 °C孵育3小时或过夜。
注意：层粘连蛋白储存液浓度为 1 mg/mL。分装成小份，于 -80 °C 保存，待用。
- 解离为单个神经元
- 使用前于 4 °C 解离液中解冻 1 小时。
- 转移 将类器官转入15 mL离心管中，静置直至所有类器官完全沉降。吸除上清液，加入5 mL PBS洗涤类器官。
- 之后 除去 PBS，加入 1 mL 酶溶液，轻轻吹打 1–2 次。37 °C 孵育 5 分钟，吹打数次。如有必要，再孵育 2–3 分钟。再次吹打以完成解离。
- 200 × g 离心 g 5 分钟后，弃去上清液，加入 1 mL 分散液，用移液器吹打混匀。
- 在下层加入分离液，然后以200 × g离心 g 5 分钟。
- 加入1 mL神经元培养基（Neurobasal加1% B27、0.25%谷氨酰胺替代物、1% PS），混匀。将悬液通过70 µm细胞筛网过滤至50 mL离心管中。
- 计数细胞。以每孔 1 × 105 细胞/厘米²2 在PO/层粘连蛋白包被的培养板上培养。每4-7天更换一次培养基，直至第60天。
4. 收集细胞和类器官用于细胞和分子分析
- 类器官免疫荧光固定（第30天）
- 将类器官（步骤2.4.3）收集至微量离心管中。
- 小心移除培养基，避免吸出类器官，并加入1 mL PBS洗涤类器官。
- 小心移除PBS，避免吸出类器官，加入4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定30分钟。
- 用PBS洗涤3次。
- 于4 °C保存，待用。
- 类器官RT-qPCR样本收集（第30天）
- 将类器官（步骤2.4.3）转移至微量离心管中。按照步骤4.1.2所述用PBS洗涤。
- 加入裂解缓冲液，并在液氮（LqN2）中速冻。于−80 °C保存，待用。
- 细胞免疫荧光固定（第60天）
- 移除培养基，加入PBS洗涤细胞。
- 在室温下用4% PFA固定15分钟。
- 移除PFA，加入PBS洗涤细胞，重复此步骤3次。
- 于4 °C保存，待用。
5. 逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）
- 根据试剂盒制造商的说明从类器官中提取总RNA。
- 以第5.1步制备的1 µg总RNA为模板，按照试剂盒说明书在20 µL的总反应体系中合成cDNA。
- 使用以下引物进行定量PCR：FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC；FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA；ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC；ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT。每项反应的终浓度设置如下：1x荧光预混液，0.25 µM正向引物，0.25 µM反向引物。总反应体积为15 µL，包含第5.2步所得cDNA 0.2 µL。PCR反应条件如下：95 °C预变性1分钟；随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性15秒，60 °C退火延伸30秒。
- 以ACTB作为内参对照，对FOXG1的表达水平进行归一化处理。
6. 免疫荧光染色
- 将类器官（第30天）在4 °C下用10%蔗糖溶液孵育1小时，然后在4 °C下用30%蔗糖溶液孵育不少于3小时。
- 将类器官包埋于包埋介质中，使用恒冷切片机制备10 µm冷冻切片。将切片置于载玻片上，于−20 °C保存备用。
- 用PBS洗涤（2次，每次5分钟）以去除包埋介质。
- 用0.3% PBST透化10分钟，随后用PBS洗涤。
- 用含10%正常山羊血清的0.1% PBST在室温下封闭1小时，然后在4 °C下与一抗抗体（anti-FOXG1，1:200；anti-TUBB3，1:500–1:1,000）孵育过夜。用PBS洗涤3次。
- 加入二抗（1:500）和Hoechst 33258（1:500），室温孵育1小时。用PBS洗涤3次。
- 封片后在共聚焦显微镜下观察。
7. 异质性分析
- 使用细胞刮刀收集iPSCs，并转移至微量离心管中。加入0.5 mL PBS，以100 × g 离心5分钟。弃去上清液，进行步骤7.2。
- 根据试剂盒制造商的说明提取总DNA。
- 设置每项PCR反应的终浓度：1×荧光预混液，0.25 µM 正向引物，0.25 µM 反向引物。总反应体积为15 µL，包含来自步骤7.2的50 ng总DNA。PCR反应条件如下：95 °C 预变性1分钟；随后进行40个循环，每个循环为95 °C 变性15秒，60 °C 退火30秒。引物序列如下：MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc；MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt；MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg；MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt；FBXO15_ foward: gccaggaggtcttcgctgta；FBXO15_ reverse: aatgcacggctagggtcaaa。
- 利用阈值循环值计算线粒体DNA拷贝数（突变型与野生型）。
- 以FBXO15核基因拷贝数进行标准化。
8. 类器官大小和形态的评估
- 使用显微镜以 TIFF 格式拍摄类器官图像。
- 使用开源图像分析软件测量大小和圆形度。通过点击 文件 | 打开 并选择文件，打开步骤 8.1 中保存的 TIFF 文件。选择 自由手选区 并勾勒类器官轮廓，然后点击 分析 | 测量。结果中的 面积 和 圆形度 数值将用于步骤 8.3 的分析。
- 使用统计软件进行 t 检验，分析数据以评估与对照组相比是否存在显著差异。
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结果
我们采用基于Nakamura等人9的稍作修改的相对简单方案，生成了脑类器官并进行了二维神经元培养（图1）。先前的方案使用V型96孔板，而本研究采用U型96孔低吸附板，以使细胞在每孔中央自然聚集。利用健康对照iPSC系414C2，我们在第30天成功诱导出含有FOXG1阳性神经元的脑类器官（图2A、D、E），并在第60天获得了二维培养的神经网络（图3A）。
已利用患者来源的iPSC细胞系研究MELAS的病理生理学机制8。通过常规DNA提取结合qPCR检测，证实m.3243A>G变异的异质性水平与既往报道的数值一致8。在这些细胞系中，2-8细胞系表现为低异质性（LH）水平，而2-6细胞系则表现为高异质性（HH）水平（
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讨论
由人胚胎干细胞（ESCs）/诱导多能干细胞（iPSCs）诱导生成的类器官是研究罕见难治性疾病颇具前景的疾病模型，然而脑类器官的制备通常需要长达数月的培养周期10，并依赖昂贵的设备，例如可连续搅拌培养基并为长期三维细胞培养维持稳定条件的工程化容器。在本研究中，我们利用常规细胞培养设备在较短时间内成功建立了脑类器官。通过使用携带线粒体DNA m.3243A>G变异的MELAS患者来源的iPSCs，我们成功鉴定了疾病特异性细胞表型。
我们采用 Nakamura 等人在 2019 年发表的实验方案，并进行了少量修改。在他们的原始研究中，第 0 天使用 V 型 96 孔低吸附培养板以促进 iPSCs 的聚集。然而，在本研究中，我们采用了 U 型 96 孔低吸附培养板，使细胞能够在孔的中心自然聚集。我们认为使用高质量的低吸附培养板对获得成功结果至关重要。此外，先前的研究9在分化过程中将类器官培养于摇床上。但在本方法中，我们省略了摇床的使用，因为类器官在振荡过程中容易发生聚集。在长期培养中，摇...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
414C2 诱导多能干细胞（iPSCs）由 RIKEN BRC 提供。本研究获得日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）（项目编号：24H00648 至 M.F.，23K08971 至 C.S.）以及日本医疗研究开发机构（AMED）转化研究网络计划（项目编号：25yf0126001j002 至 M.F.）的经费支持。F.B. 获得了德国学术交流中心（DAAD）奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 细胞培养皿 | corning | 353003 | |
| 6 孔超低吸附表面培养板 | corning | 3471 | |
| 70 μm 细胞筛 | corning | 352350 | |
| Accutase | nacalai tesque | 12679-54 | 用于解离iPSCs的酶 |
| B27 添加剂 | Thermofischer scientific | 17504001 | |
| 不含维生素A的B27 添加剂 | Thermofischer scientific | 12587010 | |
| β-巯基乙醇 (2-ME) | sigma | M3148 | 根据机构规定进行废弃处理。 |
| 细胞培养6孔多孔板 | corning | 353046 | |
| 细胞保存吸头 | BMBio ECO | BMT-200W | 宽口移液吸头 |
| 细胞刮刀 | SUMITOMO BAKELITECO., LTD. | MS-93100 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM710 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3050 | |
| 小鼠层粘连蛋白1培养基质 | R&D | 3400-010-02 | 用于包被解离神经元二维培养的培养板 |
| DMEM/F12 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 042-30795 | |
| 荧光封片介质 | DAKO | S302380-2 | 封片介质 |
| FOXG1 抗体 | abcam | ab196868 | |
| Glutamax | Thermofischer scientific | 35050061 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | Thermofischer scientific | A32723 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555 | Thermofischer scientific | A32732 | |
| 硫酸乙酰肝素 (HS) | sigma | H7640 | |
| 高容量RNA至cDNA试剂盒 | Thermofischer scientific | 4387406 | 用于从RNA合成cDNA |
| Hoechst 33258 | Thermofischer scientific | H3569 | |
| ImageJ | 版本 1.52a | 用于测量类器官的大小和圆形度 | |
| iMatrix-511 丝蛋白 | Takara Bio Inc. | 892021 | iPSC培养用培养板包被材料 |
| 胰岛素 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 090-06481 | |
| IWP2 | Tocris Bioscience | 3533 | |
| Keyence BZ-X810 | Keyence | BZ-X810 | 用于获取图3A图像 |
| LSM710 | Carl Zeiss AG | 共聚焦显微镜 | |
| LSM980 | Carl Zeiss AG | 共聚焦显微镜 | |
| LUNA 通用qPCR预混液 | New England Biolabs | M3003 | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| N2 添加剂 | Thermofischer scientific | 17502001 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermofischer scientific | 21103049 | |
| 神经元解离溶液 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 291-78001 | |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | nacalai tesque | 06344-56 | |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch Inc. | 005000121 | |
| Nunclon Sphera 96孔圆底微孔板（U型底，经Nunclon Sphera处理） | Thermofischer scientific | 174929 | |
| 多聚甲醛 (PFA) | nacalai tesque | 09154-85 | 根据机构规定进行废弃处理。 |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | |
| PBS | nacalai tesque | 27575-31 | |
| 青霉素/链霉素 (PS) | nacalai tesque | 26253-84 | |
| 聚-L-鸟氨酸 (PO) | sigma | P3655 | |
| 聚氧乙烯(10)辛基苯基醚 (Triton) | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 168-11805 | |
| PRISM | GraphPad | 版本 9.5.0 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | 用于提取总DNA |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | 用于提取总RNA |
| SB-431542 | Cayman Chemical | 13031 | |
| 载玻片 | MATSUNAMI | CRE-05 | |
| StemFit AK02N | Takara Bio Inc. | AK02N | 用于未分化iPSCs培养以及分化第0天至第6天的培养基 |
| 蔗糖 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 196-00015 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | 4583 | 冷冻保存介质 |
| TUBB3 抗体 | Promega | G712A | |
| Y27632 | FUJIFILM Wako Pure Chermical Co. | 030-24021 | ROCK抑制剂 |
| ZEN | Carl Zeiss AG | 2.3SP1(黑色版) | 用于分析共聚焦显微镜 (LSM710) 所拍摄图像的软件 |
| ZEN | Carl Zeiss AG | 2.6 (蓝色版) | 用于分析共聚焦显微镜 (LSM980) 所拍摄图像的软件 |
参考文献
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