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无菌性心包炎大鼠模型中房性电生理与钙处理异常的光学标测

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DOI：

10.3791/69767

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2026年1月27日

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1Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Research Center of Ion Channelopathy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Institute of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Key Lab for Biological Targeted Therapy of Education Ministry, 5Hubei Provincial Engineering Research Center of Immunological Diagnosis and Therapy for Cardiovascular Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 6Department of Cardiology, Xuzhou Central Hospital, 7Institute of Cardiovascular Diseases & Department of Cardiology, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了在大鼠无菌性心包炎心脏中进行电压和钙瞬变的双光学标测，以评估炎症诱导的房性重构，该重构是术后心房颤动的基础。

摘要

心脏手术后常出现术后心房颤动（POAF），其与心房炎症和重构密切相关。无菌性心包炎（SP）模型可在大鼠中复制这一病理状态，为研究炎症诱导的心房电生理变化提供了一个有价值的平台。本方案描述了在诱导SP后制备Langendorff灌注大鼠心脏，并采用同步双光学映射技术记录跨膜电压和钙瞬变的方法。心脏使用电压敏感染料RH237和钙指示剂Rhod-2 AM进行染色，同时用blebbistatin抑制心肌收缩，以最大限度减少运动伪影。高速成像技术可在受控起搏协议下实现心房动作电位和钙动力学的时空映射。定量参数包括动作电位时程、传导速度、钙瞬变时程、达峰时间以及交替波幅度。该方法可精确评估炎症应激条件下心房传导的异质性、电-钙耦联特性及心律失常易感性。这一可视化方法为研究POAF的发生机制以及测试靶向心房重构的药理学或遗传学干预手段提供了可重复且多功能的实验平台。

引言

术后心房颤动（POAF）是心脏胸外科手术后常见的并发症，其特征为短暂发作的心房颤动（AF），通常在术后2-4天达到高峰。尽管POAF常为自限性，但其与卒中风险增加、住院时间延长以及医疗费用上升相关1。心房心肌的炎症应激被认为是其发病机制中的关键因素2。

无菌性心包炎（SP）模型是一种成熟的用于研究术后房颤（POAF）的小动物模型3,4。在该模型中，心外膜涂抹滑石粉可诱导局部心包炎症，模拟术后病理改变。既往利用该模型的研究已证实存在结构重构、缝隙连接蛋白表达改变以及钙处理异常，这些因素均易导致心律失常的发生5,6,7。然而，传统的电生理学技术提供的时空分辨率有限，难以全面捕捉完整心房表面的传导异质性及电-钙耦合动态变化。

光学标测技术能够同时对心房表面的跨膜电压和钙瞬变（CaT）进行高分辨率成像，从而精确可视化心房传导、复极化过程及钙信号传导8。在本实验方案中，我们描述了对经Langendorff灌注的SP大鼠心脏进行双通道光学标测的方法。该方法可在受控起搏条件下量化传导速度、动作电位时程（APD）、CaT特性以及交替性变化。通过在炎症性心房组织模型中整合电生理活动与钙处理能力的评估，该技术为研究术后房颤（POAF）的机制基础以及验证靶向治疗干预提供了强有力的工具。

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方案

所有动物实验程序均经机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，批准编号为[2024]IACUC Number 4241，并依照机构及国家相关指南进行。研究过程中严格遵守动物福利指南，设定了明确的人道终点：若大鼠出现持续嗜睡、体重突然减轻超过20%、呼吸困难、无法正常进食或饮水，或出现严重术后并发症，将立即使用过量异氟烷（5%，氧气流速1 L/min）实施安乐死，以最大程度减轻其痛苦。

1. 溶液与试剂的配制

  1. 配制改良Tyrode's溶液（单位：mM）：128.2 NaCl、4.7 KCl、1.3 CaCl2、1.05 MgCl2、1.19 NaH2PO4、20 NaHCO3、11.1 葡萄糖。用95% O2/5% CO2气体饱和，调节pH至7.38–7.42，并将溶液预热至37 ± 1 °C。
  2. 布比司他汀（Blebbistatin）：溶于DMSO（5 mg/mL），-20°C避光保存。使用时终浓度为10 µM。
  3. RH237（电压敏感性染料）：溶于DMSO（2 mg/mL），−20 °C避光保存。使用时终浓度为2 µM。
  4. 罗丹明-2 AM（Rhod-2 AM，钙离子指示剂）：溶于DMSO（1 mg/mL），−20 °C避光保存。使用时终浓度为0.89 µM。
  5. Pluronic F-127（表面活性剂）：配制成20%的DMSO溶液（可使用市售试剂）。
  6. 戊巴比妥钠（1%）：将0.1 g溶于10 mL生理盐水中，用于麻醉（40 mg/kg，腹腔注射）。
    注意：操作染料和DMSO储备液时应穿戴适当的个人防护装备；所有操作需避光处理布比司他汀和染料。严格遵守生物安全和化学安全规范。

2. 仪器设备

  1. 具有温度控制（37 ± 1 °C）、储液器、气泡柱和蠕动泵（流速 10-12 mL/min）的兰格多夫系统。
  2. 成像：高速CMOS相机（帧率 ≥ 1 kHz；心房视野 ≥ 80 × 80 像素）、LED激发光源（530 ± 25 nm）、二向色镜（~630 nm）、发射滤光片（Rhod-2 ~590 nm；RH237 >700 nm）、带可调光圈的镜头、配备减振装置的光学平台。激发光源：最大电流为5 A的LED激光器，最大功率为2.2 W的绿光。
  3. 刺激：恒压刺激器，双极起搏电极。
  4. 生理监测：浸入式ECG电极；热敏探针；黑色背景基底（橡胶材质），用于减少心室光污染；精细外科器械；大鼠用呼吸机。材料表中提供详细清单。

3. 大鼠无菌性心包炎（SP）的诱导

  1. 用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠（200–220 g），通过足底反射消失确认麻醉深度。
  2. 在直视下使用聚乙烯或金属导管对大鼠进行气管插管，小心将导管推进至气管，位置应位于隆突上方，并妥善固定以防止移位。连接呼吸机，设置潮气量为2 mL/100 g，呼吸频率为55次/分钟，吸呼比（I:E）为1:1。通过观察胸廓对称扩张及呼吸稳定来确认通气有效。
    注意：避免插管过深或过浅，以防支气管插管或意外脱管。
  3. 准备手术区域。于胸骨旁行小切口开胸术（靠近胸骨的第2肋间），轻柔暴露心脏。
  4. 抬起胸腺以显露左右心房。用精细镊子小心打开覆盖在心房表面的心包膜。
  5. 使用精细刮勺将无菌滑石粉均匀涂抹于左右心房表面（滑石粉剂量：50 mg/100 g大鼠体重）。避免滑石粉洒落到大血管或心室。将胸腺复位覆盖心房，以限制滑石粉迁移。
  6. 复位胸壁肌肉以覆盖肋间手术切口。使用0.5%聚维酮碘消毒后，缝合肌肉和皮肤以关闭胸腔，并于术后给予青霉素（160,000 U/100 g，腹腔注射）。
  7. 假手术组：仅行开胸术，不进行心包切开或滑石粉处理。
    注意：仅在心房心外膜表面涂抹一层薄而均匀的滑石粉；过量使用滑石粉或污染心室会增加死亡率，并可能干扰心房特异性指标的检测。既往研究已证实，大鼠无菌性心包炎手术可导致严重的心房心肌炎，表现为显著的纤维化以及IL-6、IL-1β和TGF-β1等炎症因子水平升高3,9。

4. 心脏分离与兰格多夫灌注

  1. 术后第3天，使用异氟烷（2-3%）对大鼠进行麻醉 通过 鼻锥，并给予全身性肝素（250 U/kg，腹腔注射），以防止血管内血栓形成，避免冠状动脉循环受阻而影响Langendorff灌注。该时间点的选择基于我们先前的研究结果。 体内 研究发现，房颤的可诱导性在SP后3-4天达到峰值3，从而在避免后期粘连干扰染料加载和光学记录的同时，捕获急性炎症驱动的心律失常阶段。
    注意：实验开始前，需新鲜配制溶液；平衡气体和温度。校准光学系统，并确认滤光片和二向色镜的正确安装。配置采集软件（1-2 kHz，曝光时间1 ms），并使用荧光校准卡进行系统校准。
  2. 快速行胸骨正中切开术以暴露胸腔，切除心脏 整块 保留部分主动脉弓，并立即将其浸入冰浴、充氧的台氏液中，以终止代谢并维持组织活性。在保留0.5 mm主动脉长度用于插管的前提下，仔细剥离周围结缔组织。使用4-0丝线将主动脉牢固固定于Langendorff插管上，确保密封不漏气，且导管下缘与心房上界对齐。以10–12 mL/min的恒定流速开始逆行灌注充氧台氏液，灌注液温度维持在37 ± 1 °C。为保证实验可重复性，大鼠主动脉插管规格如下：外径1.4 mm，内径1.0 mm，总长3–4 cm，插入主动脉根部深度约0.5–1.0 cm，尖端呈轻微锥形，材质为不锈钢或钝端金属导管。插管须具备足够刚性，以承受通常60–80 mmHg的灌注压力而不发生弯曲，且其尖端应避免阻塞冠状动脉开口。
  3. 观察心脏的即刻再灌注效果。成功灌注的标志包括冠状血管系统中残留血液迅速而有力地被冲洗干净、心肌颜色恢复均匀粉红，以及自主节律性收缩的恢复。在进行后续实验前，应确保心肌水肿轻微且心率稳定（通常为300–400次/分钟）。同时记录心脏的心电图。在启动光学标测方案前，需在持续灌注条件下使心脏至少平衡稳定20分钟。

5. 运动抑制与排气

  1. 向灌注液中加入blebbistatin（终浓度10 µM），灌注约10分钟，直至收缩停止。
  2. 将减压导管插入左心室 通过 通过二尖瓣将导管插入肺静脉，以减压心室，从而降低心腔内压力，同时保持心房形态和信号完整性。为确保可重复性，导管规格如下：外径：1.4 mm；内径：1.0 mm；总长度：1.5 cm；插入心脏深度：1.0 cm。切勿打开心房，以保持心房几何结构和信号。

6. 染料负载

  1. 心脏灌注：心脏停搏后，在室温下以 10–12 mL/min 的恒定流速进行心脏灌注。
  2. 钙离子指示剂染色：向 100 mL 灌注液中加入 Rhod-2 AM（终浓度 0.89 µM）和 20 µL 20% Pluronic F-127。用此溶液灌注心脏约 30 分钟，直至心房和心室呈现均匀的红色荧光。
  3. 电压敏感性染料染色：向 100 mL 灌注液中加入 RH237（终浓度 2 µM）。灌注心脏约 5 分钟，直至心房和心室呈现粉红色。
  4. 复温与洗脱：将心脏重新转移至原始灌注系统，复温至生理温度，并灌注 5–10 分钟以洗去未吸收的染料。
    注意：微弱的 CaT 信号通常反映 Rhod-2 负载不足；可延长负载时间 10–15 分钟，并确认 Pluronic 新鲜有效。若仍存在运动干扰，请确认 blebbistatin 的效价及其避光保存情况。

7. 成像几何结构与信号分离

  1. 将心脏置于37 °C的成像浴槽中。使左心房（LA）朝向相机。将主光源和次光源对准左心房（LA）。
  2. 固定心脏以防止漂移；轻轻展开心房，并用针灸针固定，以获得最佳视野。用黑色橡胶片覆盖心室，以减少心室产生的杂散光干扰。
  3. 将双极起搏电极置于右心房（RA）。将心电图（ECG）电极放置在心房附近，以有效捕获较大的P波。

8. 采集与起搏方案

  1. 启动映射软件（OMapRecord4.0 软件）。将帧率设置为 1–2 kHz；调节 LED 电流至 3–4 A；视野应覆盖整个左心房（LA）。调节增益/曝光以避免任一通道信号饱和。优化相机增益和曝光，在避免饱和的同时最大化信噪比。成像参数：曝光时间 1 ms；相机最高频率 30 kHz；采样率 12.5 kHz；分辨率 2048 × 2048 像素；感兴趣区域（ROI）帧率最高可达 3.5 kHz；空间分辨率为 70 µm。这些设置可确保动作电位（AP）和钙瞬变（CaT）记录的高保真度。
  2. S1S1 起搏（基线）：以 7 Hz 对右心房（RA）进行起搏（脉冲宽度 2–4 ms；两倍舒张期阈值）。采集不少于 5 秒的视频，用于分析动作电位时程（APD）/钙瞬变时程（CaD）、达峰时间及传导速度。
  3. S1S2 协议（不应期/房颤）：以 7 Hz 发放 30 次 S1 刺激，随后给予一次 S2 刺激；逐步缩短 S1-S2 间期（从 140 ms 开始，步长为 10/5/1 ms），直至进入不应期。记录钙瞬变恢复曲线（A2/A1）、有效不应期（ERP）以及房颤（AF）的可诱导性与持续时间。
  4. 递增频率起搏（交替现象）：将右心房（RA）起搏频率从 8 Hz 逐步增加至 18 Hz，步长为 1–2 Hz。在每个频率下至少记录 5 秒，以量化钙交替（Ca-ALT）、动作电位时程交替（APD-ALT）和去极化交替（DIS-ALT）。保存同步的双通道视频以及同步的心电图（ECG）/刺激信号轨迹用于后续分析。
    注意：在整个起搏过程中需维持恒定的温度和灌注；低温会降低传导速度并加剧交替现象的人工假象。

9. 数据处理与定量分析

  1. 使用 OMapScope 4.0 软件分析光学信号。应用 3×3 高斯空间滤波器，通过将每个像素与其邻近像素取平均值来降低噪声，同时保留信号形态。激活时间定义为动作电位上升支中 dF/dt 最大值的时刻，传导速度则通过将最早与最晚激活位点之间的直线距离除以相应的激活时间差来计算。APD70/90 定义为从动作电位 dF/dT 最大值至复极化达到动作电位幅度 70% 或 90% 所经历的时间。CaD70/90 定义为从钙瞬变（Ca²⁺）峰值至其幅度衰减至 70% 或 90% 所经历的时间。交替现象的量化方法如下：Ca-ALT 计算为 1 减去较小与较大平均 CaT 幅度的比值，APD-ALT 为较长与较短 APD80 值之间的差值，DIS-ALT 为由节点线分隔的空间相位相反的交替现象。RyR 恢复比值计算为两个连续 CaT 峰值（较小/较大）的比值。

10. 关键参数与可接受标准

  1. 灌流：10–12 mL/min，37 ± 1 °C；稳定的窦性或起搏节律；左心房灌流良好。
  2. 信噪比：两个通道的 dF/F 上升支 ≥ 3；采集时间窗内光漂白可忽略。
  3. 运动：使用blebbistatin后残余运动可忽略；各帧间图像配准稳定。
  4. 温度：持续监测；排除采集期间浴液温度 < 36 °C 或 > 38 °C 的数据集。

11. 统计分析

  1. 所有统计分析均使用 GraphPad Prism 9 进行。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。数据分布的正态性通过 Shapiro-Wilk 检验进行评估。对于符合正态分布的数据，两组之间的差异采用非配对双尾 Student t 检验进行分析；对于非正态分布的数据，则采用 Mann-Whitney U 检验。分类变量采用 χ2 检验进行分析。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

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结果

心房颤动的可诱导性
异位活动和折返是导致术后心房颤动（POAF）发生和持续的关键机制2。折返波长（λ）由有效不应期（ERP）与传导速度（CV）的乘积决定，即 λ = ERP × CV。在假手术组心脏中，S1S2 刺激诱导出稳定的心房反应，未出现心律失常（图 2A）。相比之下，SP 处理组心脏常表现出异常反应，包括心房早搏（图 2B）以及发展为心房颤动的折返（图 2C）。定量分析显示，随着 S2 间期逐渐缩短，SP 组心脏中心房早搏或心房颤动的发生率显著高于假手术对照组（图 2D）。两组间心房有效不应期（ERP）无显著差异（图 2E）。

动作电位重塑
以7 H...

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讨论

本方案描述了在经滑石粉（SP）处理的离体大鼠心脏中进行动作电位（APs）和钙瞬变（CaTs）的双光学标测，SP是一种由炎症驱动的阵发性心房颤动（POAF）模型。在可编程起搏条件下，对完整心房表面进行膜电位（Vm）和Ca2+信号的同步高分辨率记录，可评估动作电位时程（APD）、达峰时间、传导速度、复极化空间异质性、钙瞬变时程（CaD）、钙瞬变幅度、钙瞬变达峰时间以及区域钙处理变异。该方法还可检测并量化频率依赖性交替现象，包括APD交替（APD-ALT）、钙交替（Ca-ALT）和不同步交替（DIS-ALT），并可用于分析兰尼碱受体（RyR）的恢复性与不应性。此外，该技术能够识别致心律失常的触发因素（如异位活动和折返），包括由SP模型诱导的功能性旋波折返，并揭示其与显著交替现象区域的共定位关系，从而深入阐明炎症引起的心房电重构及心律失常发生机制。值得注意的是，心包暴露于滑石粉与早期电生理改变相关，提示存在炎症驱动的电重构。然而，心房颤动是一种涉及电生理、结构和功能多因素的复杂疾病。因此，我们不排除随着时间推移，可能进一步出现其他纤维化或功能性异常。

多个关键步骤可确...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82470328、82170326，Y.D.；项目编号：82300350，J.L.）的资助。我们衷心感谢中国河南省医学科学院电生理研究所郝国梁博士和王功新博士在光学标测方面提供的杰出协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
布雷比汀Abcamab120425
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
CMOS 相机MappingLabOMS-PCIE-2002
心电图系统成都泰盟BL-420F
FE32 测量仪Mettler Toledo30254108
滤光片/二向色镜MappingLabRH237 >700 nm;
CaT 590 nm
葡萄糖Sigma-Aldrich921-60-8
成像浴槽MappingLabN/A
KClSigma-Aldrich7447-40-7
朗根多夫灌流系统Radnoti / 定制N/A
LED 光源 (530 ± 25 nm)MappingLabN/A
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
NaH2PO4Sigma-Aldrich10049-21-5
NaHCO3Sigma-Aldrich144-55-8
OMapRecord4.0 软件MappingLabN/A
OMapScope4.0 软件MappingLabN/A
蠕动泵Cole-ParmerMasterflex® L/S®
泊洛沙姆 F-127InvitrogenP3000MP
RH237（电压染料）Thermo Fisher / InvitrogenS1109
罗丹明-2 AM（钙离子指示剂）Thermo Fisher / InvitrogenR1245MP
小型动物呼吸机YUYANBIOV-100
戊巴比妥钠Sigma-AldrichP3761
斯普拉格-道利大鼠（200–220 g，雄性）本地认证供应商N/A
无菌滑石粉Sigma-AldrichT1586
刺激器MappingLabLEDC-2002
恒温水浴槽宁波新芝SC-15

参考文献

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