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制备适用于多物种抗体的经济型通用补偿微珠

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DOI：

10.3791/70114

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2026年4月17日

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1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了一种经济高效的方法，利用重组蛋白A/G/L偶联的聚苯乙烯微球制备适用于多种物种的流式细胞术荧光补偿微珠。

摘要

本方案描述了一种经济高效且可重复的多物种兼容性补偿微球制备方法，用于多色流式细胞术中的荧光补偿。本研究中，将含有多个免疫球蛋白结合结构域的重组免疫球蛋白结合蛋白A/G/L（Protein A/G/L）在大肠杆菌（E. coli）中表达，通过镍亲和层析纯化，并利用EDC/NHS化学法共价偶联至羧基化聚苯乙烯微球上。所制备的微球可结合多种物种及亚类的抗体，产生强而特异的荧光信号，适用于补偿设置。实验结果为选择微球直径和蛋白载量以获得适合不同补偿需求的荧光强度提供了实用指导。在流式细胞术分析中，与对照微球相比，偶联微球出现高效蛋白纯化及清晰、高强度的荧光峰，表明本方案成功实施。该方法简便且可扩展，可在常规实验室中常规制备稳定、多功能的补偿微球，在降低费用的同时提升了流式细胞术应用的灵活性。

引言

流式细胞术已成为免疫学、细胞生物学和临床研究中用于细胞群体多参数分析不可或缺的工具1,2,3。传统多色流式细胞术的一个关键挑战是荧光溢出，即一种荧光染料的发射光谱会重叠进入多个检测通道，导致信号污染和错误解读4,5。因此，正确的补偿对于准确的数据解析至关重要。

传统上，补偿对照使用单一荧光染色的细胞制备。然而，细胞数量有限、抗原表达水平差异以及抗体与细胞结合能力的不同带来了挑战6。因此，可结合荧光素偶联抗体的合成微球已成为一种实用的替代方案7,8。微球具有结合能力稳定、荧光强度高以及不受细胞抗原表达水平影响等优势9。与单一物种或仅限Fc段结合的捕获试剂相比，引入多种免疫球蛋白结合结构域（Protein A、G 和 L）可扩大对不同物种和抗体形式的兼容性，使同一批微球可用于多种荧光素偶联抗体。

在用于补偿的微珠中，连接蛋白A、蛋白G和蛋白L等免疫球蛋白结合蛋白可与来自不同物种的抗体同种型广泛兼容。蛋白A和蛋白G可结合多种IgG亚类的Fc区，而蛋白L则结合免疫球蛋白的κ轻链，从而扩展了对Fab片段和单链抗体的结合能力10,11。

尽管市面上已有商用补偿微珠，但其相对较高的成本可能使预算有限的实验室难以承受，从而限制了其广泛应用3。鉴于这些挑战，亟需一种灵活且可定制的微珠平台，使研究人员能够自主定义微珠尺寸、抗体结合结构域以及用于补偿对照的抗体类型。本实验方案旨在提供一种简单、经济且可重复的方法，用于制备适用于多种物种的多色流式细胞术补偿微珠。该方案详细描述了一种重组融合蛋白的设计、表达与纯化过程，该融合蛋白包含来自蛋白A、蛋白G和蛋白L的多个免疫球蛋白结合结构域，随后将其共价偶联至特定直径的羧基修饰聚苯乙烯微珠上。

本方案概述了融合蛋白的分子设计、其在大肠杆菌（E. coli）中的表达与纯化，以及适用于多种荧光染料偶联抗体的基于微球的补偿试剂的制备。该方案适用于在免疫学、肿瘤学和转化医学研究等多种科研环境中开展多色流式细胞术的实验室，尤其适用于需要降低成本、实现跨物种兼容性以及灵活设置补偿对照的情况。

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方案

注意：所有缓冲液和试剂均需按照表1所列内容新鲜配制。EDC和NHS溶液需在使用前立即配制，不可储存。其余缓冲液（裂解、结合、洗涤、洗脱、MES、PBS、Tris）可预先配制储备液，并于4 °C保存。使用前将储存的缓冲液平衡至相应的反应温度（室温或4 °C）。FACS缓冲液和储存缓冲液需新鲜配制或于4 °C保存。

1. 重组蛋白A/G/L的表达与纯化

  1. 重组蛋白 A/G/L 的表达
    1. 使用标准的热激法将 pET28-Protein A/G/L 质粒转化至 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中。
    2. 将转化后的细胞涂布于含有 50 µg·mL-1 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
    3. 挑取单菌落接种于 5–10 mL 含卡那霉素（50 µg·mL-1）的 LB 液体培养基中，37 °C、200 ×g 振荡培养过夜。
    4. 按 1:100 的比例将过夜培养物转接至 200 mL 含卡那霉素（终浓度 50 µg·mL-1）的 LB 培养基中。
    5. 37 °C 培养至 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.6–0.8。
    6. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 0.5 mM 以诱导蛋白表达，28 °C 继续孵育 12–16 小时。
    7. 在 4 °C 条件下以 4000 ×g 离心 10 分钟收集菌体。
    8. 弃去上清液，用裂解缓冲液重悬菌体沉淀。立即进行后续操作，或将菌体沉淀于 -80 °C 保存。
      暂停点：菌体沉淀可在裂解前于 -80 °C 保存数周。
  2. 细胞裂解
    1. 每克湿菌体质量用 10 mL 裂解缓冲液重悬细菌沉淀。
    2. 使用设定为 1000 bar 的高压均质机裂解细胞，将悬浮液通过 2–3 个循环，直至溶液变得不那么黏稠且呈半透明状态。
      注：也可在冰上采用超声破碎法（脉冲模式：开启 5 秒 / 关闭 10 秒）进行细胞破碎，共 8–12 个循环，注意避免过热。通过显微镜检查少量样品以确认裂解是否完全。
    3. 在 4 °C 条件下以 12000 ×g 离心 30 分钟。
    4. 收集上清液作为可溶性蛋白组分用于纯化。
  3. Ni-NTA 亲和层析纯化
    1. 柱子平衡与样品上样
      1. 用含 10 mM 咪唑的结合缓冲液平衡 Ni-NTA 柱，体积为 10 个柱体积（CV）。
      2. 将澄清后的裂解液经 0.45 µm 滤膜过滤，加入咪唑至终浓度 10 mM，并以 0.5 CV·min-1 的流速上样至柱中。
      3. 收集穿流液以监测结合效率。
    2. 洗涤
      1. 用含 20 mM 咪唑的结合缓冲液和洗涤缓冲液以 1 CV·min-1 的流速洗涤柱子，总体积为 10 CV。
    3. 洗脱
      1. 以 1 CV·min-1 的流速用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。
      2. 收集各洗脱组分，并监测 A280 以确定含蛋白的组分。
    4. 缓冲液置换与蛋白储存
      1. 将纯化的蛋白溶液转移至截留分子量为 50 kDa 的离心超滤管中。
      2. 在 4 °C 条件下以 3,500 × g 离心 15–20 分钟，直至达到所需浓度。
      3. 弃去滤过液，在截留物中加入等体积的 PBS 缓冲液（pH 7.4）进行缓冲液置换。
      4. 重复离心和 PBS 更换 2–3 次，以完全将原始缓冲液替换为 PBS。
      5. 在最终浓缩步骤后，收集截留物并测定蛋白浓度。
      6. 通过 SDS-PAGE 验证洗脱组分；Protein A/G/L 的预期分子量约为 90 kDa。
      7. 将纯化的蛋白分装后于 -80 °C 保存，以备后续使用。
        注：本步骤可作为暂停点。纯化的 Protein A/G/L 可于 -80 °C 保存，用于后续磁珠偶联。浓缩后，从 200 mL 细菌培养物中大约可获得 10 mg 纯化的 Protein A/G/L，终浓度为 2–5 mg·mL⁻1。

2. 将珠子与蛋白A/G/L偶联

  1. 磁珠预清洗
    1. 在室温（20–25 °C）下将磁珠储备液涡旋振荡 20–30 秒，使其充分重悬。取 0.2 mL 8 µM 磁珠（5 mg）转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 在室温下以 5000 × g 离心 3 分钟，使磁珠沉淀。
    3. 小心吸除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。
    4. 加入 1 mL 0.1 M MES 缓冲液，通过移液或轻柔涡旋重悬磁珠，再于室温下以 5000 × g 离心 3 分钟，去除上清液。重复此清洗步骤一次（共进行两次 MES 清洗）。
  2. EDC/NHS 活化
    ​注意：EDC 和 NHS 具有刺激性，应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备操作。
    1. 将磁珠重悬于 0.5 mL MES 缓冲液中，随后依次加入 50 µL 50 mg·mL-1 NHS 溶液和 100 µL 50 mg·mL-1 EDC 溶液。
      注：EDC 和 NHS 溶液必须在使用前新鲜配制。
    2. 涡旋混匀磁珠，并在室温下置于旋转摇床上孵育 30 分钟以完成活化。
  3. 去除活化试剂并清洗
    1. 在室温下以 5000 × g 离心 3 分钟使磁珠沉淀，小心去除上清液。
    2. 加入 1 mL PBS 缓冲液，轻柔重悬，再于室温下以 5000 × g 离心 3 分钟，去除上清液。进行一次 PBS 清洗以去除残留的活化试剂。
  4. 蛋白偶联
    1. 将活化后的磁珠沉淀重悬于 0.4–0.5 mL PBS 中（最终反应体积目标为 0.5–0.6 mL）。保持较低体积以提高有效蛋白浓度。
    2. 加入 100 µg Protein A/G/L，轻柔混匀。
    3. 将反应体系置于滚轴混合器上，在室温下孵育 2 小时以实现快速偶联，或在 4 °C 下过夜孵育。持续轻柔滚动以防止磁珠沉降。
  5. 终止反应（淬灭）
    1. 以 5000 × g 离心 3 分钟使磁珠沉淀，去除上清液。
    2. 加入 1 mL 0.1 M Tris 缓冲液（pH = 7.4）以淬灭未反应的 NHS 酯。重悬后在室温下置于滚轴混合器上孵育 30 分钟。
    3. 再次离心（5000 × g，3 分钟）并弃去上清液，然后用 1 mL PBS 在同一 1.5 mL 微量离心管中清洗一次。离心后弃去上清液，最后用 0.5 mL 储存缓冲液重悬磁珠。
      暂停点：本步骤可作为暂停点。重悬后的磁珠可在 4 °C 下保存。
  6. 混合与储存
    1. 分别计数已偶联和未偶联的磁珠。在新的 1.5 mL 微量离心管中按 25%–75% 的比例混合偶联磁珠与未偶联磁珠。
    2. 将磁珠混合物悬浮于 1 mL 储存缓冲液（含 1% BSA 和 0.05% 抗微生物防腐剂的 PBS）中。
    3. 将悬浮液转移至标记好的管中，于 4 °C 保存。无需避光。使用前轻柔重悬以确保磁珠分布均匀。在此条件下，磁珠至少可稳定保存 6 个月。

3. 代表性质量控制

  1. 将10 µL偶联微球与1 µL荧光抗体在100 µL FACS缓冲液中于室温孵育15–30分钟。
    注意：每管仅加入一种荧光抗体。
  2. 用1 mL PBS洗涤微球，重悬于300–500 µL PBS中，并上流式细胞仪检测。
  3. 根据抗体偶联的荧光染料设置检测通道（例如，FITC标记的抗体使用488 nM激光配合FITC检测器）。光电子倍增管（PMT）电压可初始设定在0–200 V范围内，并根据仪器性能进行调整。每样本至少采集10,000个事件。
  4. 通过FSC/SSC对微球设门。阳性微球应在对应荧光染料通道中显示出明显且单一的高MFI峰；阴性对照应仅显示背景信号。

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结果

重组融合蛋白 A/G/L 由 816 个氨基酸组成，理论分子量为 90.5 kDa（补充文件 1）。该融合蛋白保留了蛋白 A 的五个 IgG 结合 B 结构域、蛋白 G 的两个 IgG 结合结构域以及蛋白 L 的五个 κ 轻链结合 B 结构域，同时去除了白蛋白结合结构域（图 1A，补充表 1）。在 C 末端添加了一个半胱氨酸残基，以促进共价连接，并引入了 6×His 标签，以便利用 Ni–NTA 亲和层析实现高效纯化（图 1A）。

SDS-PAGE 分析显示，在约 90 kDa 处出现一条明显的条带，与 Protein A/G/L 的预期大小相符，表明大部分表达的蛋白为可溶性蛋白。经过 Ni-NTA 亲和纯化后，目标条带从穿流组分中消失，证实了带 His 标签的蛋白与镍树脂具有强结合能力（图 1B）。少量 Protein A/G/L 在 ...

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讨论

本方案描述了一种基于重组蛋白A/G/L制备荧光补偿微球的实用且高效的实验流程。该流程包括细菌表达、Ni-NTA亲和层析纯化，以及利用EDC/NHS化学方法将纯化的蛋白共价偶联至羧基修饰的聚苯乙烯微球。所获得的微球可结合多种物种及亚类的抗体，为流式细胞术中的荧光补偿提供了一种多功能且经济有效的工具。

使用市售的羧基修饰微球可显著简化该操作流程。在典型的生物实验室中，合成均匀且单分散的羧基化微球在技术上具有较高难度，且常常导致颗粒尺寸和表面电荷的不一致。相比之下，市售微球价格低廉、质量高且可重复性好——例如，250 mg 羧基修饰微球的购买价格约为 21 美元，可为偶联反应提供稳定可靠的基质材料。

市售抗体捕获微珠的成本通常约为每测试2–5美元，具体价格取决于供应商。相比之下，根据本方案，250 mg 羧基修饰的聚苯乙烯微球可支持数千次补偿反应。即使计入重组 Protein A/G/L 表达与纯化的相关成本，每次测试的预估成本仍然非常低。因此，这种实验室自制策略可能是一种经济高效的替代方案，尤其适用于开展高通量或常规多色流式细胞术...

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披露

所有作者声明不存在利益冲突，且无任何需要披露的内容。

致谢

本工作得到天津市教育委员会科学研究计划项目（2021KJ224）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AF647 大鼠 Ig2aBioLegend141711
APC 小鼠 IgG1BioLegend353311
BL21(DE3) 感受态细胞SangonB528414
BSASolarbioA8010
EDCThermo Fisher22980CAS: 1892-57-5
异硫氰酸荧光素（FITC）叙利亚仓鼠 IgGBioLegend400905
咪唑Sigma-AldrichI202CAS: 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS: 367-93-1
Kanamycin SangonA600286CAS: 8063-07-8
KClAladdinP112134CAS: 7447-40-7
KH2PO4AladdinP434010CAS: 7778-77-0
MESSigma-AldrichM3671CAS: 145224-94-8
Na2HPO4AladdinS274390CAS: 7558-79-4 
NaClAladdinC111549CAS: 7647-14-5
NHSThermo Fisher24500CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FFSmart-LifesciencesSA005005
PE 小鼠 IgG2aBioLegend362603
ProClean 300BeyotimeST853
Tris Sigma-Aldrich252859CAS: 77-86-1 
胰蛋白胨OxoidLP0042
超滤离心管，50 kDa 截留分子量MilliporeUFC9050
均一羧基聚苯乙烯微球Tomicro Biotech10ml, 25mg/ml中国上海
酵母提取物OxoidLP0021

参考文献

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