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制备适用于多物种抗体的经济型通用补偿微珠

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DOI：

10.3791/70114

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2026年4月17日

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1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了一种经济高效的方法，利用重组蛋白A/G/L偶联的聚苯乙烯微球制备适用于多种物种的流式细胞术荧光补偿微珠。

摘要

本方案描述了一种经济高效且可重复的多物种兼容性补偿微球制备方法，用于多色流式细胞术中的荧光补偿。本研究中，将含有多个免疫球蛋白结合结构域的重组免疫球蛋白结合蛋白A/G/L（Protein A/G/L）在大肠杆菌（E. coli）中表达，通过镍亲和层析纯化，并利用EDC/NHS化学法共价偶联至羧基化聚苯乙烯微球上。所制备的微球可结合多种物种及亚类的抗体，产生强而特异的荧光信号，适用于补偿设置。实验结果为选择微球直径和蛋白载量以获得适合不同补偿需求的荧光强度提供了实用指导。在流式细胞术分析中，与对照微球相比，偶联微球出现高效蛋白纯化及清晰、高强度的荧光峰，表明本方案成功实施。该方法简便且可扩展，可在常规实验室中常规制备稳定、多功能的补偿微球，在降低费用的同时提升了流式细胞术应用的灵活性。

引言

流式细胞术已成为免疫学、细胞生物学和临床研究中用于细胞群体多参数分析不可或缺的工具1,2,3。传统多色流式细胞术的一个关键挑战是荧光溢出，即一种荧光染料的发射光谱会重叠进入多个检测通道，导致信号污染和错误解读4,5。因此，正确的补偿对于准确的数据解析至关重要。

传统上，补偿对照使用单一荧光染色的细胞制备。然而，细胞数量有限、抗原表达水平差异以及抗体与细胞结合能力的不同带来了挑战6。因此，可结合荧光素偶联抗体的合成微球已成为一种实用的替代方案7,8。微球具有结合能力稳定、荧光强度高以及不受细胞抗原表达水平影响等优势9。与单一物种或仅限Fc段结合的捕获试剂相比，引入多种免疫球蛋白结合结构域（Protein A、G 和 L）可扩大对不同物种和抗体形式的兼容性，使同一批微球可用于多种荧光素偶联抗体。

在用于补偿的微珠中....

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方案

注意：所有缓冲液和试剂均需按照表1所列内容新鲜配制。EDC和NHS溶液需在使用前立即配制，不可储存。其余缓冲液（裂解、结合、洗涤、洗脱、MES、PBS、Tris）可预先配制储备液，并于4 °C保存。使用前将储存的缓冲液平衡至相应的反应温度（室温或4 °C）。FACS缓冲液和储存缓冲液需新鲜配制或于4 °C保存。

1. 重组蛋白A/G/L的表达与纯化

  1. 重组蛋白 A/G/L 的表达
    1. 使用标准的热激法将 pET28-Protein A/G/L 质粒转化至 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中。
    2. 将转化后的细胞涂布于含有 50 µg·mL-1 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
    3. 挑取单菌落接种于 5–10 mL 含卡那霉素（50 µg·mL-1）的 LB 液体培养基中，37 °C、200 ×g 振荡培养过夜。
    4. 按 1:100 的比例将过夜培养物转接至 200 mL 含卡那霉素（终浓度 50 µg·mL-1）的 LB 培养基中。
    5. 37 °C 培养至 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.6–0.8。
    6. 加入异丙基-β-D-硫代....

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结果

重组融合蛋白 A/G/L 由 816 个氨基酸组成，理论分子量为 90.5 kDa（补充文件 1）。该融合蛋白保留了蛋白 A 的五个 IgG 结合 B 结构域、蛋白 G 的两个 IgG 结合结构域以及蛋白 L 的五个 κ 轻链结合 B 结构域，同时去除了白蛋白结合结构域（图 1A，补充表 1）。在 C 末端添加了一个半胱氨酸残基，以促进共价连接，并引入了 6×His 标签，以便利用 Ni–NTA 亲和层析实现高效纯化（图 1A）。

SDS-PAGE 分析显示，在约 90 kDa 处出现一条明显的条带，与 Protein A/G/L 的预期大小相符，表明大部分表达的蛋白为可溶性蛋白。经过 Ni-NTA 亲和纯化后，目标条带从穿流组分中消失，证实了带 His 标签的蛋白与镍树脂具有强结合能力（图 1B）。少量 Protein A/G/L 在 .......

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讨论

本方案描述了一种基于重组蛋白A/G/L制备荧光补偿微球的实用且高效的实验流程。该流程包括细菌表达、Ni-NTA亲和层析纯化，以及利用EDC/NHS化学方法将纯化的蛋白共价偶联至羧基修饰的聚苯乙烯微球。所获得的微球可结合多种物种及亚类的抗体，为流式细胞术中的荧光补偿提供了一种多功能且经济有效的工具。

使用市售的羧基修饰微球可显著简化该操作流程。在典型的生物实验室中，合成均匀且单分散的羧基化微球在技术上具有较高难度，且常常导致颗粒尺寸和表面电荷的不一致。相比之下，市售微球价格低廉、质量高且可重复性好——例如，250 mg 羧基修饰微球的购买价格约为 21 美元，可为偶联反应提供稳定可靠的基质材料。

市售抗体捕获微珠的成本通常约为每测试2–5美元，具体价格取决于供应商。相比之下，根据本方案，250 mg 羧基修饰的聚苯乙烯微球可支持数千次补偿反应。即使计入重组 Protein A/G/L 表达与纯化的相关成本，每次测试的预估成本仍然非常低。因此，这种实验室自制策略可能是一种经济高效的替代方案，尤其适用于开展高通量或常规多色流式细胞术.......

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披露

所有作者声明不存在利益冲突，且无任何需要披露的内容。

致谢

本工作得到天津市教育委员会科学研究计划项目（2021KJ224）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AF647 大鼠 Ig2aBioLegend141711
APC 小鼠 IgG1BioLegend353311
BL21(DE3) 感受态细胞SangonB528414
BSASolarbioA8010
EDCThermo Fisher22980CAS: 1892-57-5
异硫氰酸荧光素（FITC）叙利亚仓鼠 IgGBioLegend400905
咪唑Sigma-AldrichI202CAS: 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS: 367-93-1
Kanamycin SangonA600286CAS: 8063-07-8
KClAladdinP112134CAS: 7447-40-7
KH2PO4AladdinP434010CAS: 7778-77-0
MESSigma-AldrichM3671CAS: 145224-94-8
Na2HPO4AladdinS274390CAS: 7558-79-4 
NaClAladdinC111549CAS: 7647-14-5
NHSThermo Fisher24500CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FFSmart-LifesciencesSA005005
PE 小鼠 IgG2aBioLegend362603
ProClean 300BeyotimeST853
Tris Sigma-Aldrich252859CAS: 77-86-1 
胰蛋白胨OxoidLP0042
超滤离心管，50 kDa 截留分子量MilliporeUFC9050
均一羧基聚苯乙烯微球Tomicro Biotech10ml, 25mg/ml中国上海
酵母提取物OxoidLP0021

参考文献

  1. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2005).
  2. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  3. Bhowmick, D., Lowe, S. K., Ratliff, M. L.

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重印与许可

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A G L EDC NHS

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