人类脑组织的染色质分析实验

摘要

直到最近，人类大脑的表达研究仅限于RNA或蛋白质的定量分析。通过本文所述的染色质免疫沉淀技术，将有可能在死后大脑中绘制组蛋白甲基化及其他基因表达表观遗传调控因子的图谱。

摘要

慢性神经精神疾病，如精神分裂症、双相情感障碍和自闭症，被认为是由遗传和环境因素共同作用所致，这些因素可能导致基因表达的表观遗传改变及其他分子病理变化。然而，传统上对死后脑组织的表达研究仅限于mRNA或蛋白质的定量分析。死后脑组织研究中遇到的局限性，例如自溶时间与组织完整性的差异，也可能影响对染色质高级结构的研究。不过，来自多个脑库提供的代表性样本中，基因组DNA的核小体结构（包括DNA与核心组蛋白的结合）在很大程度上得以保存。因此，有可能在死后人脑中研究特定基因组位点上核心组蛋白的甲基化模式及其他共价修饰。本文介绍一种适用于冷冻（未经固定）人脑标本的简化原位染色质免疫沉淀（NChIP）实验方案。从微球菌核酸酶消化脑匀浆开始，经NChIP结合qPCR检测，可在三天内完成全部流程。本方法有望用于阐明正常与病变人脑中基因表达的表观遗传调控机制。 关键词：表观遗传学，染色质免疫沉淀，NChIP，核心组蛋白修饰，DNA甲基化，死后脑组织，微球菌核酸酶，qPCR，神经精神疾病，人脑

方案

步骤：

1^st 天

1. 使用Douncing缓冲液匀浆50-500 mg冷冻的死后灰质组织。

！警告！ - 人类组织必须在严格的安全条件下小心操作。应在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的安全标准下进行处理。

1. 从 -80°C 取出先前解剖的死后脑组织，加入 5 倍脑组织体积的匀浆缓冲液进行 Dounce 匀浆，并置于 2.0 mL 微量离心管中。匹配的样本与对照组配对需同时处理。

2. 微球菌核酸酶（MN）消化

1. 向样品中加入5U/mL的微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease），通过上下吹打混匀溶液，然后置于冰上。
   * 关键步骤 - 此步骤需迅速操作，因为微球菌核酸酶在4°C时仍具有活性。
2. 在37°C下孵育样品7分钟。
3. 孵育7分钟后，加入0.5 M EDTA至终浓度为10 mM，以终止MNase活性。

3. 低渗处理

1. 将样品放入15 mL离心管中。加入样品体积10倍的0.2 mM EDTA，样品体积的1/2000的0.2 M苯甲脒（benzamidine）以及样品体积的1/1000的0.1 M苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulphonylfluoride, PMSF）。后两种化合物用作蛋白酶抑制剂。
   * 关键步骤 - 所有这些操作步骤中必须将样品置于冰上。
2. 将样品孵育1小时，每10分钟涡旋混匀一次。
3. 在长达1小时的孵育结束后，加入样品体积1/2000的3 M二硫苏糖醇（DTT），这是另一种蛋白酶抑制剂。
4. 再次涡旋混匀样品，然后在4°C下以3175 RCF离心10分钟。
   * 可选步骤 - 使用Protein G琼脂糖进行预清除。
   1. 取上清液并转移至新的15 mL离心管中。
   2. 加入500 µL Protein G琼脂糖。
   3. 室温下旋转孵育30分钟。
   4. 在4°C下以4000 rpm离心10分钟。
5. 将上清液分配，其中500 µL作为Input对照（仅含基因组DNA），其余部分均分为两个试管，每管含1600 µL样品——用于染色质免疫沉淀（ChIP）实验。
6. Input对照样品在-80°C下保存过夜，待后续使用。
7. 向ChIP样品中加入1/10体积的10X FSB缓冲液和4 μg抗体，涡旋混匀后在4°C下旋转孵育过夜。
   ! 注意！ — 抗体的用量和稀释比例可能需要优化。

2^nd 天

! 警告！- 开始 2^nd 每天通过清洗将用于分离核小体DNA的Protein G Agarose。由于琼脂糖珠非常敏感，在用移液器操作任何含有琼脂糖珠的溶液时，必须剪掉枪头的尖端。

1. 将蛋白G琼脂糖微珠与DNA结合

1. 在2 mL微量离心管（循环）中，向245 µL蛋白G-琼脂糖中加入1.6 mL 1X FSB（足够用于4个管）。
2. 将溶液均分至两个2 mL离心管中，并各自用1X FSB补足至1.6 mL。
3. 室温下旋转混匀30秒，然后以0.1 RCF离心30秒。
4. 使用真空装置去除上清液。
5. 再次加入1.6 mL 1X FSB。样品旋转混匀30秒，随后以0.1 RCF离心30秒。
6. 再次去除上清液，并将两个管中的琼脂糖珠合并至1.5 mL 1X FSB中。
7. 加入15 µL超声处理的鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）。
   ！注意！ - 此步骤原则上可减少免疫沉淀物与珠子的非特异性结合。但这也可能导致某些（人源）DNA序列出现假阳性结果。
8. 室温下旋转孵育30分钟，然后以0.1 RCF离心30秒。
9. 去除上清液，加入200 μL 1X FSB。
10. 向每个ChIP样品中加入90 µL琼脂糖珠，4°C下旋转孵育1小时。
11. 向剩余的琼脂糖珠中加入1 mL 1X FSB作为阴性对照，4°C下旋转孵育1小时。 
12. 孵育1小时后，将样品和阴性对照以0.1 RCF离心30秒，弃去上清液。

2. 洗涤磁珠

！注意！ - 洗涤缓冲液必须在使用前保存在 4°C，且仅可在未超过一个月的情况下使用。

1. 向珠子中加入1 mL每种洗涤液，在室温下旋转孵育3分钟。
2. 在0.1 RCF下离心30秒。 
3. 使用真空装置弃去上清液。

* 每种洗涤液

-- 低盐洗涤缓冲液

——高盐洗涤缓冲液

-- 氯化锂溶液 - 仅在室温下旋转1分钟！

-- TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH=8）

3. 洗脱

* 关键步骤 - 每次实验当天需新鲜配制洗脱缓冲液。

1. 向每个样品中加入 250 µL 新鲜配制的洗脱缓冲液。
2. 室温旋转孵育 15 分钟，然后在 0.4 RCF 下离心 1 分钟。
3. 将上清液收集至一个 2.0 mL 微量离心管中（Loop）。
4. 向每个样品中加入 250 µL 洗脱缓冲液，手动涡旋数秒，然后在多功能涡旋仪上继续涡旋 15 分钟。
5. 在 16 RCF rpm 条件下离心 4 分钟，并将上清液收集至同一个 2.0 mL 管中（Loop）。

4. 消化蛋白质

1. 向每个ChIP样品中加入10 μl 0.5 M EDTA、25 μl 0.8 M Tris-HCl（pH 6.5）和10 mg/ml蛋白酶K（样品体积的1/200）。
2. 向每个Input对照样品中加入用于蛋白酶K消化的裂解缓冲液（样品缓冲液体积的1/10）和10 mg/ml蛋白酶K（样品缓冲液体积的1/200）。
3. 将Input样品和ChIP样品在52°C孵育至少3小时。

5. 酚/氯仿抽提

！警告！ - 涉及苯酚/氯仿的实验必须在通风橱中进行。操作苯酚/氯仿时需佩戴腈手套。

1. 3小时孵育后，向每个样品中加入500 μl苯酚-氯仿。
2. 将所有样品涡旋振荡数秒，然后在13 RCF rpm条件下离心5分钟。
3. 此时会出现两相，我们关注的是上相中的成分。  吸取上相并转移至2 mL微量离心管中。
4. 向每个样品中加入2 µL甘油原和50 µL 3M乙酸钠的混合液，以及1.375 mL 100%乙醇。
5. 剧烈涡旋振荡所有样品，置于-80°C过夜。

3^rd 天

1. 从 -80°C 中取出样品，置于冰上使其解冻。
2. 在 4°C 下以 15 RCF 离心 10 分钟。
3. 小心移除上清液，避免扰动管底的沉淀物。
4. 向每个样品中加入 1 mL 冷的 75% 乙醇， 然后轻轻倒置 4–6 次。
5. 在 4°C 下以 18 RCF 离心 5 分钟。
6. 再次移除上清液，并让沉淀物自然风干。
7. 将干燥的沉淀物溶解于 50 µL 的 4 mM Tris-HCl（pH 8）中，保存于 -80°C，待后续使用。

讨论

本文所述方案对于研究人类大脑组蛋白和/或DNA甲基化特征的研究人员尤为有用，因为与其他类型的修饰（包括（组蛋白）乙酰化和磷酸化）相比，这些染色质标记可能较少受到死后人工假象的影响^{1, 2}。死后大脑组织适用于单核小体样品的研究；DNA在很大程度上仍与核心组蛋白保持结合，至少在自溶间隔时间（即死亡至组织冷冻/储存的时间）具有代表性的样本中是如此，该时间通常为数小时至1.5天¹。然而，单核小体制备物可能对核小体定位和密度的变化较为敏感，特别是在基因转录起始位点周围的序列区域³。因此，应包括使用不依赖修饰的抗组蛋白抗体进行的对照实验。 alternatively，也可通过缩短微球菌核酸酶消化的孵育时间并结合额外的纯化步骤（包括超速离心），从人脑提取物中分离多核小体组分。最后，最近一项关于死后脑组织全基因组转录因子结合的研究直接采用超声波剪切染色质⁴。值得注意的是，从死后研究的角度来看，在超声处理或酶消化前对染色质进行交联固定的制备方法可能并不理想，因为死亡后高级染色质结构的降解和/或人为重构是难以控制的潜在混杂因素。因此，染色质免疫沉淀（ChIP）分析在死后...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
六水合氯化镁	OmniPur，EMD Millipore	5980
氯化钙	Fisher Scientific	C614-3
EDTA，0.5 M 溶液，pH 8.0	OmniPur，EMD Millipore	4055
氯化钠	Mallinckrodt Baker 公司	7581-06
10% (w/v) SDS 溶液	伯乐（Bio-Rad）	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750-25G
氯化锂	Sigma-Aldrich	L9650-100G
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S7277-250G
乙酸钠（无水）	Sigma-Aldrich	S-2889
金黄色葡萄球菌微球菌核酸酶	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
苯甲脒	Fluka	12072
苯甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G 琼脂糖凝胶（快速流速）	Upstate，Millipore	16-266
超声处理鲑鱼精子DNA试剂盒	Stratagene，Agilent Technologies	201190
来自埃默森青霉（Engyodontium album）的蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P2308
苯酚：氯仿 1:1	OmniPur，EMD Millipore	6810
糖原，来自贻贝	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
乙醇（200度）	Pharmco-AAPER	111000200
<强>溶液： <李>nChIP 匀浆缓冲液：10 mM Tris，4 mM MgCl2，1 mM CaCl2 调节pH至7.5 10倍稀释FSB：50 mM EDTA，200 mM Tris，500 mM NaCl，调节pH至7.5 <李>低盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），150 mM NaCl<李>高盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），500 mM NaCl<李>氯化锂缓冲液：1% IGEPAL-CA 630，1% 脱氧胆酸钠，1 mM EDTA（pH 8），10 mM Tris（pH 8），0.25 M LiCl<李>TE缓冲液：10 mM Tris（pH 8），1 mM EDTA<李>洗脱缓冲液：0.1 M NaHCO₃3，1% SDS<李>蛋白酶K消化缓冲液（10X）：1 M Tris，50 mM EDTA，2% SDS，2 M NaCl，调节pH至8.0<李>3 M 醋酸钠：将24.61 g无水醋酸钠（分子量=82.03）溶于100 mL经高压灭菌的蒸馏水中，用浓醋酸调节pH至5.2。
<李>nChIP 玻璃匀浆缓冲液：10 mM Tris，4 mM MgCl₂2，1 mM CaCl2 调节pH至7.5<李>10x FSB：50 mM EDTA，200 mM Tris，500 mM NaCl，调pH至7.5<李>低盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），150 mM NaCl<李>高盐洗涤缓冲液：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris（pH 8），500 mM NaCl<李>氯化锂缓冲液：1% IGEPAL-CA 630，1% 脱氧胆酸钠，1 mM EDTA（pH 8），10 mM Tris（pH 8），0.25 M LiCl<李>TE缓冲液：10 mM Tris（pH 8），1 mM EDTA<李>洗脱缓冲液：0.1 M NaHCO₃3，1% SDS<李>蛋白酶K消化缓冲液（10倍浓度）：1 M Tris，50 mM EDTA，2% SDS，2 M NaCl，调pH至8.0<李>3 M 醋酸钠：将24.61 g无水醋酸钠（分子量=82.03）溶于100 mL经高压灭菌的蒸馏水中，用浓醋酸调节pH至5.2。