用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

摘要

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。

摘要

文献中报道了多种制备小鼠树突状细胞的方法。本文介绍一种可获得超过85% CD11c高表达树突状细胞的培养方法，该细胞在皮下注射后可归巢至引流淋巴结，并向抗原特异性T细胞呈递抗原（见视频）。此外，我们使用Essen Instruments公司的Incucyte系统监测树突状细胞的成熟过程，结果显示在培养第10天，细胞形态具有成熟树突状细胞的典型特征，且<85%的细胞为CD11c高表达。通过双光子成像对周围淋巴结中抗原呈递过程的研究表明，树突状细胞与T细胞的相互作用可分为三个 distinct 阶段^{1, 2}。第一阶段表现为高迁移活性的抗原特异性T细胞与携带抗原的树突状细胞之间发生短暂的连续接触^{1, 2}。第二阶段的特征是抗原特异性T细胞与携带抗原的树突状细胞之间形成持久性接触^{1, 2}。最后，第三阶段表现为T细胞从树突状细胞上脱离，恢复迁移能力并开始增殖^{1, 2}。这是利用双光子成像技术分析负载抗原并用细胞示踪染料标记的树突状细胞所介导的抗原特异性相互作用的一个实例。

方案

1) 从小鼠体内取出双侧股骨

1. 使用解剖剪剪除肌肉，暴露关节（膝关节和髋关节）上下方的股骨。用解剖镊夹住股骨中部，于关节上下方进行剪切，尽可能保留完整的骨骺部分。
2. 使用小型解剖剪尽可能清除残留的肌肉组织。将股骨转移至盛有RPMI的培养皿中。
3. 此后所有操作均应在生物安全柜中进行，并仅使用无菌培养基、器械、移液器吸头和培养皿。

2）股骨灭菌：

1. 在通风橱中，将骨骼从 RPMI 转移至一个盛有冰上预冷的 70% 乙醇的小型培养皿中。
2. 让骨骼在冰上的乙醇中浸泡 5 分钟。

3）在无菌条件下收集骨髓：

1. 将骨骼转移至含有无菌过滤的初级树突状细胞培养基的小型培养皿中。
2. 用无菌镊子夹住骨骼，置于废弃用的培养皿或离心管上方，用无菌剪刀剪去每个骨骺（骨骼两端）。切割应暴露位于骨骼中央、呈鲜红色的骨髓组织。
3. 用一支无菌注射器（26–28号针头），吸取约100–200 mL无菌培养基。
4. 用无菌镊子夹住骨骼，置于盛有新鲜无菌培养基的培养皿上方，将针头插入骨骼的一侧。将针尖置于靠近骨骼顶端的位置，缓慢用无菌培养基冲洗骨骼内部。若针头位于骨骼中央，应可顺利插入。
5. 骨髓会以小块状或整块形式被冲洗出来。 应将其完全冲出骨骼，落入无菌培养基的培养皿中。
6. 根据需要重复此步骤，直至将骨骼中的骨髓完全冲洗干净。
7. 当骨骼被彻底清除骨髓后，会呈现白色且半透明状。
8. 对另一侧股骨重复此操作。每根股骨清洗干净后即弃去。

4) 重悬并离心骨髓细胞：

1. 将细胞转移至无菌的离心管中。
2. 如果骨髓组织仍较完整，需非常轻柔地在培养皿中反复吹打培养基，以将骨髓组织分散成单细胞悬液。此过程可能需要数分钟，应缓慢操作，避免因剪切力过大而损伤细胞。
3. 参照常规哺乳动物细胞的处理方法进行离心。

5）细胞裂解：

1. 离心结束后，从离心机中取出离心管，将上清液倒入生物安全柜中的小废液管（50 mL 离心管）中。
2. 通过轻轻弹击管底重新悬浮沉淀。
3. 使用无菌过滤水和 10x DPBS 或 10x PBS，按以下体积进行水裂解以去除红细胞（RBCs）：
   • 900 mL 无菌过滤水
   • 100 mL 10x DPBS 或 10x PBS
4. 加入水后 5–10 秒内加入 100 mL 10x PBS。此步骤必须立即进行，以确保仅裂解红细胞。建议提前将两支移液器吸满并准备好。
5. 加入 5 mL – 10 mL 无菌 DC 基础培养基。

6) 细胞计数：

1. 在通风橱中，轻轻旋转并略微倒置试管，混匀6至11 mL骨髓细胞， 45度倾斜（倾斜角度以培养基不接触管顶为宜）
2. 将10 mL培养基转移至无菌管中用于计数。
3. 重悬细胞并再次离心。

7) 铺板树突状细胞：

1. 细胞应以 1 × 10⁶/mL 的密度接种。
2. 从离心机中取出细胞，弃去上清液，并用适量的初级树突状细胞培养基重悬细胞以进行接种。
3. 放入组织培养孵育箱中。 

8）培养护理与成熟：

在添加更多培养基或用于任何实验之前，务必检查细胞培养状况。观察细胞的整体健康状态，并检查是否存在潜在污染。

第0天：已接种树突状细胞。

第3天：移除75%的培养基和非贴壁细胞，并重新加入初级树突状细胞培养基。

第6天：初次细胞接种后，按以下步骤重新接种细胞：

1. 移除培养基（此时应含有部分非贴壁树突状细胞），并转移至无菌的50 mL Falcon管中，使培养板表面略微湿润（避免贴壁细胞干燥）
2. 向每块培养板中加入含3 mM EDTA的PBS，并静置 静置5分钟。
3. 将培养板倾斜至45度角，轻轻吹打培养基，使其沿培养板底部反复上下流动，以温和地去除未贴壁细胞。
4. EDTA/PBS 应变得更粘稠，表明细胞正从培养板底部被收集起来。
5. 经过数分钟后，可将细胞混合物转移至50 mL离心管中。
6. 每块培养板完成此操作后，均需对细胞进行离心。
7. 在新的无菌10 cm培养皿中，用继代DC培养基以每皿1 × 10^6的密度接种细胞并计数。将细胞放回组织培养孵箱中。

第10-11天

用于刺激/抗原负载的成熟树突状细胞。

9）树突状细胞刺激：

1. 使用脂多糖（LPS）与目标肽联合进行细胞激活和肽的负载。根据所用LPS来源的不同，不同的刺激条件可能产生更优的效果。此外，树突状细胞呈递所需的目标肽用量应进行优化。本方案中的刺激条件为100 ng/mL LPS和100 µg/mL OVA（卵清蛋白）。 
2. 收获或使用前，用抗原负载并用LPS处理18–24小时。

树突状细胞培养基：添加所有成分后进行无菌过滤

有关不同树突状细胞培养条件及其所获得的树突状细胞表型的综述，请参见讨论部分。这些培养条件旨在产生成熟的树突状细胞，使其在皮下注射后18-24小时内迅速归巢至引流淋巴结，并有效呈递抗原。

初级树突状细胞培养基：所有成分添加完毕后进行无菌过滤

• 500 mL IMDM（移除 55–60 mL，以获得 500 mL 的终体积）
• 50 mL 热灭活 FBS
• 5 mL 200 mM L-谷氨酰胺，终浓度为 2 mM
• 100 IU/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素（取 10,000 IU/mL 青霉素和 10,000 mg/mL 链霉素储备液各 5 mL）
• 50 µM β-巯基乙醇（β-Me）（14.3 M β-Me 储备液，在通风橱中按 1:100 稀释，每 100 mL 培养基加入 35 µL，以获得 50 µM 的终浓度）
• 20–30 ng/mL GM-CSF
• 100–400 IU/mL IL-4，约相当于 10–40 ng/mL

用于成熟的次级DC培养基*

100 ng/mL TNF-α（加入初级DC培养基中）

* 注意：GM-CSF + IL-4 应诱导生成未成熟树突状细胞。使用 GM-CSF + IL-4（400 IU/μL）+ TNF-α（100 μg/mL）将诱导生成类似于成熟单核细胞来源的树突状细胞。已知成熟树突状细胞摄取抗原的效率低于未成熟树突状细胞，且培养物中可能有基质细胞释放的内源性TNF-α⁴。

讨论

树突状细胞是适应性免疫反应的关键介导者，也是迄今为止已知最有效的抗原提呈细胞。文献中关于人和小鼠树突状细胞的培养方法，在所用细胞因子类型上存在差异，这些细胞因子用于影响不同类型树突状细胞的发育。值得注意的是，通过使用GM-CSF、flt3L、IL4、IL13、TNF-alpha和IFN-gamma的不同组合，可在体外诱导生成成熟、未成熟、炎症性以及稳态样小鼠骨髓来源树突状细胞^3-7在此，我们介绍一种简单的方法，用于制备成熟的鼠源性树突状细胞，该细胞在皮下注射后能够归巢至引流淋巴结，提呈抗原并激活初始T细胞。所获得的树突状细胞群体通常超过85%为CD11c高表达，并在LPS激活后可诱导表达CD80/86。在培养第7天添加TNF-α为可选步骤，可促进获得更成熟的表型8。细胞的维持培养 体外 朗格汉斯树突状细胞培养中，TNF-α 是一种重要的存活因子，但不能刺激细胞成熟⁹需要注意的是，已有报道称培养基中存在内源性来源（可能是基质细胞）的TNF-α⁷其他成功用于成像皮下注射树突状细胞的方法包括从脾脏中对CD11c+细胞进行阳性筛选，以及对内源性树突状细胞群体进行...