从人死后脑组织中分离神经元细胞核

摘要

脑组织的细胞异质性对染色质中表观遗传标记的研究构成了显著限制，因为大多数检测方法缺乏单细胞分辨率。神经元通常与胶质细胞及其他非神经元细胞混杂在一起。本文提供了一种从人脑中提取和收集神经元细胞核的实验方案。

摘要

人类大脑中的神经元大多在产前发育阶段即进入终末分化状态，因此其细胞核在整个生命周期中持续存在。然而，目前对于神经元染色质和细胞核结构在发育、衰老过程中，以及在慢性神经精神疾病状态下的变化仍知之甚少。迄今为止，大多数基于染色质和DNA的检测方法（荧光原位杂交FISH除外）缺乏单细胞分辨率。由于脑组织具有高度的细胞异质性，通常不同类型神经元亚群与多种胶质细胞及其他非神经元细胞相互混杂，这给研究带来了显著限制。一种可能的解决方案是建立细胞类型特异性的培养体系，但包括神经元在内的大多数中枢神经系统细胞在体外最多仅能维持数周，因此无法充分模拟贯穿整个生命周期的表观遗传调控机制。本文提供一种从冷冻（未经固定）的人类死后脑组织中提取和纯化细胞核的实验方案。该方法包括在低渗裂解缓冲液中提取细胞核，随后进行超速离心及使用抗NeuN抗体进行免疫标记。标记后的神经元细胞核通过荧光激活分选技术单独收集。该方法适用于多种物种的广泛脑区，可用于针对组蛋白位点特异性和修饰特异性抗体的染色质免疫沉淀研究，以及DNA甲基化和其他相关检测。

方案

细胞核提取

1. 将 250 mg 冷冻的死后脑组织放入含 5 mL 裂解缓冲液¹ 的玻璃匀浆器中，并置于冰上。为了在 FACS 分选后获得约 500 万个细胞核，我们通常每样本使用 1000 mg 组织。
2. 待组织解冻后，在冰上匀浆 1 分钟。
3. 取匀浆后的组织，转移至 15 mL 透明超速离心管中，并将离心管置于冰上。
4. 用移液器吸取 9 mL 蔗糖溶液²，将移液器尖端置于透明超速离心管底部，缓慢释放蔗糖溶液²，使匀浆液在蔗糖溶液²上方形成浓度梯度。
5. 称量超速离心管，确保所有离心管在超速离心机旋转过程中保持平衡。若需调整重量，可通过向顶层加入裂解缓冲液¹进行校正。
6. 称重完成后，将离心管放入转子吊桶中。
7. 将所有吊桶放入 SW28 转子，并小心地将转子放入超速离心机中。
8. 在 4°C 条件下，以 107163.6 RCF 离心 2.5 小时。
9. 离心结束后，使用真空泵小心吸除上清液以及浓度梯度中的碎片层，注意不要扰动管底含有细胞核的沉淀。
10. 向每份沉淀中加入 500 µL 1× PBS，冰上静置 20 分钟。此步骤可使沉淀自行轻微溶解，便于后续通过上下吹打机械性完全溶解，从而减少细胞核所受的机械应力。
11. 细胞核在冰上孵育 20 分钟后，通过移液上下吹打，彻底将细胞核溶解于 1× PBS 中。
12. 将含细胞核的溶液从超速离心管中取出，将两管溶液合并至一个 2 mL 微量离心管中。再次将样品置于冰上。

FACS 免疫染色

1. 此时，配制免疫染色混合液，包含一抗、二抗和封闭液。每个样本中加入含有1.2 µL NeuN抗体的300 µL 1×PBS、100 µL封闭液（含0.5% BSA和10%正常山羊血清的1×PBS）以及1 µL Alexa Fluor 488。对于对照样本，省略一抗NeuN，仅额外添加1×PBS。
2. 将免疫染色混合液涡旋混匀，在室温下避光孵育5分钟。
3. 在染色混合液孵育期间，制备样本的对照。进行FACS分选时，需要一个仅含细胞核的样本作为“未染色对照”；还需要第二个阴性对照样本，即仅加入二抗Alexa Fluor 488而不加一抗NeuN的细胞核样本。
4. 取20 µL含细胞核的溶液加入至含有1×PBS的2 mL微量离心管中作为未染色对照；另取20 µL加入至另一支含有980 µL 1×PBS的2 mL离心管中作为阴性对照。用1×PBS将含细胞核的样本体积重新补至1 mL。所有样本均放回冰上保存。
5. 免疫染色混合液完成孵育后，将其401 µL内容物加入相应的样本中。细胞核样本将加入含有NeuN和Alexa Fluor 488的混合液，而阴性对照样本 将只加入仅含二抗Alexa Fluor 488的混合液。
6. 将样本转移至冷室中，在避光条件下旋转孵育45分钟。
7. 样本在避光条件下孵育45分钟后，置于冰上并运送至FACS实验平台。在运送过程中，样本应始终保持在冰上并避光。

流式细胞分选

1. 在FACS实验中心，将样品通过40 μm滤膜过滤，然后上机检测。 它们 通过仪器运行几分钟，同时保持低温，以在分选前获得一些初步数据。
2. 此时，需要设置用于分选的适当门控。分选样品时会使用几种不同的门控。第一个门控可提供样品中不同细胞核大小的初步信息， 可实现分离 来自实际细胞核的碎片。第二个门控用于对细胞核进行单个分选，此时任何聚集体均被丢弃。最后，第三个门控设定在特定荧光波长，与二抗所携带的荧光染料波长相匹配。通过设置此门控，可分选并分离 NeuN +（即神经元细胞核）与 NeuN - 细胞核。
3. 在选定所有门控参数后，可将细胞核分选至1×PBS中。
4. 待全部样品过柱后，取部分分选后的样品通过仪器检测分选纯度。确保样品的荧光信号不弥散，而是集中于单一象限内。建议选择纯度超过90%的样品。

流式细胞分选后

1. 样本分选完成后，即可开始处理细胞核。取10 mL分选后的样本，加入2 mL蔗糖溶液²、50 µL 1 M CaCl₂和30 µL 1 mM Mg(Ace)₂。请注意，由于细胞核未固定，操作过程中务必始终将样本置于冰上。
2. 若分选后的样本体积少于10 mL，可加入1×PBS补足至10 mL，或相应调整其他添加物的用量。
3. 轻轻颠倒混匀数次，置于冰上静置15分钟。
4. 冰浴孵育15分钟后，将样本在4^°C条件下，以1786 RCF离心15分钟（使用水平转子）。
5. 用真空装置小心吸弃上清液，注意不要扰动管底的白色沉淀。
6. 将沉淀溶解于后续实验所需的200 µL溶液中，并用移液器反复吹打混匀。
7. 将溶液转移至较小的离心管中，保存于-80°C冰箱，待后续使用。

讨论

本文所述方案对于研究神经元染色质的表观遗传变化，以及更广泛地研究神经元细胞核的分子表型，在正常发育与衰老过程中，或在神经或精神疾病状态下，具有特别重要的意义。当脑组织的细胞异质性（包括在衰老过程或疾病影响下神经元与胶质细胞比例的潜在变化）成为关注重点时，该方法尤其具有优势¹。例如，我们近期将本分离方案与染色质免疫沉淀技术相结合，揭示了脑源性神经营养因子（BDNF）基因启动子区域以及其它神经元基因上的神经元特异性组蛋白甲基化模式²。此前已有类似方法用于从成年大脑皮层中分离神经元，以进行回顾性出生时间测定³。该分选技术也已在小鼠脑组织中应用²，并且由于细胞核在冷冻-解冻组织中的稳定性良好，我们预计本文所述方法可适用于多种物种。由于目前即使仅使用低至10,000个细胞，也能实现对基因组更全面的覆盖进行染色质免疫沉淀分析⁴，因此实际所需的起始材料可能远低于我们上述推荐的1000 mg。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂： <表格><胸段>
0.32 M	蔗糖	5.47 g
5 mM	CaCl2	250 μl
3 mM	Mg(乙酸盐)2	150 μl
0.1 mM	EDTA	10 μl
10 mM	Tris-HCl，pH 8	500 μl
1 mM	DTT	17 μl
0.1%	Triton X-100	50 μl
用灭菌水定容至 50 ml

<跨列数"3" 对齐="左侧">1. 裂解缓冲液<表格><胸段><跨列数="3" 对齐="左侧">2. 蔗糖溶液1.8 M蔗糖30.78 g3 mM Mg(乙酸盐)₂150 μl1 mMDTT17 μl10 mMTris-HCl，pH 8500 μl用灭菌水定容至 50 ml<表格><胸腹部><跨列数="3" 对齐="左侧">3. Dounce 缓冲液10 mMTris0.242 g4 mMMgCl₂₂0.163 g1 mMCaCl₂0.03 g用去离子水定容至200 ml，并调节pH至7.5