甲基化DNA免疫沉淀

摘要

本视频演示了甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的实验方案。MeDIP是一个为期两天的实验流程，利用对5-甲基胞嘧啶（anti-5 mC）具有特异性的抗体，从基因组DNA样本中选择性地富集甲基化的DNA片段。

摘要

DNA甲基化模式的鉴定是表观遗传学研究中的常见实验步骤，因为已知甲基化对基因表达具有重要影响，并参与正常发育以及疾病的发生。^1-4因此，能够区分甲基化DNA与非甲基化DNA对于生成此类研究的甲基化谱图至关重要。甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）是一种从目标样本中有效提取甲基化DNA的技术。^5-7. 仅需 200 ng 的 DNA 样品即可满足抗体或免疫沉淀（IP）反应的需求。DNA 经超声处理断裂为 300–1000 bp 大小的片段，并分为免疫沉淀（IP）和输入（IN）两部分。IP DNA 随后经加热变性，再与抗-5'mC 抗体孵育，使单克隆抗体能够结合甲基化的 DNA。接着加入含有可与一抗特异性结合的二抗的磁珠，并进行孵育。这些磁珠连接的二抗将结合第一步中使用的单克隆抗体。利用磁铁将与抗体复合物结合的 DNA（即甲基化 DNA）从溶液中分离出来。随后使用 IP 缓冲液进行多次洗涤，以去除未结合的非甲基化 DNA。然后用蛋白酶 K 消化甲基化 DNA/抗体复合物，降解抗体，仅保留完整的甲基化 DNA。富集后的 DNA 通过苯酚:氯仿抽提法纯化以去除蛋白质成分，再经沉淀并重悬于水中，以备后续使用。可采用 PCR 技术通过分析已知不含甲基化序列和已知含有甲基化序列区域的 IP 与 IN DNA 扩增产物，来验证 MeDIP 实验的效率。纯化后的甲基化 DNA 可用于位点特异性（PCR）或全基因组范围（微阵列和测序）的甲基化研究，尤其适用于与其他研究工具（如基因表达谱分析和芯片比较基因组杂交（CGH））联合应用时。⁸对DNA甲基化的进一步研究将有助于发现新的表观遗传学靶点，这些靶点可能在开发针对癌症等以异常甲基化DNA为特征的疾病的新型治疗或预后研究工具方面具有重要价值。^{2, 4, 9-11}.

方案

DNA 提取与样品制备

多种不同来源的DNA（培养细胞、新鲜冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋组织）均可用于甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。必须使用高度纯化的DNA，避免组蛋白等蛋白质残留。同时应尽可能去除样本中的RNA，因其可能干扰DNA定量及抗体结合。用于MeDIP的DNA用量可根据样本可获得量在200 ng至1 µg之间调整。本方案以1 µg DNA为例进行说明。以下方案可从培养细胞中提取高质量的双链DNA。对于其他类型的样本，应采用相应的DNA提取方法。

1. 在1.7 ml离心管中的细胞沉淀中加入400 μl裂解缓冲液。
2. 向管中加入100 μg蛋白酶K，在50°C下过夜孵育。
3. 加入500 μl pH 7的酚溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
4. 在室温下以13 000 g离心10分钟。
5. 将水相（上层）转移至新管中。
6. 重复步骤3至5一次。
7. 加入500 µl 1:1 pH 7的酚/氯仿溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
8. 在室温下以13 000 g离心10分钟。
9. 将水相（上层）转移至新管中。
10. 加入40 μg RNase A，在37°C孵育1小时。
11. 加入500 μl pH 7的酚溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
12. 在室温下以13 000 g离心10分钟。
13. 将水....

讨论

人们日益认识到DNA甲基化在疾病中发挥的重要作用，因此检测这种修饰的分析方法的开发正变得愈发重要^{3, 12, 13}。MeDIP技术是一种适用于全基因组水平和位点特异性水平筛查的可行工具^{6, 7}。该技术仅需少量起始DNA即可快速评估DNA甲基化水平，并便于在不同样本之间进行简单比较。MeDIP产物的下游应用包括多种微阵列技术，如全基因组和CpG岛寡核苷酸微阵列、针对特定基因座的直接PCR检测，以及测序分析。

MeDIP 提供了一种独特的DNA甲基化检测方法，该方法依赖抗体来区分甲基化和非甲基化的DNA⁶。尽管MeDIP比传统的亚硫酸氢盐测序方法更快，且不像限制性酶切分析那样局限于特定序列的分析，但其免疫沉淀效果会受到DNA序列的影响，包括CpG密度、重复元件的存在及其组成。因此，与所有实验一样，适当的对照对于MeDIP结果的分析和解释至关重要。

在MeDIP技术的多个步骤中需格外谨慎，包括：使用硅化管以防止DNA非特异性结合管壁；确保超声处理后DNA充分片段化；以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biorupter 超声破碎仪	工具	Diagenode	UCD-200 TM
1.7 ml SafeSeal 微量离心管	其他	Sorenson BioScience	11510
ND 3300 分光光度计	工具	NanoDrop
一抗：抗-5’-甲基胞嘧啶小鼠单克隆抗体	试剂	Calbiochem	162 33 D3
二抗：Dynabeads M-280 羊抗小鼠 IgG 磁珠	试剂	Invitrogen	112-01D
磁力管架	工具	Invitrogen	CS15000
Mini LabRoller 混匀仪	工具	Labnet International	H5500
IP 缓冲液				10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100，室温保存
消化缓冲液				10 mM Tris pH 8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl