本视频演示了甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的实验方案。MeDIP是一个为期两天的实验流程，利用对5-甲基胞嘧啶（anti-5 mC）具有特异性的抗体，从基因组DNA样本中选择性地富集甲基化的DNA片段。
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摘要
摘要
DNA甲基化模式的鉴定是表观遗传学研究中的常见实验步骤，因为已知甲基化对基因表达具有重要影响，并参与正常发育以及疾病的发生。1-4因此，能够区分甲基化DNA与非甲基化DNA对于生成此类研究的甲基化谱图至关重要。甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）是一种从目标样本中有效提取甲基化DNA的技术。5-7. 仅需 200 ng 的 DNA 样品即可满足抗体或免疫沉淀（IP）反应的需求。DNA 经超声处理断裂为 300–1000 bp 大小的片段，并分为免疫沉淀（IP）和输入（IN）两部分。IP DNA 随后经加热变性，再与抗-5'mC 抗体孵育，使单克隆抗体能够结合甲基化的 DNA。接着加入含有可与一抗特异性结合的二抗的磁珠，并进行孵育。这些磁珠连接的二抗将结合第一步中使用的单克隆抗体。利用磁铁将与抗体复合物结合的 DNA（即甲基化 DNA）从溶液中分离出来。随后使用 IP 缓冲液进行多次洗涤，以去除未结合的非甲基化 DNA。然后用蛋白酶 K 消化甲基化 DNA/抗体复合物，降解抗体，仅保留完整的甲基化 DNA。富集后的 DNA 通过苯酚:氯仿抽提法纯化以去除蛋白质成分，再经沉淀并重悬于水中，以备后续使用。可采用 PCR 技术通过分析已知不含甲基化序列和已知含有甲基化序列区域的 IP 与 IN DNA 扩增产物，来验证 MeDIP 实验的效率。纯化后的甲基化 DNA 可用于位点特异性（PCR）或全基因组范围（微阵列和测序）的甲基化研究，尤其适用于与其他研究工具（如基因表达谱分析和芯片比较基因组杂交（CGH））联合应用时。8对DNA甲基化的进一步研究将有助于发现新的表观遗传学靶点，这些靶点可能在开发针对癌症等以异常甲基化DNA为特征的疾病的新型治疗或预后研究工具方面具有重要价值。2, 4, 9-11.
方案
DNA 提取与样品制备
多种不同来源的DNA（培养细胞、新鲜冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋组织）均可用于甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。必须使用高度纯化的DNA，避免组蛋白等蛋白质残留。同时应尽可能去除样本中的RNA，因其可能干扰DNA定量及抗体结合。用于MeDIP的DNA用量可根据样本可获得量在200 ng至1 µg之间调整。本方案以1 µg DNA为例进行说明。以下方案可从培养细胞中提取高质量的双链DNA。对于其他类型的样本，应采用相应的DNA提取方法。
- 在1.7 ml离心管中的细胞沉淀中加入400 μl裂解缓冲液。
- 向管中加入100 μg蛋白酶K，在50°C下过夜孵育。
- 加入500 μl pH 7的酚溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
- 在室温下以13 000 g离心10分钟。
- 将水相（上层）转移至新管中。
- 重复步骤3至5一次。
- 加入500 µl 1:1 pH 7的酚/氯仿溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
- 在室温下以13 000 g离心10分钟。
- 将水相（上层）转移至新管中。
- 加入40 μg RNase A，在37°C孵育1小时。
- 加入500 μl pH 7的酚溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
- 在室温下以13 000 g离心10分钟。
- 将水相（上层）转移至新管中。
- 重复步骤11至13一次。
- 加入500 µl 1:1 pH 7的酚/氯仿溶液，通过倒置轻轻但充分混匀。
- 在室温下以13 000 g离心10分钟。
- 将水相（上层）转移至新管中。
- 加入1/10体积的3 M醋酸钠（40 μl），充分混匀。
- 加入2倍体积（900 μl）的100%乙醇，充分混匀后于-20°C放置20分钟。
- 在4°C下以13 000 g离心20分钟。
- 弃去乙醇，短暂离心后用移液器吸除残留乙醇。
- 加入500 μl预冷的70%乙醇洗涤，在4°C下以13 000 g离心20分钟。
- 弃去70%乙醇，短暂离心后用移液器吸除残留乙醇。
- 将沉淀在室温下开盖风干10分钟，以彻底去除残留乙醇。
- 在4°C下用50 μl无菌dH₂O过夜重悬DNA。
- 使用NanoDrop分光光度计测定DNA浓度。A260:A280比值为1.8时为理想状态。
- 使用含100 bp DNA标记物的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和片段大小范围。可将低至10 ng的基因组DNA上样至1.7%琼脂糖凝胶，随后使用对微量DNA高度敏感的染料（如SYBR Gold）进行染色。
- 每个样品使用一个硅化管，将1 µg DNA用无菌dH2O补至总体积50 μl。
DNA 超声处理
DNA 超声处理和 MeDIP 实验方案必须在硅化管中进行，以防止蛋白质非特异性结合到管壁上。DNA 样品的最佳超声时间应根据凝胶电泳结果确定的 DNA 片段化程度而定（步骤 27）。例如，从培养细胞中提取的 DNA 分子量通常非常高，因此需要比从存档样本中提取的 DNA 更长的超声时间，因为后者往往已部分降解。如果所有样品的分子量均一致地较高，则可合理地按照本实验方案所述直接进行超声处理，而无需逐一检测每个样品。如果样品本身已存在片段化（如存档样本），则需调整超声程序，可能需要缩短超声时间，以获得 300–1000 bp 的片段。若预计处理的样品存在部分降解情况，可在代表性样本上优化超声参数。根据凝胶电泳观察到的 DNA 片段化程度（步骤 27），实验人员可预先确定该类样品的最佳超声时间。本文描述的方法使用高分子量 DNA，通过自动化超声设备（Diagenode 的 Bioruptor，UCD-200 TM）进行超声处理，以获得 300–1000 bp 的 DNA 片段。
- Biorupter 中的水温必须保持在 4°C。
- 在自动设置下超声处理 7 分钟（最大功率，开启 30 秒，关闭 30 秒）。
- 取 800 ng（40 μl）超声处理后的产物，置于经硅烷化处理的 1.7 ml 离心管中，用于免疫沉淀（IP）反应。
- 保留剩余的 200 ng（10 μl）作为输入（IN）参考 DNA（置于 4°C 保存）。
甲基化DNA的免疫沉淀
- 将用于免疫沉淀（IP）反应的 DNA（800 ng）在水浴中于 95°C 变性 10 分钟。
- 立即置于冰上冷却。在进行下一步操作前，确保 DNA 在冰上完全冷却（约 5 分钟）。
- 加入 5 μg 单克隆抗体。
- 加入 IP 缓冲液（本方案中始终在室温下使用），使终体积达到 500 μl。
- 在 4°C 下于旋转管架中孵育 2 小时。
- 在步骤 5 即将完成前，开始准备 Dynabeads（进行步骤 6–11）。首先，通过涡旋充分重悬瓶中的磁珠。
- 每反应另加 1 份，向新的硅化管中转移 30 μl（约 2 × 107）重悬的 Dynabeads（例如，若进行 8 个反应，则取出 9 份所需的磁珠，即 270 μl）。
- 将管置于磁力架上，室温静置 2 分钟。
- 用移液器吸除上清液。吸取过程中，避免移液枪头接触管内壁（磁珠被磁铁吸附的一侧）。
- 将管从磁力架上取下，用过量 IP 缓冲液（750 μl–1000 μl）重悬磁珠，再放回磁力架上，室温静置 2 分钟。
- 重复洗涤一次，然后将洗涤后的磁珠用与步骤 7 中取出体积相同的 IP 缓冲液重悬。
- 向每个 IP 反应中加入 30 μl 洗涤后的 Dynabeads。
- 在 4°C 下于旋转管架中孵育 2 小时。
- 孵育完成后，将管置于磁力架上，室温静置 2 分钟。
- 吸除上清液，避免移液枪头接触管内壁（磁珠被磁铁吸附的一侧）。加入 500 μl IP 缓冲液，混匀管内物质后放回磁力架上，室温静置 2 分钟。用 500 μl IP 缓冲液再洗涤一次。
- 最后一次洗涤去除上清液后，将磁珠重悬于 400 μl 消化缓冲液中。
- 加入 100 μg 蛋白酶 K 处理反应，并在 50°C 下过夜孵育。
免疫沉淀 DNA 的纯化
- 添加 500 μl 1:1 酚/氯仿 pH 7，充分涡旋混匀。
- 室温下以13 000 g离心10分钟。
- 移取水相（上层）至新离心管中。
- 如果水相与有机相之间的界面显得浑浊，则重复步骤1至3。
- 加入1/10th 3 M 醋酸钠溶液40 μl）并涡旋振荡。
- 添加 1 μl 糖原的20 μg/μl）并涡旋震荡。
- 加入2倍体积（1000 μl) 100% 乙醇，涡旋混匀，置于 -20°C 20分钟
- 13 000 g 离心 20 分钟 4°C.
- 去除乙醇，瞬时离心，去除残留乙醇。
- 添加 500 μl 用预冷的70%乙醇洗涤。短暂涡旋振荡，然后在13 000 g离心20分钟 4°C.
- 移除70%乙醇，短暂离心，用移液枪吸去残留乙醇。
- 将沉淀物在室温下敞盖风干10分钟，以彻底去除残留的乙醇。
- 将DNA沉淀重悬于 10 μl 无菌去离子水20.
通过 PCR 进行验证
- 可通过使用正常人类 DNA（男性或女性）进行 MeDIP 实验，并检测已知富含甲基化的区域，以验证 MeDIP 操作是否成功。
- 将 30% 的 MeDIP 产物转移至一个 PCR 管中，另取 30% 的 MeDIP 产物转移至另一个 PCR 管中。
- 将 10 ng 的输入 DNA（IN DNA）加入一个 PCR 管中，另取 10 ng 的输入 DNA 加入另一个 PCR 管中。此时您应已准备好四个独立的 PCR 反应。
- 按照表 1 所示，使用 H19 和 CTRL 引物进行 PCR 扩增。
- 为 PCR 反应配制两种预混液（每种引物对应一种），总体积为 12.5 µl，具体组分见表 2。
- 按照表 3 所列条件进行 PCR 扩增的热循环程序。
- 取 5 µl PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，用于可视化检测。
- 成功的 MeDIP 实验预期结果见表 4。
表格
表1：用于PCR验证的H19和CTRL引物。
| 引物组合 | 正向引物 | 反向引物 | 预期产物大小 |
| H19 | H19_F 5’-cgagtgtgcgtgagtgtgag | H19_R 5’-ggcgtaatggaatgcttgaa | 174 bp |
| CTRL（对照） | CTRL_F 5’-gagagcattagggcagacaaa | CTRL_R 5’-gttcctcagacagccacattt | 139 bp |
表2. PCR反应的主混合液。
| H19混合液（每反应） | CTRL混合液（每反应） | |
| ddH2O | 6.875 | 6.875 |
| 10X缓冲液 | 1.25 | 1.25 |
| dNTP混合液（各10 mM） | 0.25 | 0.25 |
| MgCl2（50 mM） | 0.25 | 0.25 |
| 引物（H19_F/R或CTRL_F/R）（每对F/R各10 µM） | 0.625 | 0.625 |
| Platinum Taq | 0.25 | 0.25 |
表3. PCR扩增循环条件。
| 95°C | 5:00 | |
| 40X | 95°C | 0:30 |
| 56°C | 0:30 | |
| 72°C | 0:15 |
表4. 成功进行甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的预期PCR结果。
| 模板DNA | ||
| 使用的引物 | 输入（IN） | 免疫沉淀（IP） |
| H19 | 阳性 | 阳性 |
| CTRL | 阳性 | 阴性 |
讨论
人们日益认识到DNA甲基化在疾病中发挥的重要作用，因此检测这种修饰的分析方法的开发正变得愈发重要3, 12, 13。MeDIP技术是一种适用于全基因组水平和位点特异性水平筛查的可行工具6, 7。该技术仅需少量起始DNA即可快速评估DNA甲基化水平，并便于在不同样本之间进行简单比较。MeDIP产物的下游应用包括多种微阵列技术，如全基因组和CpG岛寡核苷酸微阵列、针对特定基因座的直接PCR检测，以及测序分析。
MeDIP 提供了一种独特的DNA甲基化检测方法，该方法依赖抗体来区分甲基化和非甲基化的DNA6。尽管MeDIP比传统的亚硫酸氢盐测序方法更快，且不像限制性酶切分析那样局限于特定序列的分析，但其免疫沉淀效果会受到DNA序列的影响，包括CpG密度、重复元件的存在及其组成。因此，与所有实验一样，适当的对照对于MeDIP结果的分析和解释至关重要。
在MeDIP技术的多个步骤中需格外谨慎，包括：使用硅化管以防止DNA非特异性结合管壁；确保超声处理后DNA充分片段化；以及确保DNA完全变性。此外，需注意单链MeDIP产物的定量可能较为困难，因为样品量有限，且许多常用的DNA定量方法（如分光光度法）对双链DNA的检测效果更佳。同时，必须始终遵守实验室安全操作规范，尤其是在使用苯酚等腐蚀性物质时。
MeDIP 技术的多个步骤也可进行修改。重要的是，该方案可按需放大或缩小，以获得更高的产量，或适用于有限的样本量。另一种片段化方法，例如使用限制性内切酶（如 AluI 消化），可减少对仪器设备的需求，但也可能引入偏差，从而在某些区域限制DNA的富集。与任何方法一样，最好采用另一种DNA甲基化检测方法对结果进行验证1, 14。
致谢
我们感谢布朗实验室和林实验室的成员参与本视频和文章的审阅工作。本研究得到了加拿大卫生研究院和迈克尔·史密斯健康研究基金会的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter 超声破碎仪 | 工具 | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7 ml SafeSeal 微量离心管 | 其他 | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 分光光度计 | 工具 | NanoDrop | ||
| 一抗：抗-5’-甲基胞嘧啶小鼠单克隆抗体 | 试剂 | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| 二抗：Dynabeads M-280 羊抗小鼠 IgG 磁珠 | 试剂 | Invitrogen | 112-01D | |
| 磁力管架 | 工具 | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller 混匀仪 | 工具 | Labnet International | H5500 | |
| IP 缓冲液 | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100，室温保存 | |||
| 消化缓冲液 | 10 mM Tris pH 8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
参考文献
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