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方法文章

使用CyDye DIGE Fluor最小染料对细胞表面蛋白进行选择性标记

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DOI：

10.3791/945

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2008年11月26日

 ,  ,  , 
1Research and Development, GE Healthcare Bio-Sciences AB

本文内容

摘要

本文展示了一种无需分级步骤即可对细胞表面蛋白进行荧光标记并增强检测的简单且特异的方法。采用二维（2-D）电泳结合Ettan™ DIGE技术分析细胞表面蛋白的差异丰度。

摘要

细胞表面蛋白在细胞响应环境及与邻近细胞相互作用中起核心作用。已知它们几乎可诱导所有细胞内信号通路。此外，表面蛋白在环境适应、药物治疗中具有重要作用，并常参与疾病的发生机制与病理过程（1）。蛋白质-蛋白质相互作用是信号转导通路的内在组成部分，为了更深入理解这些复杂的生物学过程，需要灵敏且可靠的方法来研究细胞表面蛋白。二维（2-D）电泳被广泛用于复杂蛋白质样品中生物标志物及其他靶标的检测，以研究差异性变化。由于细胞表面蛋白丰度较低（约占细胞总蛋白的1–2%），在未经分级分离或富集处理的情况下，很难在2-D凝胶中检测到。此外，由于其疏水性及高分子量，这类蛋白在2-D凝胶中的表征通常较差（2）。本研究提出一种针对完整细胞的新方案，采用CyDye DIGE Fluor最小标记荧光染料对这一重要蛋白群体进行特异性标记与检测。结果显示，该方法可特异性标记大量细胞表面蛋白，而对细胞内蛋白的标记极少。该方案快速、操作简便，且三种CyDye DIGE Fluor最小标记染料（Cy 2、Cy 3和Cy 5）均可用于细胞表面蛋白的标记。这些特性使得该方法可与Ettan DIGE技术结合，应用于二维荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE），并利用DeCyder 2-D差异分析软件分析蛋白质表达变化。本研究还检测了CHO细胞在不同时间血清饥饿处理过程中细胞表面蛋白水平的变化（见表1）。该方法能够以高准确性检测到丰度的微小变化，且结果经严谨的统计学方法验证。

方案

细胞培养

  1. 使用含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素及GlutaMAX I的F-12 Ham培养基，按照标准细胞培养操作规程培养中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1） 50 µg/ml 硫酸链霉素（Invitrogen）
  2. 将培养基更换为无血清培养基。在不同时间点使用 CyDye DIGE Fluor Cy3 或 Cy5 最小荧光染料对细胞表面蛋白进行标记（参见第 细胞表面标记，如下所示。
  3. 将每个时间点的细胞取等量混合，并用 CyDye DIGE Fluor Cy2 标记。使用 将这些作为每块二维凝胶的内标。
  4. 大部分实验可使用CHO-K1细胞进行，但也可使用小鼠胚胎成纤维细胞（3T3 L1）和小鼠腹水淋巴瘤淋巴母细胞（EL4）（数据未显示）。
  5. 将后两种细胞类型在含 GlutaMAX II 的 DMEM 培养基中培养，其余条件相同 CHO-K1 细胞所用的相同条件。

细胞表面标记

  1. 小心地非酶法解离贴壁细胞，计数后分装为每份5–10 × 10⁶个细胞。对于悬浮生长的细胞，省略解离步骤。
  2. 将细胞悬液在约 800 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。 含有培养基的上清液。
  3. 将沉淀物用1 ml冰浴的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）pH 8.5重悬，进行洗涤。 800 × g 离心 4°C 2 分钟。
  4. 移除 上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 µl 冰冻标记缓冲液（HBSS，pH 8.5，1 M 尿素）
  5. 在冰上避光条件下，用 600 pmol CyDye DIGE Fluor 最小染料标记完整细胞 20 分钟。
  6. 通过加入终止反应 20 µl 10 mM 赖氨酸。孵育 10 分钟。
  7. 将表面标记的细胞重悬于溶液中，洗涤两次 500 µl HBSS pH 7.4， 随后在800 × g条件下离心 4°C 2分钟。

细胞裂解与组分分离

  1. 裂解表面标记的细胞 150 μl 冷裂解缓冲液（7 M 尿素，2 M 硫脲，4% CHAPS，30 mM Tris，5 mM 醋酸镁，pH 8.5）。置于冰上至少1 h，期间偶尔涡旋混匀。
  2. 在 10 000 × g 条件下离心裂解液 4°C 5分钟。转移 将上清液转移至新管中。此样品为未分级样品，含有全部细胞蛋白。
  3. 同时，洗涤 细胞沉淀物按上述方法处理后，在进行二维凝胶电泳前，使用膜蛋白分离试剂盒（Pierce）分离为膜组分和胞质组分。膜组分包含细胞内膜及细胞表面膜蛋白。
  4. 作为对照，遵循标准的 Ettan DIGE 操作流程 3，裂解、标记，最后分离细胞。使用2-D Quant试剂盒（GE Healthcare）测定样品中的蛋白浓度。

二维电泳

  1. 使用 Immobiline DryStrip Reswelling 托盘（24 cm），在 450 µl 去垢再水化溶液（0.5% IPG 缓冲液）中，于 pH 3–11NL（24 cm）的 Immobiline DryStrip 胶条上进行过夜再水化。
  2. 通过多通道装置的阳极杯上样方式，将 CyDye 标记的样品（相当于 50 µg 总蛋白）加样至 Immobiline DryStrip 胶条上，并按照说明书使用 Ettan IPGphor II 等电聚焦系统进行等电聚焦（IEF）。
  3. IEF 完成后，将胶条分两步平衡，并置于大型（26 x 20 cm）12.5% 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上方，用含溴酚蓝的电泳缓冲液配制的 0.5% 琼脂糖覆盖，然后使用 Ettan DALTtwelve 大型垂直电泳系统进行二维电泳：先以每胶 5 W 电泳 30 分钟，随后调至每胶 15 W，直至染料前沿迁移至凝胶底部。

成像与数据分析

  1. 完成二维电泳后，使用 Typhoon 9410 多功能成像仪扫描凝胶中的 Cy2、Cy3 或 Cy5 荧光信号。
  2. 利用 DeCyder 2-D 差异分析软件4，比较膜组分、胞质组分及未分馏样品的蛋白点图谱 。

染色后处理

  1. 成像后，按照标准程序对凝胶进行银染5。

蛋白质鉴定

  1. 按照前述方法培养、收获、洗涤并裂解制备量的细胞（约 1 mg 总蛋白，来自 10 × 10⁶ 个 CHO 细胞）。使用 一个 Cy5 标记的细胞表面蛋白样品（见上文）作为内标，与未标记的制备量蛋白样品共同上样。
  2. 按照前述方法进行二维电泳，但此次通过阳极杯上样法共同上样 600 µg 未标记细胞裂解液和 50 µg 标记了细胞表面蛋白的内标。使用参考标记物以确保正确挑选蛋白点，并根据推荐方法 3 在灌胶前置于玻璃板之间。
  3. 在 Cy5 通道扫描凝胶以获得细胞表面蛋白的 Cy5 蛋白点图谱，随后使用 Deep Purple 全蛋白染色剂对凝胶进行总蛋白染色 3。
  4. 使用 DeCyder 2-D 软件将两个蛋白点图谱进行匹配，并为所有对应于 Cy5 标记细胞表面蛋白的蛋白点生成挑点列表。利用 Ettan 蛋白点处理系统挑取细胞表面蛋白，从凝胶胶粒中提取蛋白，并使用 Ettan 酶解仪进行胰蛋白酶消化，最后通过 MALDI-TOF 质谱技术进行鉴定。

表1. 使用按照图1中细胞表面蛋白标记方案标记的无血清培养细胞样品进行Ettan DIGE实验。

样品血清耗尽时间使用 CyDye 标记胶 编号
1-Cy 3, Cy 21
230 分钟Cy 5, Cy 21
32 小时Cy 3, Cy 22
44 小时Cy 5, Cy 22
516 小时Cy 5, Cy 23

 

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讨论

蛋白质浓度

两种标记流程的概述如图1所示。由于按照细胞表面蛋白标记方案进行标记时细胞仍保持完整，因此只有细胞表面蛋白会接触到染料。而在标准Ettan DIGE方案中，细胞在标记前已被裂解，因此细胞内和细胞外的蛋白均会被标记（图1）。在细胞表面蛋白标记方案中，染料与蛋白的相对比例未知，因为无法对细胞表面蛋白进行特异性定量。然而，已知细胞表面蛋白仅占细胞总蛋白的极小部分2。本实验中使用了约5–10×106个细胞与600 pmol染料。由于本研究中仅使用了未分级样品的12.5–25%进行二维电泳，因此可能可以使用更少的细胞数量。

细胞表面蛋白标记、二维差异凝胶电泳示意图、方案比较、分馏样品分析。

图1....

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致谢

感谢奥地利维也纳大学临床病理学研究所的 Dontscho Kerjaschki 教授、Corina Mayrhofer 和 Sigurd Krieger 与我们的合作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CyDye DIGE 试剂盒，2 nmol试剂GE Healthcare28-9345-30
2-D Quant 试剂盒试剂GE Healthcare80-6484-51
IPG 缓冲液 pH 3-11NL试剂GE Healthcare17-6004-40
Immobiline DryStrip 干胶条 pH 3-11NL，24 cm试剂GE Healthcare17-6003-77
IPGbox工具GE Healthcare28-9334-65
IPGbox 试剂盒工具GE Healthcare28-9334-92
DeStreak 水化溶液试剂GE Healthcare17-6003-19
Immobiline DryStrip 覆盖液试剂GE Healthcare17-1335-01
Ettan IPGphor 3 等电聚焦仪仪器GE Healthcare11-0033-64
Ettan IPGphor 多通道进样装置仪器组件GE Healthcare80-6498-38
Ettan DALTtwelve 凝胶灌注器工具GE Healthcare80-6467-22
Ettan DALTtwelve 分离单元及电源/控制单元仪器GE Healthcare80-6466-46230 V 单元：80-6466-27
Typhoon 9410 多功能成像仪仪器GE Healthcare63-0055-81
Ettan 斑点挑取仪仪器GE Healthcare18-1145-28
Ettan 消化仪仪器GE Healthcare18-1142-68
Ettan 点样仪仪器GE Healthcare18-1142-67
Ettan MALDI-TOF仪器GE Healthcare18-1142-33
DeCyder 二维差异分析软件其他GE Healthcare28-4012-01
ImageQuant 分析软件其他GE Healthcare28-9236-62
尿素试剂GE Healthcare17-1319-01
CHAPS试剂GE Healthcare17-1314-01
PlusOne 二硫苏糖醇（DTT）试剂GE Healthcare17-1318-01
溴酚蓝试剂GE Healthcare17-1329-01
Tris试剂GE Healthcare17-1321-01
十二烷基硫酸钠（SDS）试剂GE Healthcare17-1313-01
PlusOne 87% 甘油试剂GE Healthcare17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C试剂GE Healthcare17-1310-01
PlusOne TEMED试剂GE Healthcare17-1312-01
PlusOne 过硫酸铵试剂GE Healthcare17-1311-01
PlusOne 甘氨酸试剂GE Healthcare17-1323-01
膜蛋白 2-D 样品制备试剂试剂Pierce, Thermo Scientific89864
硫酸链霉素试剂Invitrogen15140-122

参考文献

  1. Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
  2. Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
  3. Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
  4. DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
  5. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
  6. CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
  7. Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
  8. Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).

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