非放射性 原位 适用于挪威云杉及多种植物物种的杂交实验方案
2009年4月17日
我们描述了一种改良的 DIG 原位 杂交实验方案，快速且适用于多种植物物种，包括挪威云杉。只需进行少量调整，如改变RNase处理和蛋白酶K浓度，该方案即可用于不同组织和物种的研究。
适用于挪威云杉及多种植物物种的非放射性原位杂交实验方案。Carre 等。大家好，我叫 AM GaN，我们在瑞典乌普萨拉的乌普萨拉大学和瑞典农业大学工作。
我们已建立了一种适用于多种不同植物物种的原位杂交检测方案。今天，我们将向您展示其中一些关键步骤。在本方案中，我们将演示包埋、切片以及实际进行原位杂交实验的各个步骤。
进入实验室一，进行方案中的固定与包埋步骤九至十一。步骤九：将培养皿和模具在60摄氏度下预热。步骤十：加热一对镊子，并将组织均匀分布于培养皿中。
添加更多组织学石蜡，使组织完全覆盖。步骤11：在室温下让石蜡凝固。本方案中第12至19步为两个性别的操作步骤。
打开加热板，准备好熔化的组织石蜡。从冷房中取出样品。步骤13：使用解剖刀小心地切割出一块含有组织的石蜡块。
塑形样品以方便切片。第14步，将组织块冷却后加热足部，使其融合在一起。让样品在4摄氏度下凝固。
第15步，将石蜡块切成六到八微米厚的切片。使用切片机可得到连成一条长带的切片。将切片带剪断并转移至纸上。
此时可在体视显微镜下检查各个切片，以选择感兴趣的区域。使用组织或伊红染色的切片进行检查较为简便。第17步：将无RNA酶的Milli-Q水滴加到载玻片上。
将胶带切成小片并放置在载玻片上。将载玻片移至加热板上。步骤17：在42摄氏度的加热板上放置1至2分钟，使胶带展平。
使用Kim油排干水分。第19步：将载玻片在42摄氏度下孵育过夜，以使组织牢固附着于载玻片上，用于原位杂交4.1原位部分。预处理步骤见方案中的第36至48步。
第36步 组织切片在组织学层中的脱蜡。将切片均匀放置于染色架中，以便在不同容器间转移并进行切片脱水。在乙醇系列溶液中，边剧烈搅拌边加入冰醋酸酐。
第45步，准备进行乙酸酐处理4.2原位杂交。方案中的第49至52步。第51步，pro one plus载玻片的老化。
该溶液具有黏性，尽量避免产生气泡。将载玻片置于湿盒中孵育。
4.3 初始。杂交后，进行方案中的第53至72步。第62步，在塑料容器中用burer封闭液孵育载玻片。
第63步，加入足量封闭液以完全覆盖玻片。使用孵育法将抗体加至玻片上。孵育法仅适用于Prob Bon Plus玻片。对于结构相似的玻片，第65步，利用毛细作用使抗地高辛抗体溶液上升。
重复此步骤。与之前一样，在第70步吸取Western blue溶液。注意，Western blue溶液被吸取两次，正如我们对anti dig抗体溶液所做的那样。
第65步和第71步：将载玻片在避光条件下孵育1至5天。在室温下，可在体视显微镜下监测杂交信号。当载玻片仍处于夹心状态时，应可观察到紫色至棕褐色的染色。
这是CW站实验中实际得到的结果。您可以看到此处的信号呈现为紫色或棕褐色染色。
概述
本文介绍了一种改良的DIG原位杂交实验方案，该方法高效且适用于多种植物物种，包括挪威云杉。本方案通过特定优化，如调整RNase处理步骤和蛋白酶K的浓度，增强了其在不同组织和物种中的适用性。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 分子生物学
- 原位杂交技术
背景
- 原位杂交是一种研究组织中基因表达的有价值技术。
- 传统方法可能耗时较长且具有物种特异性。
- 对现有实验方案进行改进可提高其效率和通用性。
- 本研究聚焦于一种适用于多种植物物种的实验方案。
研究目的
- 开发一种更快且更具适应性的原位杂交实验方案。
- 展示该方案在挪威云杉及其他植物物种中的适用性。
- 为研究人员提供详细的实验操作步骤。
使用的方法
- 植物组织的包埋与切片。
- 原位分析的预处理及杂交步骤。
- 使用特定试剂和条件以优化结果。
- 在显微镜下监测杂交信号。
主要结果
- 改进后的方案成功实现了多种植物物种的原位杂交。
- 核糖核酸酶处理和蛋白酶K浓度的调整提高了组织兼容性。
- 实现了杂交信号的清晰可视化。
- 该方案在多种应用中具有高效性和可重复性。
结论
- 改良的DIG原位杂交实验方案是植物研究中一种有价值的工具。
- 该方法可实现对多种植物组织中基因表达的快速而有效的分析。
- 未来的研究可在此实验方案基础上拓展其在植物生物学中的更广泛应用。
常见问题
行业重要性概述
本方案可在植物体系中实现高分辨率的空间基因表达分析，通过确认组织特异性表达模式，支持早期发现阶段的靶点验证。该方法减少了对放射性同位素和大量物种特异性优化的依赖，提高了跨物种比较研究的可重复性和可扩展性。该技术为基于植物的生物制药流程中的表型筛选和转化生物标志物发现提供了机制层面的风险降低价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过确认组织特异性的 mRNA 定位，验证治疗假设，并阐明生殖发育通路中基因的功能。
- 操作价值：通过直接可视化裸子植物和被子植物模型中雄性生殖器官的基因表达，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过展示拟南芥、油菜和挪威云杉花部结构中同源基因（如 AP3 同源基因）保守的表达模式，提升预测的可信度。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：制备标准化的组织切片，用于后续杂交检测，可使用地高辛标记的探针实现一致的信号检测。
- 可重复性：省去RNase处理步骤，并调整蛋白酶K浓度，以增强信号强度并减少不同物种间的实验变异性。
- 可扩展性：适用于多种植物物种的高通量分析，仅需极少的实验方案调整，便于在比较基因组学研究中重复使用该技术平台。
转化与临床前研究
- 转化连续性：展示了从模式被子植物到裸子植物的适用性，支持将研究结果外推至与生物量和生物聚合物生产相关的木本多年生系统。
- 机制去风险化：通过将序列同源性与保守发育结构中的空间表达关联，降低基因功能注释的不确定性。
- 生物标志物对齐：实现基因表达与生殖组织中表型性状的空间关联，支持植物分子农业中生物标志物的发现。
流程与工作流整合
该方法适用于发现生物学阶段，可在基于植物的表达系统中进行先导化合物筛选之前，实现以假设为驱动的靶点鉴定。
- 发现生物学：通过验证候选基因在特定组织和发育阶段的空间表达，支持假设检验。
- 筛选：生成可量化的空间读数，用于指导在转基因或经处理组织中监测化合物效应的实验设计。
- 分析：产生可检测的显色信号（紫色至棕褐色），适用于成像及不同实验条件间的比较分析。
- 转化研究：将基因表达模式与生殖器官的发育表型关联，支持性状验证流程中的研发推进决策。
- 企业级复用：建立标准化且可灵活调整的工作流程，用于跨物种基因表达分析，减少重复优化工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接、具有空间分辨率的 mRNA 检测，无需使用放射性物质，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过省去RNase处理步骤并标准化蛋白酶K的使用，增强实验可重复性，降低实验方案失败率。
- 战略价值：在发现早期提供明确的表达数据，加速靶点筛选中的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于跨物种保守的表达模式，实现对靶点的风险调整优先级排序，提高后续应用的成功率。
实施注意事项
- 需要具备植物材料组织学、组织包埋和切片方面的专业知识。
- 依赖于切片机、杂交炉和显色检测系统的可用性。
- 需根据组织密度和酚类物质含量对蛋白酶K的浓度进行标准化。
- 针对不同物种和探针长度，需调整孵育时间和温度。
- 在木质化程度较高或富含次生代谢物的样品中，受限于组织自发荧光和试剂渗透能力。
