在芽殖酵母中的自我复制寿命测量
2009年6月25日
在这篇文章中，我们提出了一个用于测量酵母母细胞的复制寿命一般协议。
出芽酵母 Croce Visi 已被广泛用于研究衰老的生物学。在本文中，我们提出了一种测量酵母母细胞复制寿命的通用方案。大家好，我是来自华盛顿大学生物化学系 Brian Kennedy 实验室的 Kristen Steffen。
今天，我们将向您展示一种测量酵母母细胞复制寿命的程序。我们在实验室中使用该程序来研究影响酵母细胞寿命的基因。那么让我们开始吧。
对于复制寿命实验和制备用于寿命分析的酵母细胞，需要准备固体 YEPD 板来执行此作。使用适当的无菌技术制备这些 YEPD 琼脂平板。在寿命实验中，每四到五个要分析的菌株至少准备两个板。
这些板应在寿命测定前至少两天准备好，并在开始寿命测定前晾干。如果在倒入板后 4 到 5 天内不进行实验，则应将其包裹在对开膜或塑料中，并放入冷藏培养箱中以防止干燥。从冷冻原液中去除酵母菌株，并为单个菌落划线。
到 YEPD 琼脂平板上。通过将板分成大小相等的饼形楔形，可以轻松地在同一 YEPD 板上划线多达六个菌株。将细胞在 30 摄氏度下孵育两天。
孵育后，从培养箱中取出细胞，并将单个集落中的细胞贴在新的 YEPD 板上。此时，应对要分析的菌株进行涂层，以确保复制寿命实验是盲法进行的。解剖者不知道单个菌株的身份。链。
接下来，将修补的包被细胞在 30 摄氏度下孵育至第二天晚上。去除细胞，将每个包被菌株中的细胞轻轻修补到新鲜的 YEPD 板上。这些将用作用于复制寿命的实验板。
分析单元应沿 YEPD 板左侧的垂直线修补。不要将太多细胞转移到单个新鲜的 YEPD 板上。由于这会导致细胞在过夜孵育期间增厚并影响其复制寿命，因此每个板大约三到五个补丁是最佳的。
假设将对每个贴片的 20 个细胞进行复制寿命分析，现在寿命实验已全部设置完毕，他们所要做的就是在工作台上孵育过夜。然后明天我们可以开始显微解剖，将酵母细胞定位在板上并获得原始子细胞。用于复制寿命分析。
使用配备有适用于酵母的显微解剖装置的显微镜。将大约 50 个细胞从第一个贴片菌株转移到板上贴片细胞远端的位置。如果您的显微镜载物台是分级的，则可以使用这些分级来确保在后续迭代中易于找到细胞。
有时细胞会卡在针头中，如果它们在错误的时间出来，这可能是个问题。为确保针头干净且无细胞，请反复将其触摸琼脂表面。然后通过迫使针头穿过琼脂表面，在琼脂上打一个孔。
这个孔将作为一个标记，在随后的解剖和 dotter 细胞去除迭代中将您在板上定向。小心不要让酵母细胞进入孔中，否则它们会在孔的正上方生长并形成菌落。将单个酵母细胞垂直排列成 20 个均匀分布的位置，每个细胞位置之间有 1 到 3 个针直径。
对于每几个单元格，将两个单元格并排放置在行中的相同位置，而不是一个单元格。这允许在原始子细胞选择期间进行冗余。如果转移的细胞之一未能在线的第 10 和第 11 个位置之间分裂，则在琼脂上创建一个由 7 到 8 个孔组成的水平系列。
这将作为一个标记，在随后的解剖和子细胞去除过程中引导您在板上的方向。同样，要小心不要让酵母细胞进入孔中，否则它们会生长并形成菌落。对板上的每个补丁重复此过程，继续沿同一轴垂直排列细胞。
请务必记住，在 AER 中创建孔时，要使创建的孔数与色块编号相对应，以便第一个色块有一个孔，第二个色块有两个孔。将每个贴片的细胞排列好后，将板套平并在 30 摄氏度下孵育约两个小时。请记住，从这一点开始，除进行解剖时外，所有板都应进行段膜拍摄。
为了防止干燥，请对每个板重复此过程。在实验中。对于寿命分析，重要的是要确保每个细胞都从原始子细胞开始。
为此，首先从培养箱中取出板，并验证大多数阵列细胞是否已经进行了细胞分裂。所以我们这里有一些细胞之前已经对齐，你可以看到，在培养箱中两个小时后，它们已经开始分裂。现在我们有一个母细胞，较大的一个附着在它的身体上，处女子细胞，而这个处女子细胞是一个将用于开始寿命的细胞。
如果需要更多时间来完成细胞分裂，请将板放回培养箱中。从第一个数组单元格开始。通过将针头轻轻地放在附着细胞的顶部，使用针头将子细胞从母细胞中分离出来。
当针头放在细胞上时，轻敲显微镜底座的侧面有时会有所帮助。接下来，将分离的子单元放在单元格的垂直行中，替换母单元和任何其他子单元，并将它们暂时移到一边。对每个数组单元重复这些步骤。
如果细胞无法分裂，则从位于测试细胞旁边的冗余细胞之一中取出一个子细胞。完成后，您应该在寿命板上垂直对齐的每个贴片有 20 个子细胞。将所有母细胞和额外的子细胞收集成一堆，并将它们转移回补丁附近的区域，称为墓地。
重要的是将不需要的细胞远离正在进行寿命分析的细胞，以防止形成微集落和消耗局部营养物质。分离细胞后，将板放在板中并在 30 摄氏度下孵育约两个小时。对实验中的每个板重复这些步骤。
要测量单个细胞的复制能力，您需要准备寿命数据表。寿命数据表可以是一个简单的网格，其中每行对应于一个单独的母细胞，每列对应于一个年龄点。请务必根据要分析的菌株数量标记每个数据表。
首先，从培养箱中取出板，并验证大多数阵列细胞是否至少经历了一次细胞分裂。如果需要更多时间来完成细胞分裂，请将板放回培养箱中。从第一板上的第一个阵列细胞开始，目视观察母细胞和子细胞，细胞或细胞，以确定已发生的细胞分裂次数。
通常很容易根据细胞排列的特征模式确定母亲产生了多少个子细胞。这个细胞很容易看到它产生了多少个细胞，因为那里有两个细胞，它们的大小相同，而且都比母细胞小。在寿命评分表的相应框中记录母细胞产生的子细胞数。
接下来，如前所述，使用针头将子细胞从母细胞中分离出来，方法是轻轻地将针头放在附着的细胞顶部，并在针头放在细胞上时敲击显微镜底座的侧面。将母细胞保持在垂直线上的位置，并将一个或多个子细胞暂时移到一边。对每个数组单元重复这些步骤。
最后，收集所有丢弃的子细胞并将它们移动到位于原始补丁附近的墓地。对板进行封口膜，并在 30 摄氏度下孵育 2 到 3 小时。重复丢弃子细胞和孵育。
实验中每个板的步骤。重复整个过程，直到所有母细胞停止分裂。请记住，随着母细胞的老化，细胞周期进程会变慢，之后最好在两个年龄点之间孵育更长的时间，可以将板在 4 摄氏度下放置过夜。
复制寿命实验产生的原始数据是对应于每个母细胞在每个年龄点产生的子细胞的数字列表。如图所示。通过将评分表的每一行相加，获得每个母细胞的复制寿命。
来自同一实验组的其他细胞的数据可以合并以生成存活曲线并进行统计计算。该曲线应与 Gomperts Mac am 动力学大致一致，呈 S 形，早期死亡率低，随后存活率相对较快下降，并在晚年曲线趋于平缓。我们刚刚向您展示了如何进行酵母复制寿命实验。
执行此程序时，重要的是要记住，只要细胞不在寒冷中，它们就会继续分裂。因此，请记住将板在 4 度下过夜，这样早上就不会有太多的子细胞来计数。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文介绍了一种测量酵母母细胞复制寿命的通用协议，这是研究衰老的一个关键模型。该程序用于研究影响酵母细胞寿命的基因。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 衰老研究
- 酵母模型生物
背景
- 芽殖酵母是衰老研究中广泛使用的模型。
- 了解复制寿命可以提供对细胞衰老机制的洞察。
- 酵母母细胞经历不对称分裂，使其成为寿命研究的理想对象。
- 该领域的研究可以为更广泛的生物衰老过程提供信息。
研究目的
- 建立测量酵母母细胞寿命的可靠协议。
- 探索可能影响酵母细胞寿命的遗传因素。
- 为理解真核生物衰老做出贡献。
使用的方法
- 分离酵母母细胞以测量寿命。
- 跟踪细胞分裂和随时间变化的活力。
- 分析基因对寿命的影响。
- 利用显微镜和细胞计数技术。
主要结果
- 该协议允许一致地测量酵母母细胞寿命。
- 研究结果表明特定基因可能影响寿命。
- 结果有助于更广泛地理解衰老机制。
- 证明了酵母作为衰老研究模型的实用性。
结论
- 建立的协议对酵母寿命研究有效。
- 遗传因素在决定寿命方面起着重要作用。
- 这项研究增强了对简单生物衰老的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring replicative life span in budding yeast provides a genetically tractable system for interrogating conserved aging mechanisms relevant to mitotically active cells in higher eukaryotes. This assay enables target validation and mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to quantifiable cellular aging phenotypes. The method supports early discovery workflows by generating reproducible, quantitative data for pathway analysis and lead identification in aging-related therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic determinants of cellular aging through direct measurement of daughter cell production by mother cells.
- Operational Value: Provides a blinded, standardized workflow for tracking replicative capacity across strains using manual micromanipulation and microscopy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, age-resolved data suitable for survival curve construction and statistical analysis of lifespan distributions.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined patching, arraying, and daughter cell removal procedures to ensure reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system for studying conserved longevity pathways identified in yeast that translate to worms, flies, and mice.
- Operational Value: Facilitates preclinical model continuity by providing a mitotic aging paradigm complementary to chronological life span assays.
Pipeline & Workflow Integration
The replicative life span assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for aging pathways with cross-species conservation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking gene function to changes in mitotic aging output.
- Screening: Enables reliable compound or genetic perturbation evaluation through quantifiable daughter cell counts per mother cell.
- Analytics: Produces count-based readouts that allow pooling and survival curve generation for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via conserved aging mechanisms observed in multicellular eukaryotes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal aging studies across multiple genetic backgrounds or treatment conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in aging pathway analysis.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cell preparation, virgin daughter cell isolation, and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, genetically linked aging phenotypes for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on conserved longevity modifiers identified in yeast.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast microscopy and manual micromanipulation for precise cell handling.
- Depends on sterile technique and controlled incubation to prevent contamination and desiccation during multi-week assays.
- Necessitates standardized data sheets and blinded strain labeling to ensure objective lifespan measurement.
- Involves adaptation considerations when scaling patch density or modifying array geometry for different strain behaviors.
- Includes practical limitations such as the need for frequent monitoring due to variable cell cycle progression in aging mother cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:26
Introduction
0:49
Prepare Strains and Plates for Replicative Life Span Analysis
3:35
Position Cells for Replicative Life Span Analysis
6:22
Obtain Virgin Daughter Cells for Life Span Analysis
8:37
Measuring the Replicative Capacity of Individual Cells
11:18
Representative Results
12:10
Conclusion
