基于分裂泛素的膜酵母双杂交（MYTH）系统：鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具

MYTH系统基于分裂泛素的概念，即泛素能够稳定地分裂为N端的UBI和C端的CUB两个部分，这两个部分可重新组装成一个完整的伪泛素分子。当使用野生型NUBI时，这种重组是自发进行的；但若引入ISIN13到甘氨酸的突变，产生称为NUBG的片段，则会显著降低其与CUB的亲和力，从而阻断伪泛素的形成。如果将NUBG和CUB分别与蛋白A和蛋白B融合，且A与B能够发生相互作用，则伪泛素分子便可再次形成。

在该技术中，整合膜蛋白诱饵与包含CUB片段连接人工转录因子的激活结构域相融合。当猎物蛋白与NUBG片段融合后，诱饵与猎物之间的相互作用可导致假泛素结构的重建，该结构可被细胞质中的去泛素化酶（图示为剪刀）识别。这些酶在CUB的C末端之后进行切割，释放转录因子，使其进入细胞核并激活报告系统，从而实现对发生BA-猎物相互作用的细胞进行选择性分离与鉴定。

大家好，我是来自多伦多大学分子遗传学与生物化学系Igor STAARs实验室的Janie Snyder。今天我将向大家演示一种用于膜蛋白双杂交（membrane use two hybrid，myth）的实验方法。我们实验室利用该方法研究整合膜蛋白之间的相互作用。现在让我们开始吧。

在进行膜分裂泛素酵母双杂交（MYTH）分析之前，需确认诱饵蛋白的N端和/或C端位于细胞质中。CUB-LexA-VP16标签必须连接至该蛋白的相应末端。由于负责转录因子释放的去泛素化酶位于细胞质中，若诱饵蛋白的拓扑结构未知，可构建分别在N端和C端标记的质粒，并结合即将描述的N-U-B-G-I对照实验，检测其中任一构建体是否适用于MYTH系统，从而判断特定末端是否位于细胞质侧。

接下来，确定两种主要的myth变体中哪一种适用于您的实验。对于内源性酵母蛋白，首选方法是整合型myth（immy）。在Imy Bates中，内源性蛋白被CUB-LexA-VP16标签标记，使其仍处于自身天然启动子的调控之下。

这一点具有优势，因为Bates的野生型表达水平有助于消除与蛋白质过表达相关的问题，例如对于非天然酵母蛋白会增加假阳性结果。可使用传统的MYTH或T-MYTH系统，其中将带有CU-B-LexA-VP16标签的诱饵蛋白通过质粒进行过表达。本实验方案将重点介绍T-MYTH，因为这种MYTH形式适用范围更广。除初始诱饵构建和所用培养基外，两种MYTH系统的操作基本相同。诱饵必须克隆至合适的载体中，以实现标签化和表达。

目前有多种T神话载体可供选择，例如BV四、p、a、BV四以及PCM BV四，这些载体可在分别由极强的TF一强A DH一以及弱CYC一启动子控制的条件下，实现C端标记的贝茨、贝特立方亮氨酸、VP 16的构建。一旦选定目标效应子，需使用限制性内切酶在质粒的相应限制性位点进行酶切消化。酶切应仅发生在CU B Lxe VP 16标签上游（用于C端标记）或下游（用于N端标记）紧邻标签的区域。

例如，当使用 PAM BV 载体时，SFI I 是理想的选择。质粒经酶切消化后，应于 -20 °C 保存，直至准备使用。下一步是设计用于扩增和克隆目的基因的引物。上游引物的 5′ 端必须与限制性酶切位点上游约 35 至 40 个核苷酸序列匹配，而其 3′ 端则必须与目标基因的前 18 至 20 个核苷酸序列匹配，该目标基因为编码 β2 微球蛋白受体的 DRB2 基因。

在本示例中，反向引物的5′端必须与限制性酶切位点下游约35至40个核苷酸的反向互补序列相匹配。反向引物的3′端需与目的基因最后18至20个核苷酸的反向互补序列匹配，但若如本示例所示，在C末端添加CU B LexA VP16标签，则需排除终止密码子。根据进行的是N端还是C端标记，需确保正向或反向引物所选用的35至40个核苷酸质粒序列，能使目的基因与CU B LexA VP16标签保持正确的阅读框进行克隆。在本示例中，ADRβ2蛋白的C末端将被标记。

在反向引物中选择的35个碱基的MBV序列，使得ADR B2和CUB基因序列位于相同的阅读框内，使用选定的引物通过PCR扩增目的基因。PCR反应参数将取决于所用的特定酶和引物，以提供适合发生缺口修复同源重组的环境。将先前经消化的质粒与扩增的目的基因采用标准的酵母转化方案（如Geets和Woods所述）转入合适的酵母菌株中。

待转化的酵母在平板上生长后，挑取该菌株的单个菌落，接种于5 mL缺乏亮氨酸的SD培养基中。将液体培养基在30 °C条件下振荡培养过夜，直至菌液达到饱和状态。在700 ×g条件下离心5分钟，收集菌体沉淀，弃去上清液，然后使用任意商业化的质粒小提试剂盒从菌体沉淀中分离 bait 质粒DNA。

按照标准方案进行操作，但需进行一项修改，以确保在初始重悬液中加入少量0.5毫摩尔的苏打石灰玻璃珠，使酵母细胞充分裂解。将玻璃珠加入沉淀后，剧烈涡旋振荡5分钟。随后按照商业试剂盒的常规步骤继续操作。将分离得到的酵母DNA转化至一种适合质粒扩增的化学感受态大肠杆菌（e coli）菌株中，转化效率需至少达到每微克DNA 1×10⁷个细胞。

在提取转化后的大肠杆菌的质粒DNA后，使用前需通过测序验证诱饵质粒构建的正确性。必须对诱饵菌株进行分析，以确保诱饵蛋白正确地定位于酵母细胞膜。定位情况通过荧光显微镜检测确定。在诱饵标签序列中包含一个YFP分子，可实现对活细胞的直接观察，该方法在iMY实验中被广泛使用。

或者，在确认诱饵蛋白正确定位后，可采用标准的免疫荧光方法，使用针对标签中 Lex A 或 VP16 组分的抗体进行检测。必须确保诱饵蛋白本身不具有自激活能力，即单独存在时或在不存在相互作用的猎物蛋白时均不能激活报告系统。为验证诱饵蛋白无自激活特性，我们采用 N-U-B-G-I 测试。在此测试中。

将诱饵分别与可相互作用的阳性对照和不可相互作用的阴性对照共转化，然后将每种转化子的不同稀释液点样于相应的选择性培养基上。诱饵必须在阳性对照存在时能在选择性培养基上生长，而在阴性对照存在时不能生长，方可适用于酵母双杂交实验（MYTH）。一旦诱饵得到验证，即可将含有该诱饵的MYTH报告菌株与感兴趣的猎物文库共转化，以筛选蛋白质-蛋白质相互作用。

首先，将含有诱饵质粒的酵母报告菌株单菌落接种于5毫升SD缺亮氨酸培养基中，30摄氏度振荡培养过夜。将过夜培养物按比例转接至200毫升SD缺亮氨酸培养基中，30摄氏度振荡培养至OD600达到0.6至0.7。当达到目标OD600时，将200毫升培养物均分至四个50毫升螺口离心管中，通过离心收集细胞。

用无菌的双蒸水和含锂盐的Tris-DTA溶液洗涤沉淀后，将每个沉淀重悬于600微升含锂盐的Tris-DTA溶液中，分别加入四个15毫升螺旋盖离心管。向每管中加入2.5毫升聚乙二醇（PEG）-醋酸锂溶液、600微升重悬细胞、100微升鲑鱼精DNA溶液和7微克猎物文库DNA。涡旋振荡管中混合物1分钟以确保充分混匀，随后在30°C水浴中孵育45分钟。

45分钟孵育后，每15分钟短暂混匀一次。向每根试管中加入160 µL二甲基亚砜（DMSO），并通过倒置试管立即混匀。在42 °C水浴中孵育20分钟。

热激完成后，通过离心收集细胞并重悬。将每个沉淀物悬浮于 3 毫升的 2×Y-PAD 培养基中。将所有样品合并至一个 50 毫升带螺口盖的离心管中。

将细胞在30摄氏度下孵育90分钟以恢复细胞活性。离心细胞，并将细胞沉淀重悬于4.9毫升无菌0.9%氯化钠溶液中，取100微升重悬细胞。用无菌0.9%氯化钠溶液进行10倍系列稀释，稀释范围从10倍至10,000倍，取100微升100倍和1000倍稀释液涂布于选择性培养基上，在30摄氏度下孵育两到三天。

这些平板作为对照，用于均等地计算转化效率。将剩余的 4.8 毫升重悬细胞分装并涂布到大型 150 毫米平板上，在 30°C 下培养三至四天。待菌落生长后，将单个菌落（每个菌落代表含有潜在相互作用的诱饵-猎物配对的细胞）重悬于 100 微升 0.9% 氯化钠溶液中，并取 5 微升等分试样涂布于含有 XG 的选择性培养基中，仅培养两至四天。

选择生长旺盛且呈蓝色的菌落进行进一步分析。从阳性酵母菌落中分离质粒并测序后，汇总并分析所有测序数据，以建立初步的互作蛋白列表。为验证这些相互作用，需进行诱饵依赖性检测。

在此实验中，将所有表达已鉴定互作蛋白的猎物质粒重新转化至原始诱饵菌株以及携带对照人工诱饵的菌株中，该人工诱饵由单一跨膜结构域与CUB Lex融合，并带有VP16标签。从这些转化产物中挑取单菌落，用100微升无菌双蒸水重悬，然后取5微升点样于相应的选择性培养基平板上，培养基中需添加X-sc。理想情况下，每种猎物应选取多个转化子，且原始诱饵和人工诱饵应点样在同一块平板上。将平板在30摄氏度下培养2至4天。若携带人工诱饵的酵母中，某种猎物导致报告系统被激活，则认为该猎物具有非特异性结合（泛化结合）特性，应将其从互作蛋白列表中剔除。

在含有目标诱饵但不含人工诱饵的酵母中，观察到促进生长并呈现蓝色的表型。由此确认存在特异性相互作用。然而，如果含有猎物蛋白和目标诱饵的酵母无法生长，

该猎物将从互作分子列表中移除。剩余的猎物构成神话筛选实验中鉴定出的全部互作分子列表。神话实验流程完成后，您将获得一张互作网络图谱。

这代表了一组候选的相互作用，研究人员必须根据具体情况进一步通过特定研究进行分析。为了评估每一个相互作用的生物学意义，我们刚刚向您展示了如何执行膜双杂交（membrane E two hybrid）或 MYTH 实验流程，以鉴定目标蛋白的相互作用伙伴。在进行 MYTH 实验时，重要的是要验证您的目标蛋白的N端和/或C端位于细胞质中，并据此设计相应的标记策略。

此外，必须仔细评估诱饵菌株是否正确表达诱饵蛋白，并确保该诱饵蛋白正确地定位于细胞内。同时，进行NUB GI对照实验也非常重要，因为这有助于建立合适的筛选条件。最后，务必通过膜酵母双杂交技术（myth）独立验证所检测到的所有相互作用。

遵循这些简单的步骤，应能确保您从myth实验流程中获得最佳结果。好了，就这些。感谢观看，祝您的实验顺利成功。