Name: N -连接糖链的糖蛋白在哺乳动物细胞中的脉冲大通分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解哺乳动物细胞中N-连接糖链的脉冲追踪分析方法，通过代谢标记、酶解释放和HPLC分离技术，动态监测糖蛋白糖链的时空变化规律，为糖生物学研究提供可靠的实验手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Zehavit Frenkel 和 Sandra Tolchinsky 提供的技术支持。本研究工作得到了以色列科学基金会（1229/07）和德以项目合作计划（DIP-DFG）资助项目的资助。

以下方案适用于分析总糖蛋白或特定目标糖蛋白的糖链。两种情况的基本步骤相同，仅在本方案所述的若干细节上有所调整。
<ol>
 <li> 用于N-连接聚糖的代谢标记时，每个样本需要使用在90 mm培养皿中过夜培养的亚融合状态哺乳动物细胞，每份样本可代表不同的时间点或处理条件。本方案已针对NIH 3T3细胞优化。 </li>
 <li> 通过在 5 ml 新鲜配制且预热的无葡萄糖培养基中孵育，使细胞处于葡萄糖饥饿状态37°C无葡萄糖培养基，补充10%透析胎牛血清和4 mM丙酮酸钠，孵育5-15分钟。 </li>
 <li> 将饥饿培养基更换为1 ml预热的（37°C无葡萄糖培养基 400 μCi [2-3H]-标记的甘露糖（较低浓度的 65 μCi/ml 用于标记总糖蛋白），并在正常的组织培养条件下孵育细胞1小时。 </li>
 <li> 从每个样本中移除标记培养基，并小心加入 2 ml PBS 4°C 对应脉冲的样品置于冰上（这些样品称为脉冲样品），而对应追踪的样品需要用2 ml预热的溶液冲洗3次37°C) 正常完全培养基中，然后置于 CO2 孵育箱于 37°C 用5 ml预热的常规培养基继续培养所需的时间。 </li>
 <li> 将脉冲样品（先前置于冰上）用2 ml预冷的PBS洗涤3次。然后用细胞刮匙在2 ml PBS中将细胞从培养皿上刮下，并转移至2 ml离心管中。 </li>
 <li> 在16000×g下短时离心（6–10秒），弃上清，将细胞沉淀在-80°C. </li>
 <li> 在追踪时间结束时，对追踪样本同样执行步骤5和步骤6。 </li>
 <li> 从冻存管中取出细胞，加入裂解液进行裂解 300 μl 加入缓冲液A，短暂涡旋后冰上孵育20分钟；若进行总糖蛋白分析，则在冰上用缓冲液B孵育20分钟，随后超声处理（4次，每次10秒，最大振幅），然后将样品煮沸5分钟。 </li>
 <li> 将裂解液在 16000×g 离心 20 分钟，温度为 4°C将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。 </li>
 <li> 若分析总糖蛋白，则进行分子过滤和去糖基化（步骤17）。若进行本实验所示的H2a糖蛋白免疫沉淀，每样品加入20 μl (Repligen)蛋白A-琼脂糖珠1:1悬浮液，并 3 μl/samp将我们所需的兔多克隆抗H2a抗体（以抗-H2a抗体为例）加入到第9步的上清液中。 </li>
 <li> 将样品在4-16小时内孵育 4°C，通过缓慢旋转持续混合。 </li>
 <li> 在16000×g离心30秒使磁珠沉淀，小心使用真空抽吸去除上清液。 </li>
 <li> 洗涤珠子，通过加入 500 μl 缓冲液D中涡旋振荡。按步骤12离心并弃去上清液。重复洗涤3次。 </li>
 <li> 添加 10μl 将变性缓冲液（随NEB内切-H试剂盒提供）加入到珠粒沉淀中，5分钟（当分析总蛋白时，去糖基化步骤在Microcon滤膜上进行，见步骤17）。 </li>
 <li> 离心珠子（16000×g，30秒），将上清液转移至新的Eppendorf管中。然后 0.5μl 加入endo H酶到每个样品中，同时 10 μl 反应缓冲液（随NEB内切H试剂盒提供）中，并将样品在指定温度下孵育 37°C 3小时。 </li>
 <li> 为将释放的糖链与蛋白质分离，将样品用去离子水稀释5倍后，置于截留分子量为30 kDa的分子滤膜（Microcon Ultracel YM30）上，于14000×g离心3分钟。 50μl 加入去离子水并重复样品离心。此洗涤步骤再重复2次，保留流穿液。 </li>
 <li> 如果分析总糖蛋白，将裂解液的上清液（来自步骤9）加入Microcon滤膜中。用提取缓冲液洗涤样品 100 μl 缓冲液E，通过重复离心（14000×g，3分钟）洗涤3次。加入 3 μl 10X 内切糖苷酶 H 反应缓冲液 1.5 μl 将内切糖苷酶H（endo H）加入Microcon超滤管的截留液中，37℃孵育3小时 37°C释放的糖链通过去离子水洗脱，重复离心3次，步骤同第16步。 </li>
 <li> 如需要，将步骤16和17的截留物（含有内切H酶抗性糖蛋白）与200 mU的N-糖苷酶F共同孵育 15 μl 缓冲液C中，于 37°C 孵育16小时。用去离子水洗脱，步骤同第16步。 </li>
 <li> 将含有内切糖苷酶H反应穿流液的离心管（步骤16和17）置于真空浓缩仪中，彻底干燥样品（此步骤可进行至 45°C 以加速此过程）。 </li>
 <li> 为进行高效液相色谱分析，将干燥的沉淀物重新悬浮于 12 μl HPLC溶剂（乙腈:水, 60:40, 1%磷酸） </li>
 <li> 将高效液相色谱仪（连接Spherisorb色谱柱）调节至溶剂流速恒定（1 ml/min）和压力恒定（1000至2000 psi之间的特定值），并放置馏分收集器，每1分钟更换一次收集管。 </li>
 <li> 将样品注入高效液相色谱仪，并同时启动组分收集器。 </li>
 <li> 从每次样品运行以及标准寡糖混合物的运行中，各收集48个1 ml的组分。 </li>
 <li> 转移 500 μl 将每份组分转移至闪烁瓶中，加入3 ml可与水混溶的闪烁液，混匀内容物。 </li>
 <li> 将小瓶装入并用闪烁计数器读数。 </li>
 <li> cpm 读数作为组分数的函数进行绘图。 </li>
 <li> 峰内的每分钟计数（cpm）值代表特定的糖链种类：第18-21组分对应M5，第22-26组分对应M6，第27-31组分对应M7，第32-35组分对应M8，第36-39组分对应M9，第40-42组分对应G1M9，第43-45组分对应G2M9。 </li>
 <li>每个峰内各组分的cpm值之和反映了特定糖链种类的绝对量。为了校正含有较多甘露糖残基的糖链会结合更多标记物这一因素，需计算每种糖链种类的“相对摩尔量”：将每种糖链种类的绝对量除以其所含的甘露糖残基数。随后，将该值除以所有糖链种类的相对摩尔量之和，从而得到每种特定糖链种类的“占总量百分比”。</li>
</ol> 
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="text-align:center;">脉冲追踪时间（小时）</td>
 <td style="text-align:center;">0</td>
 <td style="text-align:center;">4</td>
		</tr>
		<tr>
 <td>经内切糖苷酶H释放的放射活性（cpm）a</td>
 <td>90000</td>
 <td>16800</td>
		</tr>
		<tr>
 <td>经N-糖苷酶F释放的放射活性（cpm）b</td>
 <td>20400</td>
 <td>3900</td>
		</tr>
		<tr>
 <td>截留液中的糖蛋白（cpm）c</td>
 <td>371700</td>
 <td>127695</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>截留液中的焦磷酸多萜-寡糖（cpm）d</td>
 <td>4350</td>
 <td>540</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>截留液中的焦磷酸多萜-寡糖（%）e</td>
 <td>1.4 ± 0.7</td>
 <td>0.2 ± 0.2</td>
 </tr>
	</tbody>
</table>
表1. 使用去糖基化酶分析糖蛋白样品中N-连接糖链的释放以及多萜醇-寡糖的存在情况。
我们将脉冲-追踪实验方法应用于NIH 3T3细胞的裂解液。经过Microcon过滤后，在脉冲标记阶段，标记的N-连接寡糖主要通过endo H释放（高甘露糖型）；而在追踪阶段进一步用N-糖苷酶F处理后释放的寡糖则对应于复杂型（高尔基体加工后的糖链），即对endo H具有抗性的寡糖。该定量分析结果表明，在初始截留物中，磷酸多萜醇-寡糖仅占标记物的极小部分。
注意事项：
<ol class="lalpha">
<li>采用[2-3H]甘露糖对NIH 3T3细胞进行脉冲标记，随后用完全培养基进行追踪。细胞裂解后，通过Microcon YM30滤膜过滤，截留物经内切糖苷酶H（endo H）孵育，释放高甘露糖型N-连接寡糖。</li>
<li>将(a)中Microcon滤膜截留物的endo H抗性物质进一步与N-糖苷酶F孵育，释放的寡糖通过液体闪烁计数器测定放射性。</li>
<li>在进行endo H处理前，按(a)法获得的Microcon滤膜截留物，用氯仿:甲醇:水（10:10:3）提取4次以去除前体糖脂，未被提取的残留物溶于1N NaOH中，并用液体闪烁计数器计数。</li>
<li>从(c)所得提取物中纯化出多萜醇-寡糖，纯化方法如步骤1所述，并通过液体闪烁计数器测定放射性。</li>
<li>三次实验的平均值，表示多萜醇-寡糖(d)的放射性占截留物总cpm(c+d)的百分比。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="脉冲-追踪实验图谱，显示经标记的M5-M9在色谱分析中的糖链峰。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 未经处理及蛋白酶体抑制条件下NIH 3T3细胞总糖蛋白的脉冲-追踪分析。 经[2-3H]标记1小时脉冲后，获得预期的图谱：部分带有葡萄糖的前体仍存在（Glc2Man9GlcNAc2（G2M9）和G1M9），但大部分标记信号出现在M9和M8组分中，后者是葡萄糖完全切除并去除一个甘露糖残基后的产物（图1 A）。未检测到游离甘露糖或其他小分子前体，表明纯化过程彻底。经过较长时间的8小时追踪后，甘露糖进一步修剪至M7-6，并出现少量M5，但主要组分仍为M9和M8（图1 B）。若在蛋白酶体抑制剂（30 μM MG-132）存在下进行追踪，则这些修剪后的组分仅有轻微累积（图1 C）。
<img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="ASGPR H2a 糖蛋白池分析；图表比较不同追踪时间；包含蛋白酶体抑制剂 MG-132。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 内质网相关降解（ERAD）底物与总糖蛋白的糖链定量分析。（A） 在与图 1 类似的实验中，根据甘露糖含量计算每种寡糖组分的相对摩尔量。我们将每种糖链组分测得的每分钟计数（cpm）值进行转换，然后将各组分占所有组分总相对摩尔量百分比随追踪时间的变化绘制成图，数据为两次实验的平均值。（B） 与（A）类似，但分析的是在脉冲标记后、追踪时间长达 4 小时的情况下，从 ERAD 底物 ASGPR H2a 释放的糖链，实验在有或无蛋白酶体抑制剂 MG-132 的条件下进行。（C） 比较（A）和（B）中在 MG-132 存在下 4 小时追踪时间点的 ASGPR H2a 与糖蛋白池的数据。（D） 内质网中 N-连接糖链修剪过程示意图。导致与蛋白质（R）相连的 M6-5 结构的糖链修剪过程促使蛋白靶向 ERAD，而 M9-8 结构的糖链则使蛋白转运至高尔基体及更远部位。结果表明，ERAD 过程与 N-糖链的甘露糖修剪相关，最终生成保留 5–6 个甘露糖残基的糖链组分。

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

利用高效液相色谱分离技术对活细胞中的糖链进行脉冲-追踪分析，为研究糖蛋白生命周期中寡糖结构变化的动态过程提供了一种方法。越来越多的证据表明，此类结构变化参与了内质网（ER）中蛋白质折叠、质量控制及运输系统信号的产生2-5。该方法不仅可用于特定目标糖蛋白的研究，也可用于分析总体糖蛋白结构的动态变化。本文即通过此方法比较了特定内质网相关降解（ERAD）底物与细胞内糖蛋白群体的不同命运。该纯化技术操作简便且具有高度特异性。通过使用特异性去糖酶和分子筛过滤，可确保仅获得由糖蛋白释放的N-连接型糖链，而其他被[2-3H]Man标记的大分子物质（如O-连接糖链和GPI锚定蛋白）则被有效去除。来自十一异戊二烯醇（dolichol）前体释放的寡糖仅造成可忽略的污染（表1）。
该方法仅需极少量起始材料即可实现高灵敏度检测。当预期产量极低时，可通过SpeedVac减少HPLC组分的体积，进一步提高检测灵敏度。因此，可克服闪烁液溶解度的限制，从而在闪烁计数器中对组分的全部内容进行监测。

<table><tbody><tr><td>600E 多溶剂输送系统控制器</td><td>沃特斯</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 LiChrosolv（液相色谱梯度级）</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K 或 Centricon Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 或 4208</td><td></td></tr><tr><td>浓缩仪 5301，含 48 × 1.5 / 2.0 ml 固定角转子</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>透析后的F&amp;#8211;胎牛血清</td><td>生物工业公司</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司品牌</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s Medium - 无葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐（Titriplex III）</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf 试剂盒（1,000,000 单位/毫升）</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;胎牛血清（FCS）</td><td>生物工业公司</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Frac-100 自动组分收集器</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 液体闪烁计数系统</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>甘露糖，D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]-（比活度：15-30 Ci/mmol）</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-羰基苄氧基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨酸醛（MG-132）</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-糖苷酶 F（1000 单位/毫升）</td><td>罗氏集团</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>正辛基葡萄糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 细胞</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>珀金埃尔默股份有限公司</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>磷酸溶液（49-51%，用于高效液相色谱）</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>蛋白A-Sepharose珠</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗H2羧基末端 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液（100 mM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spherisorb NH2 色谱柱，5 &amp;mu;m，4.6 × 250 mm</td><td>沃特斯</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-Cell 超声波处理器 VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;缓冲液A：&lt;/strong&gt; 1% Triton X-100，0.5% w/v 脱氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂混合物 2% v/v，溶于 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;缓冲液B：&lt;/strong&gt; 0.5% w/v SDS，蛋白酶抑制剂混合物 2% v/v，溶于 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;缓冲液 C：&lt;/strong&gt; N-糖苷酶F反应缓冲液：200 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 8.0，4 mM EDTA，1.5% 正辛基-β-D-葡萄糖苷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>稳定表达 H2a 的 NIH 3T3 细胞 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;缓冲液D：&lt;/strong&gt; 0.5% Triton X-100，0.25% w/v 脱氧胆酸钠，0.5% w/v SDS，蛋白酶抑制剂混合物 2% v/v，溶于 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;缓冲液 E:&lt;/strong&gt; 0.5% w/v SDS，1% v/v 2-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇，蛋白酶抑制剂混合物（2% v/v，溶于PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳动物细胞中糖蛋白n-连接糖链的脉冲-追踪分析

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Glc的连接3男性9GlcNAc2将前体寡糖链转移到内质网中新生多肽链上是分泌蛋白常见的修饰方式。尽管该修饰已知参与多种生物学过程，但其功能的其他方面也正在被揭示，最近的研究证据表明其在糖蛋白质量控制和转运信号产生中具有重要作用。因此，与N-连接聚糖及其加工相关的现象正受到深入研究。近年来开发的蛋白质组学分析方法已显著改善了对糖蛋白N-连接聚糖的表征。然而，这些方法无法揭示糖链加工过程的动力学信息。为此，通常采用标记和脉冲-追踪分析技术，但这些方法往往复杂且产量极低。本文介绍一种简单的方法，用于分离和分析代谢标记的N-连接寡糖链。该方案基于使用[2-3H]甘露糖，通过使用endo H和N-糖苷酶F依次处理，从特异性免疫沉淀的目标蛋白或总体糖蛋白池中，在变性裂解条件下释放寡糖，随后通过分子滤过（Amicon）进行纯化。在此方法中，分离得到的寡糖可作为HPLC分析的输入样品，从而可根据组成寡糖的单糖单元数量区分不同的糖链结构，分辨率达到单个单糖水平。利用该方法，我们能够在正常条件及蛋白酶体抑制条件下，研究脉冲-追踪实验后全细胞糖蛋白的高甘露糖型N-连接寡糖谱型。这些谱型还与从免疫沉淀获得的内质网相关降解（ERAD）底物中得到的谱型进行了比较。我们的结果表明，大多数NIH 3T3细胞的糖蛋白相对稳定，其大部分寡糖被修剪为Man9-8GlcNAc2. 相比之下，不稳定的ERAD底物被修剪为Man6-5GlcNAc2且当蛋白酶体降解受到抑制时，携带这些物种的糖蛋白会积聚。

我们描述了一种分析糖蛋白在哺乳动物细胞中生物合成后早期生命周期内N-连接聚糖变化的方法。该方法通过代谢标记聚糖的脉冲-追踪分析、从糖蛋白上酶法释放聚糖，并利用高效液相色谱（HPLC）进行检测。

哺乳动物细胞中糖蛋白N-连接糖链的脉冲-追踪分析

在内质网中，Glc3Man9GlcNAc2前体寡糖向新生多肽链的连接是分泌蛋白常见的修饰方式。尽管……

对糖蛋白上未连接的糖链进行分析，首先需要用氚标记的甘露糖对糖链和细胞进行标记。脉冲反应皿置于冰上冷却，而追踪反应皿则在无标记条件下孵育所需的追踪时间。随后，裂解样品并通过免疫纯化方法分离目标糖蛋白，使其变性，并通过酶解反应释放其糖链。通过分子过滤进一步纯化寡糖，将其与分子量大于30千道尔顿的蛋白质及其他污染物分离。随后通过高效液相色谱（HPLC）分离糖链。通过测定每种洗脱组分中放射性信号的强度，确定每种糖链形式的含量。大家好，我是来自特拉维夫大学细胞研究与免疫学系希拉尔多·莱特·克雷默（Hi Geraldo Letter Kremer）实验室的 Edward Azo。我同时也来自格拉尔多·莱特·克雷默（Gerardo Letter Kremer）课题组。今天我们将向您展示一种用于分离和分析代谢标记且连接的寡糖的实验方法。我们在实验室中采用此方法研究全细胞糖蛋白群体及单个糖蛋白的糖链加工动态。好的，现在我们开始。首先，使用在90毫米培养皿中过夜培养的NIH 3T3细胞。对于每个样品，将培养物稀释至亚汇合状态以使细胞处于葡萄糖饥饿状态，准备新鲜的两倍浓度无葡萄糖培养基，其中添加20%透析处理的胎牛血清（FCS）和8毫摩尔的丙酮酸钠；将所需体积的两倍浓度培养基与等体积的去离子水混合稀释。预热培养基，然后将每份细胞样品在5毫升新鲜预热的培养基中孵育5至15分钟。如果追踪时间超过12小时，则细胞操作应在无菌条件下进行。孵育结束后，标记对应脉冲和追踪样品的培养皿。为了通过免疫沉淀进行糖蛋白分析而标记N-聚糖，将饥饿培养基更换为1毫升预热的无葡萄糖培养基，其中添加400微居里/毫升的[3H]甘露糖。若需标记和分析总糖蛋白，则使用65微居里/毫升的[3H]甘露糖。更换饥饿培养基后，在正常的组织培养条件下将细胞孵育一小时。在一小时孵育结束时，从所有样品中移除标记培养基，小心向对应“脉冲”组的样品加入两毫升四摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS），并将其置于冰上。这些样品称为“脉冲”样品。使用 2 mL 预热的完全培养基。将追踪样本冲洗三次。然后向细胞中加入 5 mL 预热的常规培养基。将追踪样本置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中，孵育所需的追踪时间。在追踪样本孵育期间，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）在冰上清洗脉冲样本三次，每次两毫升。然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。在2 mL PBS中，将释放的细胞放入2 mL EOR管中。短暂离心，以16,000 ×g离心6至10秒，吸除上清液，并将细胞沉淀在-80°C下冷冻保存。当追踪样本的孵育结束后，冲洗样本。离心并按照上述脉冲样品的方法进行储存。准备进行细胞裂解时，从冷冻箱中取出细胞。对于免疫沉淀分析，通过加入300 µL裂解缓冲液裂解细胞。短暂涡旋，并在冰上孵育20分钟。用于总糖蛋白样品分析时，加入300微升缓冲液B。冰上孵育细胞20分钟，随后在最大振幅下超声处理四次，每次10秒。然后将样品煮沸5分钟。最后，在 4°C 条件下，将所有裂解液以 16,000 ×g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的 EOR 管中，并弃去沉淀。接下来进行免疫沉淀（IP），以检测目标蛋白；本实验中以 H2A 糖蛋白的免疫沉淀为例进行演示。向每份样品的蛋白中加入20 µL，加入A型agro珠，并向每份样品中加入3 µL实验室的兔多克隆抗H2A抗体至裂解细胞的上清液中。在4°C条件下孵育4至16小时，同时通过缓慢旋转持续混匀。孵育结束后，离心收集珠粒，用真空泵小心吸除上清液，并加入500 µL缓冲液T洗涤珠粒，重复洗涤4次。离心四次，使珠粒沉淀并去除上清液，以释放珠粒上结合的蛋白质。向珠粒沉淀物中加入10 µL内切糖苷酶H试剂盒中的变性缓冲液，将样品煮沸5分钟。再次离心使珠粒沉淀，将上清液转移至新的EOR管中。现在可以对ellu蛋白进行去糖基化处理。使用酶和OH从免疫沉淀（IP）样品和总蛋白样品中释放糖链。对于免疫沉淀样品，向每个样品中加入0.5微升endo H酶和10微升2×endo H反应缓冲液。将样品在37摄氏度下孵育3小时。对于总糖蛋白，将细胞裂解液的上清液加入截留分子量为30千道尔顿的MicroCon滤膜管中。用100微升缓冲液E通过反复在14,000 ×g条件下离心三次，洗涤总蛋白提取物。在滤膜管中加入3微升10×内切糖苷酶H反应缓冲液和1.5微升内切糖苷酶H酶，于37摄氏度孵育3小时，同时与免疫沉淀样品一同进行反应。三小时孵育结束后，用去离子水将免疫沉淀样品稀释五倍，置于新的MicroCon滤膜上，在14,000 G下离心三分钟。向免疫沉淀样品和总蛋白样品中各加入50微升去离子水，离心洗涤，重复此步骤两次。如需保留，可收集含有切割下来的糖链的滤过液，用于后续含有Endo H抗性糖蛋白的分析。随后将具有Endo H抗性的糖蛋白在37摄氏度条件下，与200毫单位的N-糖苷酶F在15微升缓冲液C中孵育16小时。使用去离子水进行洗脱，操作如上所述。使用带加热功能的真空浓缩仪，在不超过45摄氏度的条件下将样品完全干燥，以加速干燥过程。将干燥后的沉淀物重新悬浮于12微升HPLC溶剂中，并将样品加载至HPLC装置中安装的Sphero氨基柱上。按照随附的书面实验方案运行样品。每次样品运行收集48个组分。使用闪烁计数器测量所收集组分的每分钟计数（CPM）值，并将CPM读数对组分编号作图。按照随附的书面实验方案所述，计算所有糖链种类中甘露糖残基的百分比。以下是来自一小时脉冲标记样品的总糖蛋白糖链分析的代表性结果。HPLC 分数的 CPM 读数在所得图谱中以分数编号为函数进行绘制。每个峰代表通过已知糖链标准品的高效液相色谱（HPLC）运行所鉴定出的特定糖链种类。对于每种糖链种类，其占总糖链的摩尔百分比随追踪时间的变化被绘制出来。此处显示的时间是针对一种特定错误折叠糖蛋白的分析结果，该蛋白通过免疫沉淀法从经蛋白酶体抑制剂 MG132 处理的样品中分离得到。在追踪期间，剪切后的聚糖物种 M five six 会积累，由此得出结论：错误折叠蛋白上的寡糖在降解前会经历广泛的甘露糖剪切。这与经相同处理样品中总糖蛋白上的寡糖形成对比：在此情况下，在追踪期间 M nine eight 始终是主要的聚糖物种，而 M five six 仅略有增加。这表明仅有小部分总糖蛋白库被靶向至内质网相关蛋白降解途径。缩写 rad。如随附的书面实验方案中进一步所述，我们刚刚向您展示了如何在活细胞中联合使用palase和HPLC分析，以追踪糖蛋白生命周期中游离寡糖组成的动态变化。在进行此操作时，重要的是要避免在“chase”样品中混入放射性物质的痕量污染，否则在“chase”期间以及尺寸分离过程中会导致糖链被非预期地标记。还必须将高效液相色谱（HPLC）调节至恒定压力，以确保糖链分级分离的一致性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

N -连接糖链的糖蛋白在哺乳动物细胞中的脉冲大通分析

本文介绍了一种特异且灵敏的方法，用于深入了解免疫器官和细胞中糖鞘脂抗原的表达谱。该方法利用离子阱质谱技术，通过逐步裂解糖鞘脂分子，并与化学合成的标准品进行比较，实现对分子结构的分析。...

糖鞘脂抗原的质谱分析

细胞表面蛋白在生物学上具有重要意义，且普遍存在糖基化修饰。本文介绍一种糖肽富集方法，用于溶解、富集并去糖基化这些蛋白，从而便于进行基于液相色谱-质谱的蛋白质组学分析。...

用于细胞表面蛋白质组学的糖肽捕获

为了全面探索O-连接聚糖的多样性，采用了一种新的凝胶内还原性β-消除方法，结合完全甲基化和快速相分离技术，直接从SDS-PAGE分离的糖蛋白中释放O-连接聚糖，并适用于后续通过质谱进行的糖组学分析。...

改进的凝胶内还原性β-消除法用于通过质谱进行全面的O-连接糖组学和硫酸化糖组学分析

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。...

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。...

聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

我们介绍了一种改良的人源细胞膜组分分离方法，以及用于检测SCAP N-糖基化和总蛋白的蛋白质印迹（western...

人源细胞中 SCAP N-糖基化及转运分析

唾液酸是糖缀合物中常见的一种单糖单元，参与多种分子和细胞间的相互作用。本文介绍一种利用代谢性糖工程修饰细胞表面唾液酸表达的方法，...

利用N-酰基修饰的甘露糖胺对唾液酸进行代谢性糖工程改造

本文介绍了一种通用的脉冲-追踪方法的实验方案，可用于在活细胞中动态分析蛋白质的折叠、转运和降解过程。...

活细胞中蛋白质折叠、转运与降解的放射性脉冲追踪分析

一种用于人胰腺组织中N-糖肽和磷酸化肽同步分析的旋转尖端富集策略

本文提出了一种简单的方法，结合代谢寡糖工程、点击化学和扩增显微技术，利用常规显微镜设备即可实现对细胞内唾液酸化N-糖蛋白的高分辨率生物成像。...

利用点击化学与扩展显微技术可视化细胞内唾液酸化修饰

了解哺乳动物细胞中N-连接糖链的脉冲追踪分析方法，通过代谢标记、酶解释放和HPLC分离技术，动态监测糖蛋白糖链的时空变化规律，为糖生物学研究提供可靠的实验手段。

哺乳动物细胞中糖蛋白N-连接糖链的脉冲-追踪分析

探索更多视频