哺乳动物细胞中糖蛋白N-连接糖链的脉冲-追踪分析

对糖蛋白上未连接的糖链进行分析，首先需要用氚标记的甘露糖对糖链和细胞进行标记。脉冲反应皿置于冰上冷却，而追踪反应皿则在无标记条件下孵育所需的追踪时间。随后，裂解样品并通过免疫纯化方法分离目标糖蛋白，使其变性，并通过酶解反应释放其糖链。

通过分子过滤进一步纯化寡糖，将其与分子量大于30千道尔顿的蛋白质及其他污染物分离。随后通过高效液相色谱（HPLC）分离糖链。通过测定每种洗脱组分中放射性信号的强度，确定每种糖链形式的含量。

大家好，我是来自特拉维夫大学细胞研究与免疫学系希拉尔多·莱特·克雷默（Hi Geraldo Letter Kremer）实验室的 Edward Azo。我同时也来自格拉尔多·莱特·克雷默（Gerardo Letter Kremer）课题组。今天我们将向您展示一种用于分离和分析代谢标记且连接的寡糖的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究全细胞糖蛋白群体及单个糖蛋白的糖链加工动态。好的，现在我们开始。首先，使用在90毫米培养皿中过夜培养的NIH 3T3细胞。

对于每个样品，将培养物稀释至亚汇合状态以使细胞处于葡萄糖饥饿状态，准备新鲜的两倍浓度无葡萄糖培养基，其中添加20%透析处理的胎牛血清（FCS）和8毫摩尔的丙酮酸钠；将所需体积的两倍浓度培养基与等体积的去离子水混合稀释。预热培养基，然后将每份细胞样品在5毫升新鲜预热的培养基中孵育5至15分钟。如果追踪时间超过12小时，则细胞操作应在无菌条件下进行。

孵育结束后，标记对应脉冲和追踪样品的培养皿。为了通过免疫沉淀进行糖蛋白分析而标记N-聚糖，将饥饿培养基更换为1毫升预热的无葡萄糖培养基，其中添加400微居里/毫升的[3H]甘露糖。若需标记和分析总糖蛋白，则使用65微居里/毫升的[3H]甘露糖。

更换饥饿培养基后，在正常的组织培养条件下将细胞孵育一小时。在一小时孵育结束时，从所有样品中移除标记培养基，小心向对应“脉冲”组的样品加入两毫升四摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS），并将其置于冰上。这些样品称为“脉冲”样品。

使用 2 mL 预热的完全培养基。将追踪样本冲洗三次。然后向细胞中加入 5 mL 预热的常规培养基。

将追踪样本置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中，孵育所需的追踪时间。在追踪样本孵育期间，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）在冰上清洗脉冲样本三次，每次两毫升。然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。

在2 mL PBS中，将释放的细胞放入2 mL EOR管中。短暂离心，以16,000 ×g离心6至10秒，吸除上清液，并将细胞沉淀在-80°C下冷冻保存。当追踪样本的孵育结束后，冲洗样本。

离心并按照上述脉冲样品的方法进行储存。准备进行细胞裂解时，从冷冻箱中取出细胞。对于免疫沉淀分析，通过加入300 µL裂解缓冲液裂解细胞。

短暂涡旋，并在冰上孵育20分钟。用于总糖蛋白样品分析时，加入300微升缓冲液B。冰上孵育细胞20分钟，随后在最大振幅下超声处理四次，每次10秒。然后将样品煮沸5分钟。

最后，在 4°C 条件下，将所有裂解液以 16,000 ×g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的 EOR 管中，并弃去沉淀。接下来进行免疫沉淀（IP），以检测目标蛋白；本实验中以 H2A 糖蛋白的免疫沉淀为例进行演示。

向每份样品的蛋白中加入20 µL，加入A型agro珠，并向每份样品中加入3 µL实验室的兔多克隆抗H2A抗体至裂解细胞的上清液中。在4°C条件下孵育4至16小时，同时通过缓慢旋转持续混匀。孵育结束后，离心收集珠粒，用真空泵小心吸除上清液，并加入500 µL缓冲液T洗涤珠粒，重复洗涤4次。

离心四次，使珠粒沉淀并去除上清液，以释放珠粒上结合的蛋白质。向珠粒沉淀物中加入10 µL内切糖苷酶H试剂盒中的变性缓冲液，将样品煮沸5分钟。再次离心使珠粒沉淀，将上清液转移至新的EOR管中。

现在可以对ellu蛋白进行去糖基化处理。使用酶和OH从免疫沉淀（IP）样品和总蛋白样品中释放糖链。对于免疫沉淀样品，向每个样品中加入0.5微升endo H酶和10微升2×endo H反应缓冲液。将样品在37摄氏度下孵育3小时。

对于总糖蛋白，将细胞裂解液的上清液加入截留分子量为30千道尔顿的MicroCon滤膜管中。用100微升缓冲液E通过反复在14,000 ×g条件下离心三次，洗涤总蛋白提取物。在滤膜管中加入3微升10×内切糖苷酶H反应缓冲液和1.5微升内切糖苷酶H酶，于37摄氏度孵育3小时，同时与免疫沉淀样品一同进行反应。

三小时孵育结束后，用去离子水将免疫沉淀样品稀释五倍，置于新的MicroCon滤膜上，在14,000 G下离心三分钟。向免疫沉淀样品和总蛋白样品中各加入50微升去离子水，离心洗涤，重复此步骤两次。如需保留，可收集含有切割下来的糖链的滤过液，用于后续含有Endo H抗性糖蛋白的分析。随后将具有Endo H抗性的糖蛋白在37摄氏度条件下，与200毫单位的N-糖苷酶F在15微升缓冲液C中孵育16小时。

使用去离子水进行洗脱，操作如上所述。使用带加热功能的真空浓缩仪，在不超过45摄氏度的条件下将样品完全干燥，以加速干燥过程。将干燥后的沉淀物重新悬浮于12微升HPLC溶剂中，并将样品加载至HPLC装置中安装的Sphero氨基柱上。

按照随附的书面实验方案运行样品。每次样品运行收集48个组分。使用闪烁计数器测量所收集组分的每分钟计数（CPM）值，并将CPM读数对组分编号作图。

按照随附的书面实验方案所述，计算所有糖链种类中甘露糖残基的百分比。以下是来自一小时脉冲标记样品的总糖蛋白糖链分析的代表性结果。HPLC 分数的 CPM 读数在所得图谱中以分数编号为函数进行绘制。

每个峰代表通过已知糖链标准品的高效液相色谱（HPLC）运行所鉴定出的特定糖链种类。对于每种糖链种类，其占总糖链的摩尔百分比随追踪时间的变化被绘制出来。此处显示的时间是针对一种特定错误折叠糖蛋白的分析结果，该蛋白通过免疫沉淀法从经蛋白酶体抑制剂 MG132 处理的样品中分离得到。

在追踪期间，剪切后的聚糖物种 M five six 会积累，由此得出结论：错误折叠蛋白上的寡糖在降解前会经历广泛的甘露糖剪切。这与经相同处理样品中总糖蛋白上的寡糖形成对比：在此情况下，在追踪期间 M nine eight 始终是主要的聚糖物种，而 M five six 仅略有增加。这表明仅有小部分总糖蛋白库被靶向至内质网相关蛋白降解途径。

缩写 rad。如随附的书面实验方案中进一步所述，我们刚刚向您展示了如何在活细胞中联合使用palase和HPLC分析，以追踪糖蛋白生命周期中游离寡糖组成的动态变化。在进行此操作时，重要的是要避免在“chase”样品中混入放射性物质的痕量污染，否则在“chase”期间以及尺寸分离过程中会导致糖链被非预期地标记。

还必须将高效液相色谱（HPLC）调节至恒定压力，以确保糖链分级分离的一致性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。