利用抗原表位修复法通过SDS-PAGE/免疫印迹检测人脑皮层组织匀浆中的Aβ多聚体

本方案可实现人脑皮层组织中β-淀粉样蛋白的检测。首先将匀浆组织进行探头超声处理，并通过低速离心澄清。随后，将样品在SDS缓冲液中经还原和煮沸处理，上样至聚丙烯酰胺凝胶。

将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，并将膜在磷酸盐缓冲盐水中进行蒸汽加热。最后，在摇床上，将膜与一抗、HRP标记的二抗于4°C孵育过夜，随后加入鲁米诺-过氧化物试剂，再进行X射线胶片曝光。大家好，我是来自埃默里大学耶基斯国家灵长类动物研究中心神经科学系拉里·沃克实验室的Rebecca Rosen。

今天我们将向您展示如何通过SDS凝胶电泳和免疫印迹结合热诱导抗原修复技术来检测Abeta多聚体和皮层均质性。我们在实验室中使用该方法研究阿尔茨海默病患者以及老年非人灵长类动物未固定的皮层组织中不同Abeta多聚体的水平和分布情况。现在让我们开始吧。

取约一百毫克未固定的皮质组织，加入约400微升预冷缓冲液，用匀浆器均匀研磨约30次。对于20%（重量/体积）的浓度，组织重量与缓冲液体积的比例应为每1毫克组织对应4微升缓冲液。匀浆完成后，将匀浆液转移至4毫升聚丙烯管中，使用探头超声仪在功率5条件下，每次超声5秒，共进行3次。

超声处理后，将匀浆转移至1.5毫升微量离心管中，在3000 ×g条件下离心5分钟。小心收集澄清的上清液，并将50微升等份试样储存于-80摄氏度，直至使用。接下来，根据制造商说明书，采用生物素酸法或BCA法测定澄清匀浆新鲜解冻等份试样的总蛋白浓度。澄清的20%皮层匀浆蛋白浓度应高于5微克/微升，因此可按1:10稀释，使其处于酶标仪检测范围之内。进行BCA测定时，使用相同等份的澄清匀浆制备变性样品反应。

使用大约 50 至 60 微克的总蛋白，并相应调整皮质匀浆的体积，使每份样品含有相同的总蛋白量。每块 10 至 20% 的 Trice 胶，将样品配制为 25 微升的总体积。对于每块胶，准备阳性对照：将 10 至 100 纳克的合成 Aβ40 或 Aβ42 肽用 1× PBS 稀释至 10 微升，加入 12.5 微升 2× SDS 样品缓冲液和 2.5 微升 10× 还原剂。

在制备所有样品后，包括β对照样品，涡旋5到10秒，然后在100摄氏度的干浴中加热5分钟，随后快速离心所有离心管以去除管盖上的冷凝液。将样品加入浸没于三重SDS电泳缓冲液中的凝胶电泳槽内，并至少在一个加样孔中加入10 µL未稀释的分子量标准品。以125伏恒定电压电泳约90分钟，或直至4 kDa标准蛋白迁移至距凝胶底部约1厘米处。

小心地将凝胶从塑料胶盒中取出，并根据制造商的说明组装转膜夹心结构。用三羟甲基甘氨酸缓冲液预湿印迹垫片，并将微米级硝酸纤维素膜浸湿，同时使用三羟甲基甘氨酸转移缓冲液，并去除印迹垫片或滤纸-膜夹心结构中的任何气泡。

将转移装置的内槽充满转移缓冲液，外槽充满蒸馏水。以25毫安的恒定电流进行转移，持续2至3小时。转移完成后，拆卸凝胶夹心结构，将凝胶放入盛有蒸馏水的容器中，将膜放入盛有1倍XPBS的容器中，后续所有步骤均使用该缓冲液。

确保凝胶和膜完全浸没在液体中，以防止干燥。为观察蛋白转膜效率，可将凝胶用未稀释的Simply Blue Safe染色液染色约一小时，膜则用1×PON S红染色液染色约五分钟。根据制造商说明书调整孵育时间，该染色步骤不会干扰后续免疫印迹实验。

如果染色结果显示蛋白转印效率较低，可在第三步中调整转印时间以进行抗原修复。将膜放入装有约50毫升1×PBS的加厚CapEx塑料袋中，在室温下密封后置于蒸锅内加热。当塑料袋开始膨胀后，将其平放在已预热至100摄氏度的蒸锅中，继续孵育15分钟，然后从蒸锅中取出。

从夹层中取出膜之前，应让膜缓慢冷却，以防止在室温下产生过度皱褶。小心地将膜从夹层中取出，并在摇床上用1×PBS缓冲液漂洗5分钟，随后在摇床上用TBST缓冲液再漂洗5分钟。接着，将膜直接放入封闭液中，在摇床上孵育1小时，无需漂洗；然后将膜转移至含有六E10初级抗体的培养皿中，该抗体特异性识别Aβ的C末端区域，使用封闭液按1:1000至1:5000的比例稀释。

在室温下于摇床上孵育一小时，随后在4°C条件下振荡孵育24至48小时。短暂快速漂洗一次后，用TBST在摇床上洗涤膜30分钟，接着再进行三次、每次10分钟的漂洗。

将膜置于摇床上，用封闭液按1:10,000比例稀释的HRP标记二抗孵育90分钟，室温条件下进行。本实验方案中使用羊抗US抗体。随后，再次用TBST缓冲液冲洗膜，总时长30分钟：先快速冲洗一次，随后在旋转摇床上进行三次、每次10分钟的冲洗。

最后一次漂洗后，将膜置于新配制的未稀释超级信号西极光Pico ECL试剂中孵育5分钟。在高速摇床上孵育后，取出膜并用无绒滤纸或Kimwipe吸去多余的试剂。使用无绒滤纸或Kimwipe，将膜夹在塑料保护膜之间并放入胶片暗盒中，再用无尘Kimwipe吸去多余的超级信号试剂。

如有必要，将 Kodak Biomax MR 胶片曝光 30 秒至 30 分钟，然后在胶片显影液中显影。在此实验中，5 分钟后 Aβ 单体条带可能已饱和。本实验分析了来自七名人类受试者的澄清匀浆，每份样品含 50 微克总蛋白，用于检测多聚体 β-淀粉样蛋白（Aβ）以及淀粉样前体蛋白（APP）——即 Aβ 肽段所来源的跨膜蛋白——的存在情况。

在此我们展示了 Aβ a PP 蛋白质印迹实验在曝光 30 分钟和 5 分钟时的代表性图像。30 分钟的曝光时间能够清晰显示较弱的二聚体、三聚体、四聚体以及更高分子量或配体条带，但在 5 分钟曝光时间下这些条带会过度曝光。相同的四聚体条带在 5 分钟曝光时较弱，但可使其他泳道清晰可见。

来自阿尔茨海默病（AD）患者的皮层匀浆样本显示在第1至第3泳道，第4泳道为一名被诊断为路易体痴呆合并阿尔茨海默病的人类受试者，第5和第6泳道为单纯路易体痴呆病例，第7泳道为一位年长的非痴呆人类对照样本。使用6C10抗体进行免疫印迹检测显示，所有阿尔茨海默病病例中均存在Aβ单体、二聚体、三聚体、四聚体以及APP蛋白，且在两例AD样本中还检测到大量高分子量的Aβ多聚体，这表明不同人类个体之间Aβ沉积具有异质性。

右侧泳道中的 Aβ40 可确认低分子量条带的身份。我们刚刚向您展示了一项 SDS-PAGE Western blot 实验，用于鉴定神经退行性疾病患者脑组织未固定匀浆中的 Aβ 多聚体。进行此操作时，重要的是制备高浓度的皮质匀浆液，以便通过凝胶电泳分离，从而揭示丰度较低的 Aβ 多聚体。

在使用针对 Aβ 肽的抗体进行免疫印迹之前，进行热诱导抗原表位修复也非常重要。抗原修复有助于暴露被遮蔽的 Aβ 表位，从而在免疫印迹过程中实现抗体的最佳结合。任何能够维持 100 摄氏度的蒸锅、微波炉或水浴装置均可使用。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。