SDS-PAGE/Immunoblot检测人脑皮层组织中的Aβ多聚匀浆使用抗原表位检索

该方案能够检测人类皮质组织中的 β 麦芽剂。首先，对匀浆的组织进行探针超声处理，并通过低速离心澄清。接下来，将还原样品在 SDS 缓冲液中煮沸，并加载到聚丙烯酰胺上。

将凝胶蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并在磷酸盐缓冲盐水中对膜进行蒸汽加热。最后，在轨道摇床上，将膜在一抗 HRP 偶联的二抗中孵育过夜，然后在暴露于 X 射线胶片之前将管腔过氧化物试剂孵育。大家好，我是来自埃默里大学 Yerkes 国家灵长类动物研究中心神经科学系 Larry Walker 实验室的 Rebecca Rosen。

今天，我们将向您展示如何使用 SDS 凝胶电泳和免疫印迹结合热诱导抗原修复来检测 Abeta 多聚体和皮质均质。我们在实验室使用该程序来研究阿尔茨海默病患者和年龄非人灵长类动物的未固定皮质组织中不同 Abeta 多聚体的水平和分布。那么让我们开始吧。

从大约 100 毫克未固定的皮质组织开始，在大约 400 微升的冰冷缓冲液中以大约 30 次均匀的杵击击打进行下层匀浆。对于每体积 20% 重量，组织重量与缓冲液体积之比应为 1 毫克至 4 微升。均质化后，将匀浆转移到 4 mL 聚丙烯管中，并以 5 次幂功率对探针进行 3 次 5 秒的超声处理。

超声处理后，将匀浆转移至 1.5 mL微量离心管中，离心 5 分钟在 3000 G 下，小心去除澄清的上清液，并将 50 μL 等分试样的这些提取物储存在零下 80 摄氏度直至使用。接下来，根据制造商的说明，使用生物酸或 BCA 测定法测定新鲜解冻的澄清匀浆等分试样的总蛋白质浓度澄清的 20% 皮质匀浆的蛋白质浓度应大于 5 微克/微升，因此可以稀释 1 至 10 以在读板器范围内。对于 BCA 分析，使用相同等分试样的澄清匀浆制备变性样品反应物。

使用大约 50 至 60 微克总蛋白，并相应地调整皮质匀浆的体积，使每个匀浆含有相同的总蛋白。为每运行一个 10% 至 20% trice 凝胶制备总体积为 25 μL 的样品。对于每块凝胶，制备 10 至 100 ng 合成 a β 40 或 β 42 肽的阳性对照，在 1 个 XPBS 中稀释至 10 μL，加入 12.5 μL 的 2 个 XSDS 样品缓冲液和 2.5 μL 的 10 x 还原剂。

制备所有样品后，包括 β 对照涡旋 5 到 10 秒，并在 100 摄氏度的干浴中加热 5 分钟，然后快速旋转所有试管以去除瓶盖中的冷凝水。将样品加载到凝胶盒中浸入 trice SDS 电泳缓冲液中的凝胶上，并在至少一个孔中加载 10 微升未稀释的分子量标记物。在 125 伏特的恒定电压下运行凝胶约 90 分钟，或直到 4 公斤的道尔顿标记物距离凝胶底部约 1 厘米。

小心地从塑料盒中取出凝胶，并根据制造商的说明组装转移三明治。预润湿印迹垫，并用 tris 甘氨酸指向微米硝酸纤维素膜。转移缓冲液并去除印迹垫或滤纸膜三明治上的任何气泡。

用转印缓冲液填充转印装置的内腔，并用蒸馏水填充外腔。以 25 毫安的恒定安培数运行传输 2 到 3 小时。转移完成后，解构三明治，将凝胶放入装满蒸馏水的培养皿中，将膜放入装有 1 个 XPBS 的培养皿中，用于所有方案步骤。

确保凝胶和膜完全被液体覆盖，以避免变干。为了可视化蛋白质转印染色凝胶的效率，只需使用未稀释的蓝色安全染色剂孵育约 1 小时，并使用 1 x PON S 红色染色剂将膜孵育约 5 分钟。孵育时间根据制造商的说明，这种染色不会干扰免疫印迹。

如果染色显示蛋白质转印效率低下，请修改步骤 3 中的转印时间以进行抗原修复。在蒸锅中，将膜热封在装满约 50 毫升 1 XPBS 的重型 CapEx 塑料袋中，并在室温下填充。一旦袋子开始膨胀，将袋子平放在 100 摄氏度的预热蒸笼中，再孵育 15 分钟，然后再从蒸笼中取出。

在将膜从袋子中取出之前，让膜缓慢冷却，以防止在室温下过度起皱。小心地从袋中取出膜，在轨道摇床上冲洗膜 5 分钟，然后在轨道摇床上冲洗 1 个 XPBS，然后在轨道摇床上用 TBST 冲洗 5 分钟。接下来，将膜在定轨摇床上在封闭液中孵育 1 小时，不要冲洗，将膜转移到含有一抗 6 E 10 的培养皿中，该一抗对 A β 和末端区域具有特异性，在封闭溶液中稀释 1 比 1000 到 1 到 5， 000。

在轨道摇床上室温孵育 1 小时，然后在 4 摄氏度下振荡 24 至 48 小时。快速冲洗一次后，清洗膜 30 分钟。在 TBST 中，然后在轨道摇床上冲洗 3 次 10 分钟。

在室温下，在摇床上将膜在封闭溶液中以 1 至 10， 000 稀释的 HRP 偶联二抗孵育 90 分钟。在该协议中，我们使用绵羊抗美抗体。同样，在 TBST 中冲洗膜 30 分钟，从快速冲洗开始，然后在轨道摇床上冲洗 3 次，每次 10 分钟。

最后一次冲洗后，将膜与新鲜制备的未稀释超级信号 West Pico ECL 试剂一起孵育 5 分钟。在高 RPM 的摇床上，去除膜并擦去多余的试剂。使用不起毛的滤纸或 kin 湿巾，将膜放在塑料片保护膜之间的薄膜盒中，用无尘 Kim 湿巾吸去额外的超级信号试剂。

如有必要，暴露于 Kodak Biomax MR。拍摄间隔 30 秒，最多 30 分钟，并在胶片显影剂中显影。五分钟后，A β 单体条带可能会饱和 在这个实验中。分析来自 7 名人类受试者的含有 50 μg 总蛋白的澄清匀浆是否存在多聚体 β 淀粉样蛋白或 β 和淀粉样蛋白前体蛋白或 PP，PP 是裂解 A β 肽的跨膜蛋白。

在这里，我们展示了 A beta a PP 蛋白质印迹实验在 30 分钟和 5 分钟曝光下的代表性图像。30 分钟的曝光可以观察到 Abeta 中更轻的二聚体、三聚体、四聚体和更高的分子量或韧带，但在 5 分钟的曝光时间里会过度曝光其他泳道。存在相同的四聚体条带，但很微弱，可以清楚地看到其他泳道。

来自阿尔茨海默病或 AD 受试者的皮质匀浆出现在泳道 1 到 3 中，被诊断患有活体痴呆或 DLB 和阿尔茨海默病的人类受试者出现在泳道 4 中，路易体痴呆病例出现在泳道 5 和 6 中，以及一个老年的非痴呆人类对照病例。在泳道 7 中，抗体 6 C 10 的免疫开花显示，在所有阿尔茨海默病病例中，β 单体、二聚体、修剪体、四聚体和 PP 以及丰富的高分子量。A beta malters 在两个广告案例中，这表明人类受试者合成的 beta 化的异质性。

右侧泳道中的 beta 40 证实了较低分子量条带的身份。我们刚刚向您展示了一个 SDS 页面 Western body 实验，用于鉴定神经退行性疾病患者大脑中未固定组织匀浆中的 β 多聚体。执行此程序时，重要的是要准备高浓度的皮质均质，以便通过凝胶电泳进行分离，以揭示低丰度的 Abeta 麦芽。

在使用 Abeta 肽抗体进行免疫印迹之前进行热诱导抗原表位修复也很重要。抗原修复有助于揭示模糊的 Abeta 表位，以便在免疫印迹过程中实现最佳抗体结合。任何保持 100 摄氏度的蒸笼、微波炉或水浴就足够了。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。