Name: MALDI样品制备:超薄层的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 学习MALDI-MS超薄层样品制备方法，使用HPLC级试剂和甲醇清洗MALDI靶板，确保蛋白质准确质量测定。该方法适用于膜蛋白和可溶性蛋白质谱分析，提高质谱分析准确性。

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在制备薄层时，佩戴无粉手套非常重要。
样品板的清洗
<ol>
	<li>使用不锈钢或金制的MALDI样品靶板。</li>
	<li>用甲醇（MeOH）清洗，并用无尘纸轻轻擦拭。切勿用力摩擦或刷洗表面，以免划伤靶板表面。</li>
	<li>用 H2O 清洗，并用无尘纸轻轻擦拭。</li>
	<li>用甲醇（MeOH）清洗，并用无尘纸轻轻擦拭。</li>
	<li>如有需要，重复甲醇/水（H2O）/甲醇清洗步骤，每次均须以甲醇结束。</li>
	<li>确保靶板表面无残留的“鬼影斑点”或残迹。若存在鬼影斑点，应在戴手套的手轻轻摩擦表面的同时，用去离子水冲洗靶板（切勿使用无尘纸擦拭），然后重复甲醇/水（H2O）/甲醇清洗步骤。</li>
	<li>清洗后应立即使用该靶板。</li>
</ol>
薄层基质溶液的制备
<ol>
	<li>将1份饱和4-HCCA（2份乙腈，1份水，终浓度0.1% TFA）与3份异丙醇混合。 
	 
	注意： 薄层基质溶液非常稳定，且&#160;可在避光条件下于室温保存一年，也可在4 °C下储存。</li>
</ol>
制备薄层基质
<ol>
	<li>在板的左侧中心位置加入 20–50 µL 薄层基质溶液，并用移液器吸头侧面涂抹，单向扫动展开。</li>
	<li>随着溶液干燥，有机溶剂迅速蒸发，导致板表面残留微小水滴。此时，用一张 Kimwipe 纸包裹食指，先轻轻蘸去板表面的水滴。</li>
	<li>当表面水滴完全去除后，使用 Kimwipe 以单向扫动方式擦拭整个板面。 
	 
	注意：如果溶液未能充分铺展至整个板面，可增加乙腈（ACN）的比例并重新制备薄层。可能影响溶液铺展性的参数包括环境湿度和温度。 
	 
	注意：对于金质板，薄层通常呈现为带有淡黄色的反光，具体视观察角度和光照角度而定；对于钢质板，通常仅边缘部分可见。 
	&#160;</li>
	<li>将板放入板架前，使用新的 Kimwipe 擦拭板的边缘，以防止基质污染仪器。</li>
</ol>
基质溶液的制备
<ol>
	<li><a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">饱和 4-HCCA</a> 在FWI（3份甲酸，1份水，2份异丙醇）中推荐用于膜蛋白和可溶性蛋白的分析。在特殊情况下，也可用于分析极疏水性的大分子肽（M &#62;4,000 u）。确保用于点样蛋白质的基质溶液中有机相含量不超过约50%。&#160;因为它会完全溶解薄层基底，从而破坏该方法的优势。</li>
</ol>
薄层基质的测试
<ol>
	<li>在样品板上点加 0.5 µL 基质溶液。在薄层与液滴的界面处会出现白色沉淀。当该沉淀层完全覆盖液滴底部时（通常在 10–15 秒内），用真空管线吸去多余液体。如果沉淀形成时间超过 30 秒&#160;，则表明薄层基质和/或基质溶液可能存在异常。</li>
</ol>
样品应用
<ol>
	<li>起始溶液中的分析物浓度应在 10 至 1000 µM 范围内。</li>
	<li>将分析物溶液用基质溶液稀释，使最终分析物浓度在 0.2–2 µM 之间。例如，取 1 µL&#160;样品与 9 µL&#160;基质溶液混合。 
	 
	注意：确保最终溶液中基质接近饱和状态，否则会重新溶解薄层基底。 
	 
	注意：获得良好信号&#160;所需的分析物浓度高度依赖于溶液的复杂性和组成（例如，污染物）以及分析物的电离能力。 
	 
	注意：如果单步稀释无法获得理想结果，应尝试进一步稀释。尽管这看似违反直觉，但高浓度的分析物溶液通常难以产生良好的质谱图。 
	 
	注意：膜蛋白通常需要更大的稀释倍数。 
	&#160;</li>
	<li>取 0.5 µL&#160;样品/基质混合液点样至靶板上。在薄层与液滴的界面处会形成白色沉淀，此沉淀即为基质与分析物的共结晶。当该沉淀完全覆盖液滴底部时（通常在 10–15 秒内），用真空管线吸除多余液体。如果沉淀形成时间超过 30 秒&#160;，可能提示存在抑制结晶的污染物，或分析物浓度过高。</li>
</ol>
校准品应用
<ol>
	<li>以类似方式制备校准物/基质混合液，最终校准物浓度在 0.1–0.5 µM 之间。</li>
	<li>在靶板上靠近样品点的位置点加 0.5 µL&#160;校准物/基质混合液。该物理邻近位置用于伪内标校准程序：在样品采集过程中，将靶板从样品点移动至校准物点，对校准物施加数次激光脉冲，将其信号加入质谱图中。该方法相比仅使用外标校准可实现更高的质量精度校准。</li>
</ol>
洗涤步骤
<ol>
	<li>用约 2 µL 冰冷的 0.1% 水性三氟乙酸（TFA）溶液冲洗每个点位，然后用真空管线吸去多余液体。</li>
</ol>
质谱数据的采集
<ol>
	<li>现在可以开始采集质谱。如果使用 FWI 基质溶液，必须尽快采集质谱，以防止分析物发生不可逆的修饰，例如甲酰化。</li>
</ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

maldi 样品制备：超薄层法

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

本视频展示了用于通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析肽和蛋白质的超薄基质/分析物层的制备方法 1,2超薄层法涉及在样品板上制备一层基质晶体（α-氰基-4-羟基肉桂酸）的基底，该基底可作为后续基质/分析物混合物结晶的成核基础。与其它样品点样方法相比，超薄层法具有以下优势（例如 干燥液滴法的优点包括：(i) 对盐类和去污剂等杂质具有更高的耐受性，(ii) 分辨率更优，以及 (iii) 空间分布更均匀。该方法特别适用于蛋白质的精确质谱测定。该实验方案最初为膜蛋白分析而开发并优化，已成功用于分析含有 2 至 12 个跨膜结构域的离子通道、代谢物转运蛋白和受体。 2自首次发表以来，该方法也被证明同样适用于可溶性蛋白质的分析。事实上，我们已将其应用于大量具有广泛特性的蛋白质，包括分子质量高达380 kDa的蛋白质。 3目前，该方法是我们进行所有蛋白质分子量分析的首选方法。所述操作流程 consistently 产生高质量的质谱图，且具有高灵敏度、高稳健性，易于实施。

本视频演示了为通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）分析肽和蛋白质而制备超薄基质/分析物层的方法。

MALDI 样品制备：超薄层法

本视频演示了为通过基质辅助激光解吸电离质谱分析肽和蛋白质而制备超薄基质/分析物层的方法。

欢迎观看CHI实验室关于超薄层方法的教程，该方法特别适用于蛋白质的精确质量测定。由于质谱分析具有较高的敏感性，我们仅使用HPLC级试剂以及无粉乳胶或腈类手套来清洁样品板。依次用甲醇、水交替冲洗，最后再用甲醇冲洗一次。每次冲洗之间，使用镜头纸轻轻擦去多余的溶剂。可根据需要重复这些洗涤步骤，直至获得干净的载玻片。清洁并干燥后，应立即使用该载玻片。将20至30微升的薄层基质溶液涂抹于洁净的MALDI靶板上。此处我们使用P250移液器吸头均匀铺展溶液，同时避免划伤靶板表面。当薄层干燥时，如有残留水滴，可用无尘纸轻轻吸除。然后用无尘纸以平稳的动作轻轻擦拭载样板，以形成均匀的薄层。最后，清洁载样板的边缘，避免污染质谱仪。在施加样品前，务必先检测薄层是否合格。如果检测点干燥时间过长，且晶体分布不均匀，问题可能出在薄层本身或基质溶液上。此时应清洗板面，重新涂布薄层，并重新检测。在向薄层点样时，不应让样点完全蒸发至干燥。而应在结晶速度减慢并停止后，除去多余的溶剂。使用真空抽滤器时，样品中存在盐类和去污剂等污染物以及分析物浓度过高可能会干扰结晶。进一步稀释样品可能有助于改善结晶。将基质辅助激光解吸电离质谱的校准点（Ants）点在靠近样品的位置，这将实现伪内标校准，即通过将靶板从样品点移动至校准点进行校准。在样品采集过程中，向谱图中添加几束来自校准物（CAS）的激光，该方法相比仅使用外部校准，能够确保更高的质荷比准确性。必须彻底洗去可能干扰分析物电离的任何污染物，例如盐或洗涤剂。为此，可将冰冻的、含0.1%三氟乙酸的HPLC级水直接滴加到样品点上。使用真空抽滤器（如图所示）移除洗涤液。该方法可获得膜蛋白和可溶性蛋白的优质谱图。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

MALDI样品制备：超薄层的方法

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精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

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荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞

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