真核生物多聚核糖体图谱分析

本实验的总体目标是从细胞裂解液中分离并比较单核糖体和多核糖体组分。首先培养目标细胞以完成第一步，实验的第二步是制备细胞裂解液。

该实验步骤的第三步是将裂解液通过蔗糖梯度离心。最后一步是分段收集梯度组分，并通过紫外吸收曲线来观察不同的核糖体群体。最终，可通过多核糖体谱型分析获得结果，以显示在不同实验条件下翻译水平的变化。

大家好，我是 Anthony Esposito，来自马里兰大学和罗伯特·伍德·约翰逊医学院分子遗传学、微生物学与免疫学系 Terry Goss Kinsey 博士的实验室。我是 Marcus Lewis，同样来自罗伯特·伍德·约翰逊医学院的 McKinsey 实验室。

今天，我们将向您展示一种多核糖体分析的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究由基因突变或环境因素引起的蛋白质合成变化。现在就开始吧。蔗糖。

梯度液应在使用前一天制备，以使梯度充分连续。用7%和47%的蔗糖储备液按适当比例混合，分别配制以下每种蔗糖浓度的溶液各48毫升：7%、17%、27%、37%和47%。向每种蔗糖溶液中加入一摩尔的DTT，使其终浓度为一毫摩尔。为便于灌注梯度液，用Parafilm将一根意大利面移液管固定并密封连接至20毫升注射器上。

在一根直径1英寸、长3.5英寸的聚丙烯超速离心管底部加入7毫升7%蔗糖溶液。接着，将巴氏吸管的管尖靠近管底，缓慢加入7毫升17%蔗糖溶液，使其位于7%蔗糖溶液下方。每加一层溶液所需时间不应少于20秒。

当梯度制备完成后，分别用 7 毫升的 27%、37% 和 47% 蔗糖溶液重复操作。应观察到各层之间有清晰的分界线，表明混合程度极小。将所有梯度、转子、收集样品所用的瓶子和试管一同在 4 °C 下过夜保存。

为制备酵母细胞提取物，首先将100个25毫升的酵母培养液培养至OD 600为0.8至1.0。向培养液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100微克/毫升，并在30°C下继续振荡培养15分钟。15分钟后，将培养液倒入250毫升离心管中，并置于冰中冷却。

从此步骤开始，所有操作均需在冰上进行。在4°C条件下，以8,000 × g离心5分钟。重悬沉淀物于10毫升预冷的裂解缓冲液中，并转移至15毫升聚丙烯管中。在4°C条件下，以5,900 × g离心3分钟，重悬沉淀。

将沉淀重悬于 0.5 毫升裂解缓冲液中。将悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中，然后加入 0.5 毫升预冷的经焙烧酸洗的玻璃珠。涡旋振荡细胞，每次 32 秒，每振荡一次后将离心管置于冰上冷却 30 秒，重复四次。

然后向1.5毫升离心管中再加入0.5毫升裂解缓冲液，在4°C下以5,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，在4°C下以最大速度离心10分钟。

最后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。提取物可保存于-80°C，用于后续将裂解液转移至蔗糖梯度。将移液枪头紧贴离心管管壁靠近梯度表面处，轻轻将裂解液铺加在梯度上方。

对于35毫升的梯度溶液，通常上样500微升裂解液。使用镊子小心地将梯度溶液放入摆动桶转子的吊桶中。在4摄氏度下，以100,000 × g离心4小时。

在四小时离心结束前约30分钟，将针头连接到试管穿刺器上，并将笔连接到在线吸光度荧光监测仪。打开吸光度监测仪的电源，以便在分析样品前达到稳定的基线。

通过连接 DI 1 48 U 数据采集单元，可实时轻松获取 PolyZone 谱图的电子数据。将注射泵用反向流动快速设置模式吸入 50 毫升氟化坚果溶液，并确保其中无气泡存在。

将注射器的软管连接到穿管器上，并短暂开启六毫升每分钟的Flo惰性气体正向气流，以清除软管中的任何气泡。在流动池末端的软管下方放置一系列试管，用于收集流出的样品。

准备一个冰桶，并在其中预先制备好用于放置含蔗糖梯度的离心管的孔洞。当四小时的离心完成后，小心地将离心管从离心转子中取出，并立即置于冰上，注意避免扰动梯度。

为分析细胞提取物，将梯度管置于穿刺架上，将管子顶端连接至出口并固定。抬起底部载物台，使针头刺入离心管底部。以每分钟六毫升的流速开始向前流动氟林试剂。

当液体开始流入管中后，监测在线紫外吸收监测仪上指针的移动。一旦指针开始移动，将记录仪的走纸速度调至60。当多核糖体图谱的末端到达时，关闭流向离心管的Flo惰性气体流动，并在吸收荧光监测仪上停止记录仪的走纸。

通过快速反向启动流速，将Flo inert从离心管回吸至注射器中，注意切勿将离心管中的蔗糖吸入注射器。将离心管从穿刺针上拧下，降低针头并取下离心管。此处展示的是在环己酰亚胺存在下从酵母制备的核糖体提取物的代表性图谱。

含有多核糖体以及A TS 60 s和40 s核糖体的紫外吸收峰已标出。我们刚刚向您展示了如何进行多核糖体分析。在执行该实验步骤时，重要的是要记住操作需迅速，保持样品低温，并确保RNA无降解。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。