从软肌肉骨骼组织中分离干细胞
2010年7月5日
隔离肌肉骨骼软组织的成人干细胞的基础上坚持细胞的速度向烧瓶。
该程序的总体目标是从肌肉骨骼软组织（如骨骼肌）中分离成体干细胞。这是通过首先对软组织进行活检、清创并切碎来完成的。该程序的第二步是酶消化组织。
该程序的第三步是通过重复的预铺板步骤分离干细胞。该程序的最后一步是鉴定分离的干细胞。最终，可以使用免疫荧光、显微镜和/或流式细胞术获得显示细胞形态和细胞行为的结果。
大家好，我是来自匹兹堡大学骨科外科分子病理学实验室的 y Lee。今天我将向您展示如何从 Mus 骨骼系统的软组织（如骨骼肌）中分离出成体干细胞。您好，我是 Johnny Ward 博士。
我是匹兹堡大学医学院骨科外科的教授。我一直在与 Young Lee 博士密切合作，通过这个程序将不同类型的干细胞与骨骼肌隔离开来，并改变标准组织。我们使用实验室中的程序来分离干细胞，用于转化医学应用的基本研究。
所以让我们来研究一下。让可以从中分离干细胞的组织包括从野生型小鼠后肢的胫骨或比目鱼肌收获的肌腱和骨骼肌。去除皮肤和骨骼残留物后，将组织放入含有补充有 5% FBS 的冷 HBSS 的培养皿中。
接下来，将组织分别放在含有冷 HBSS 的胶原蛋白涂层培养皿上。我们将使用骨骼肌组织来演示组织解离和消化的基本程序。使用微型剪刀和/或手术刀刀片将骨骼组织切碎成粗浆，pH 酶消化组织。
首先将 MIT 组织浆液转移到单独的 15 毫升试管中，在 4 摄氏度下以大约 3， 500 RPM 的速度离心 5 分钟。通过 Resus 悬浮 HBSS 去除 SANE 洗涤液并重复离心。去除上自然后，加入 10 毫升预热的 0.2% 胶原酶消化浆液。
11 型在 37 摄氏度下孵育 60 分钟，孵育 60 分钟后，每 10 分钟用手摇动试管。离心，然后将浆液重悬于 10 毫升 DYS 空间溶液中。在 37 摄氏度下孵育 45 分钟，孵育 45 分钟后每 10 分钟用手摇动一次离心机，然后将浆液悬浮在 10 毫升 0.2% 的 HBSS 溶液中。
我们通常在 15 摄氏度下孵育 20 到 37 分钟，同时每 10 分钟倒置试管，孵育完成。如图所示，当从组织中释放出足够的单细胞时，离心所得细胞并复苏，将细胞沉淀悬浮在 5 毫升增殖中。培养基 PM 将提取物穿过一系列针头两次，然后通过 23 号针头一次，最后通过 27 号针头一次，从而解离细胞悬液。
最后，将细胞提取物通过 70 微米细胞过滤器，开始制备技术。离心刚刚制备的细胞提取物，并重悬沉淀增殖。将 5 毫升细胞混合物接种到涂有胶原蛋白的 T 25 培养瓶上，并以 PP 1 的形式销售，在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳培养箱中孵育 2 小时。
两个小时后。将非粘附细胞转移到新的胶原蛋白包被的 T 25 培养瓶中，作为 PP 2 销售。将 5 毫升 PM 添加到标记为 PP one 的前一个 T 25 培养瓶中。
将两个培养瓶放回培养箱中 24 小时。24 小时后，将非贴壁细胞从 PP 2 转移到新的胶原 ENC 包被的 T 25 培养瓶中，并将其标记为 PP 3。将 5 毫升增殖培养基加入标记为 PP 2 的培养瓶中。
将培养瓶放回培养箱中。每 24 小时重复一次该过程，直到群体 PP 6。干细胞群被创造。
分离的 PP six 细胞数量非常少，需要维持在富含 FBS 的增殖培养基中。这种情况每天都在改变。尽管 PP six 培养物中的大多数细胞会在接下来的 1 到 2 周的培养中死亡。
通常在额外的一到两周的扩张后产生一个大型的健康 PP 六种群。也要保持所有其他悬浮细胞组，让它们增殖并使用倒置显微镜定期检查它们。附着在 PP one 和 PP 2 培养瓶上的早期粘附细胞大多是纤维化细胞。
在48 至 96 小时内较长时间后粘附在胶原包被培养瓶上的细胞。PP 3 和 PP 4 主要是成肌细胞。虽然肌肉卫星细胞通常主要出现在 PP 5 中，但较晚的 96 小时或更晚的 PP 6 制备细胞被视为成体干细胞，看起来小、圆且半透明。
在分离开始时，可以通过免疫组化进一步表征它们对干细胞标志物（如干细胞、抗原 1 和 CDC 34）的表达。我们刚刚向您展示了如何从小鼠的第二个团块中分离干细胞。何时执行此程序，重要的是要记住在所有程序中保持类固醇。
分离干细胞后，确保以低密度培养这些细胞，以保持细胞的干细胞特性。就是这样。感谢您的观看，祝您的体验好运，祝您在实验中尝试使用它好运。
谢谢。
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概述
本文概述了一种从肌肉骨骼软组织（特别是骨骼肌）中分离成体干细胞的程序。该过程包括多个步骤，包括活检、酶解以及反复预培养，以实现干细胞的成功分离。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 肌肉骨骼组织研究
- 细胞分离技术
背景
- 成体干细胞在再生医学方面具有重要潜力。
- 肌肉骨骼软组织是这些干细胞的丰富来源。
- 分离技术对于研究干细胞特性至关重要。
- 了解细胞行为有助于治疗应用。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分离成体干细胞。
- 增强对干细胞特性的理解。
- 促进再生疗法的进一步研究。
使用的方法
- 骨骼肌组织活检。
- 组织的清创和细切。
- 酶解以释放干细胞。
- 反复预培养步骤以实现细胞分离。
主要结果
- 成功从肌肉骨骼组织中分离出成体干细胞。
- 使用免疫荧光对分离的细胞进行表征。
- 通过显微镜和流式细胞术分析细胞行为。
- 结果表明在研究中有进一步应用的潜力。
结论
- 所描述的方法对分离成体干细胞有效。
- 分离的细胞可用于各种科学研究。
- 进一步的研究可能会带来再生医学的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating adult stem cells from musculoskeletal soft tissues enables early-stage target validation in regenerative medicine by providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking. This protocol supports predictive confidence in stem cell-based therapies through reproducible isolation of multipotent cells. The method facilitates translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating scalable, autologous cell sources.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell multipotency and self-renewal for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate stem cells from tendon and muscle tissues.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by confirming stem cell identity via marker expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified stem cell populations for compound screening in differentiation assays.
- Operational Value: Yields reproducible adherent and non-adherent fractions for assay standardization.
- Scientific Value: Enables quantitative readouts via flow cytometry and immunofluorescence for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Produces disease-relevant stem cells for preclinical modeling of musculoskeletal repair.
- Operational Value: Supports expansion of PP6 cells for longitudinal preclinical studies.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment through characterization of stem cell antigen expression.
Pipeline & Workflow Integration
The preplating technique integrates into the discovery workflow by enabling stem cell isolation prior to functional validation and screening applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stem cell function in tissue regeneration pathways.
- Screening: Delivers standardized stem cell preparations for compound library screening.
- Analytics: Provides qualitative and quantitative outputs for assessing stem cell purity and behavior.
- Translational Research: Connects isolation to preclinical continuity through expandable PP6 populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for multiple musculoskeletal tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell therapeutics by reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility through serial preplating and collagen-coated flask standardization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of stem cell quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and sterile cell culture techniques.
- Depends on collagen-coated flasks, centrifugation equipment, and inverted microscopes for monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of preplating timing and medium formulations.
- Involves adaptation considerations for different soft tissue sources such as tendon versus muscle.
- Limited by low stem cell yield and requirement for extended culture to obtain sufficient PP6 populations.
