Name: 从软肌肉骨骼组织中分离干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习从骨骼肌等肌肉骨骼软组织中分离成体干细胞的方法，通过活检、酶消化和多次预贴壁步骤实现细胞分离。该技术适用于干细胞生物学和再生医学研究。

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作者非常感谢潘海英女士和 Ian Bellayr 先生在当前视频中细胞分离方面的技术支持，以及 Kyle Holden 先生和 Jonathan Lucas 先生在幻灯片编辑方面的帮助。衷心感谢多年来参与改良预铺板技术发展的以下各位：Burhan Gharaibeh 博士、BaoHong Cao 博士、Deasy Bridget 博士、Thomas R. Payne 博士、Aiping Lu 博士、Hairong Peng 博士、Hideki Oshima 博士、Bo Zeng 博士、Xiaodong Mu 博士、Kimimasa Tobita 博士、Ron Jankowski 博士、Makato Ikezawa 博士。我们感谢 James H. Cummins、Ryan Pruchnic、Joseph Feduska、Rebecca C. Schugar、潘海英和 Jessica Tebbets 提供的技术协助。作者还感谢美国肌肉萎缩症协会（MDA）、美国国立卫生研究院（NIH）、美国国防部（DOD）、UPMC 匹兹堡儿童医院、骨科系以及匹兹堡大学为本研究提供的经费支持。

通常，完成改进的预铺板操作需要1-2天的准备工作，1周的技术操作时间，2-3天通过免疫细胞化学进行细胞鉴定，以及额外2-3周用于干细胞群体的扩增。干细胞培养所需的设备与其他细胞培养系统相似，包括台式离心机、CO2 培养箱、层流洁净工作台以及配备荧光装置和数码相机的倒置显微镜。分离得到的干细胞还可进行克隆化，并可长期冻存在液氮中，用于当前或未来的研究1,2。本操作中使用的所有试剂和材料必须无菌，并以无菌技术操作。 步骤 1：准备 <ol> <li>胶原蛋白包被组织培养皿和培养瓶：使用来自小牛皮的I型胶原蛋白（0.1 g/L；Sigma-Aldrich）。需包被的塑料器皿包括：T-25培养瓶、6孔或12孔板、培养皿（60 mm和100 mm，BD Falcon），具体如前所述1,2。轻轻摇动器皿，每半小时一次，持续4小时，以确保胶原蛋白均匀包被。随后吸除胶原蛋白溶液，并将包被后的器皿置于组织培养超净台中，在开启紫外灯和风机的条件下晾干，以保证无菌，最后盖好盖子或覆盖保存，以备后续使用。</li> <li>配制细胞培养基：将400 mL DMEM（高糖DMEM；Invitrogen）、50 mL 热灭活胎牛血清（FBS，Invitrogen）、50 mL 马血清（HS，Invitrogen）和5 mL 鸡胚提取物（CEE；Accurate Chemical Co.）使用一次性无菌0.22 μm 500 mL滤器系统（Corning）进行真空过滤。最后加入无菌青霉素/链霉素溶液（Invitrogen），使其终浓度为100 Units/mL。配制好的培养基可在4°C保存至少一个月。该溶液用于在传代培养或准备细胞移植时使细胞从培养瓶中脱落。</li> <li>细胞分离用溶液的预热：以下试剂在用于细胞分离前需预热至37°C：Hank's平衡盐溶液（HBSS，Invitrogen）；0.2%（wt/vol）XI型胶原酶（Sigma-Aldrich），平均活性为每毫升HBSS含3,200单位胶原消化活性；Dispase，2.4单位/1 mL（Invitrogen）；0.5%（wt/vol）胰蛋白酶（Invitrogen）。</li> <li>准备并灭菌手术器械：手术操作需要无菌的手术器械，包括不同规格的镊子、显微剪刀、虹膜剪刀和/或手术刀片。此外，还需准备15 ml和50 ml聚丙烯离心管（BD Falcon）；细胞滤筛（孔径70 μm）（BD Falcon）；18、23和27号针头（BD PrecisionGlide）；以及10 ml或20 ml无菌注射器（BD）。</li> </ol> 步骤 2：组织活检、分离与机械解离1-4 组织活检在无菌培养罩内进行，所用新鲜收获的肌腱和骨骼肌取自野生型小鼠（雌性C57BL/6J，4-5周龄或更小，Jackson Laboratory提供）后肢的胫骨或比目鱼肌。随后从活检样本中去除所有可见的结缔组织、血管和脂肪组织。在手术解剖显微镜下仔细鉴别肌腱和肌肉组织，以清除残留的皮肤和骨组织，并将其置于含有冷（4°C）HBSS（添加5% FBS）的培养皿中。分离后的组织分别放置于包被有胶原的培养皿中，其中含有冷HBSS，并使用显微剪刀和/或手术刀片将其剪碎（&lt;1×1 mm3），制成粗浆状。 步骤 3：组织的酶消化： 然后通过一系列步骤对切碎的组织进行酶解离2,4,5 <ol> <li>将剪碎的组织匀浆分别转移至15 ml离心管中，在4 °C下以约3500 rpm离心5分钟。</li> <li>弃去上清液，用HBSS洗涤一次，然后再次离心。</li> <li>弃去上清液，加入10 ml预热的0.2% XI型胶原酶（Sigma），在37 °C孵育60分钟，同时持续轻轻摇动离心管；也可每10分钟手动振荡一次。</li> <li>离心后，将沉淀重悬于10 ml dispase溶液（2.4 单位/mL，Gibco）中，在37 °C孵育45分钟，每10分钟手动振荡或轻轻摇动一次。</li> <li>离心后，将沉淀重悬于10 ml 0.2%胰蛋白酶HBSS溶液中。孵育时间应根据组织中单细胞释放的程度而定，可通过显微镜观察细胞悬液来判断。不建议在37 °C孵育超过30分钟，期间每10分钟颠倒离心管或轻轻摇动一次。</li> <li>离心收集所得细胞，并将细胞沉淀重悬于10 ml增殖培养基（PM）中。</li> <li>通过依次使用不同规格针头反复吹打，将细胞悬液充分解离。细胞依次通过18G、23G，最后通过27G针头，各两次。</li> <li>将细胞悬液通过70 μm细胞滤筛过滤。</li> </ol> 步骤 4：通过细胞贴壁速率差异进行预铺板，以分离不同细胞群体1-3 <ol> <li>离心并用增殖培养基重悬细胞沉淀。</li> <li>将细胞混合物接种至胶原蛋白包被的T-25培养瓶（或60 mm培养皿）中，并标记为PP1。在显微镜下观察，细胞悬液应可见大量折光性细胞核及其他碎片。</li> <li>在37 °C、湿润、5% CO₂条件下孵育2 孵育2小时。</li> <li>将非贴壁细胞转移至新的胶原蛋白包被的T-25培养瓶（或60 mm培养皿）中，并标记为PP2。向标记为PP1的培养皿中加入5 ml PM。早期贴壁并附着于培养瓶的细胞主要为肌成纤维细胞。3.</li> <li>将培养瓶放回培养箱继续培养24小时，将未贴壁的细胞转移至一个新的经胶原蛋白包被的T-25培养瓶（或培养皿）中，并标记为PP3。向标记为PP2的培养板中加入5 ml增殖培养基。贴壁于该培养瓶的细胞主要为成纤维细胞。2,3.</li> <li>将培养瓶放回培养箱，并在24小时后重复该操作，直至建立PP6代细胞群体。维持每组悬浮细胞的培养，使其增殖，并定期使用倒置显微镜进行观察。PP3-PP4代细胞主要为成肌细胞，而肌肉卫星细胞则多见于PP5代。 2.</li> <li>大多数慢黏附细胞通常在PP6代时贴壁。此时细胞呈小而圆、折光性强，数量稀少，被认为属于干细胞群体1,2。</li> </ol> 步骤5：分离干细胞的鉴定与扩增 <ol> <li>分离得到的PP6细胞数量极少，需在富含胎牛血清的增殖培养基（含20% FBS的DMEM）中培养，并每日更换培养基。在培养的最初1–2周内，PP6培养物中的大部分细胞会死亡，但通常在随后1–2周的扩增培养后可形成数量较多且状态良好的PP6细胞群体。从小鼠中分离的干细胞高表达干细胞抗原1（Sca1）、CD34、胎儿肝脏激酶1（Flk1）及其他干细胞标志物。1,2,6,7 可通过免疫细胞化学染色观察。这些干细胞还具有多种分化潜能3,6,8.</li> <li>分离的细胞在培养中以低密度维持和扩增（12孔板，每孔50-100个细胞）或 &lt;避免分化，需将培养瓶或培养皿中的细胞密度控制在20-30%融合度 1,2扩增过程中仅有极少数细胞能够形成克隆，而这些克隆化的干细胞可进行长期增殖（LTP），用于其他功能研究。克隆化的干细胞也可采用常规细胞保存方法在液氮中冻存，例如使用含10% DMSO的PM培养基。建议制备多份低代次的干细胞储备样本，以备后续备份研究使用。</li> </ol>

<ol><li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice%3A+potential+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li>
<li>Li, Y. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li>
<li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &amp, Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li>
<li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li>
<li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li>
<li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

已认识到某些成体组织中含有多种干细胞。近年来的研究发现，软性骨骼肌系统组织（包括骨骼肌和肌腱）中存在干细胞。本实验方案详细描述了一种称为改良预贴壁法的技术，该方法已在本实验室成功用于从肌腱和骨骼肌中分离成体干细胞。利用上述改良预贴壁法，可根据细胞在胶原包被培养瓶上的贴壁特性，将其分为多个细胞群（图1）。组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞可在24–48小时内迅速贴附于胶原包被的培养瓶，最初通过PP1–PP2阶段与其他细胞分离。成肌细胞或内皮细胞则在较长时间后（48–96小时内）贴附于胶原包被培养瓶（PP3–PP5），可通过细胞表面标志物进行收获与鉴定。更晚贴壁的细胞（96小时或之后，PP6）被视为成体干细胞（图2）。晚期预贴壁细胞在分离初期表现为体积小、圆形、半透明形态，可通过流式细胞术或免疫细胞化学进一步鉴定其干细胞抗原1（Sca1）、CD34、胎肝激酶1（Flk1）及其他干细胞标志物的表达情况（图3）。分离获得的干细胞具有自我更新能力，实验研究已证实其多向分化潜能，可分化为三个胚层：中胚层、外胚层和内胚层。 9多项研究还表明，这些干细胞可分化为中胚层谱系的细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和造血细胞。 <sup...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>Invitrogen</td><td>#26050-088</td><td></td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>Accurate Chemical</td><td>#CE650T-10</td><td></td></tr><tr><td>100 U/mL 青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>#14190-250</td><td></td></tr><tr><td>亨克氏平衡盐溶液（Hank's Buffered Salt Solution）</td><td>Invitrogen</td><td>#24020-117</td><td></td></tr><tr><td>XI型胶原酶 0.2%（wt/vol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C7657</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶 2.4 U/mL</td><td>Invitrogen</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.5%（wt/vol）（10倍浓缩液；每升含5克胰蛋白酶（1:250））</td><td>Invitrogen</td><td>#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>用于包被培养瓶的胶原：源自小牛皮肤的 I 型胶原，0.1 克/升</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C-9791</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>#D-2650</td><td></td></tr></tbody></table>

从软性肌肉骨骼组织中分离干细胞

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

成体干细胞长期以来一直被讨论其在再生医学中的应用。由于成体干细胞具有多向细胞分化能力和自我更新能力，在治疗受损和病变组织方面引起了极大关注。最重要的是，这些特性使其在自体细胞移植治疗中具有显著优势。本实验方案将向读者介绍一种改良的预贴壁技术，该技术利用骨骼肌系统的软组织，例如肌腱和肌肉，进行成体干细胞的分离与培养。st经酶解离后，置于包被有胶原的培养瓶中培养。含有培养基和未贴壁细胞的上清液每日连续转移至新的培养瓶中。干细胞是贴壁最慢的细胞，通常需要5-7天（连续转移或预铺板）。利用该技术，可借助相对无创的操作简便地获取存在于这些组织中的成体干细胞。

根据细胞贴壁速度从肌肉骨骼软组织中分离成体干细胞。

成体干细胞长期以来一直被讨论其在再生医学中的应用。成体干细胞已引发大量……

本实验的总体目标是从骨骼肌等肌肉骨骼系统的软组织中分离成体干细胞。首先取软组织活检样本，进行清创并精细剪碎。实验的第二步是通过酶消化法处理组织。该操作流程的第三步是通过反复预贴壁步骤分离干细胞。流程的最后一步是鉴定已分离的干细胞。最终，可通过免疫荧光、显微镜检查和/或流式细胞术获得结果，以展示细胞的形态学特征和细胞行为。大家好，我是来自匹兹堡大学骨科手术系分子病理学实验室的 y Lee。今天我将向您展示如何从骨骼系统的软组织（如骨骼肌）中分离成体干细胞。大家好，我是 Johnny Ward 博士。我是匹兹堡大学医学院骨科系的一名教授。我一直在与Young Lee博士密切合作，开展从骨骼肌和标准等其他组织中分离不同类型干细胞的相关技术。我们在实验室中应用这些技术，主要用于干细胞的分离，以支持转化医学应用方面的基础研究。因此，让我们开始研究。可用于分离干细胞的组织包括从野生型小鼠后肢胫骨或比目鱼肌获取的肌腱和骨骼肌。去除皮肤和骨骼残余物后，将组织置于含有添加5% FBS的冷HBSS的培养皿中。接下来，将组织分别置于含有冷HBSS的胶原蛋白包被培养皿中。我们将使用骨骼肌组织来演示组织解离和消化的基本操作步骤。使用显微剪刀和/或手术刀片将骨骼肌组织切碎成粗浆状，以进行后续的酶消化处理。首先将MIT组织匀浆分别转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以约3,500 RPM离心5分钟。通过在HBSS中重悬去除SANE洗涤液，并重复离心步骤。去除上清液后，加入10毫升预热的0.2%胶原酶进行消化。11型在37摄氏度孵育60分钟，每10分钟手动摇动试管一次；60分钟孵育结束后，离心并将沉淀重悬于10毫升DYS溶液中。在37摄氏度孵育45分钟，每10分钟手动摇动一次；45分钟孵育结束后，离心并将沉淀重悬于10毫升含0.2%吐温-20的HBSS溶液中。通常在37摄氏度孵育15至20分钟，每10分钟颠倒试管一次，孵育即完成。当有足够数量的单个细胞从组织中释放出来时（如图所示），离心收集所得细胞，并将细胞沉淀重悬于5毫升增殖培养基（PM）中。通过一系列针头吹打使细胞悬浮液充分解离：先用18号针头吹打两次，再用23号针头吹打一次，最后用27号针头吹打一次。最后，将细胞提取物通过70微米细胞筛，以开始prepl技术。将刚刚制备的细胞提取物离心，并将沉淀重悬于增殖培养基中。取5毫升细胞混合物接种至胶原包被的T25培养瓶中，标记为PP1，在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育2小时。两小时后，将非贴壁细胞转移至一个新的胶原蛋白包被的 T25 培养瓶中，并标记为 PP2。向之前标记为 PP1 的 T25 培养瓶中加入 5 mL PM 培养基。将两个培养瓶放回培养箱中培养24小时。24小时后，将PP二中的非贴壁细胞转移至一个新的经胶原蛋白ENC包被的T25培养瓶中，并标记为PP三。向标记为PP二的培养瓶中加入5 mL增殖培养基。将培养瓶放回培养箱。每24小时重复一次该操作，直至第六代群体。干细胞群体由此建立。分离得到的PP六细胞数量很少，需在富含FBS的增殖培养基中维持培养，培养基需每日更换。尽管如此，在随后一到两周的培养过程中，PP六细胞培养物中的大部分细胞将会死亡。经过额外一到两周的扩增后，通常会形成大量健康的PP六代细胞群体。同时维持所有其他悬浮细胞群，使其增殖，并定期使用倒置显微镜进行观察。早期贴壁的细胞主要为纤维化细胞，会附着在PP一代和PP二代培养瓶上。在48至96小时的较长时间后，贴附于胶原蛋白包被的培养瓶上的细胞。PP三和PP四主要为成肌细胞。而肌肉卫星细胞通常多见于PP五，后期的预分离细胞（96小时或更晚的PP六）被视为成体干细胞，形态较小、呈圆形且透明。在分离初期，可通过免疫组织化学方法进一步表征这些细胞，检测其是否表达干细胞标志物，例如干细胞抗原1（stem cell antigen one）和CDC 34。我们刚刚向您展示了如何从小鼠的第二块组织中分离干细胞。进行该操作时，重要的是要记住在整个实验过程中始终保持类固醇的存在。一旦分离出干细胞，务必以低密度培养这些细胞，以维持其干细胞特性。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验顺利，也祝您在实验中成功应用该技术。谢谢。

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