从软肌肉骨骼组织中分离干细胞

该程序的总体目标是从肌肉骨骼软组织（如骨骼肌）中分离成体干细胞。这是通过首先对软组织进行活检、清创并切碎来完成的。该程序的第二步是酶消化组织。

该程序的第三步是通过重复的预铺板步骤分离干细胞。该程序的最后一步是鉴定分离的干细胞。最终，可以使用免疫荧光、显微镜和/或流式细胞术获得显示细胞形态和细胞行为的结果。

大家好，我是来自匹兹堡大学骨科外科分子病理学实验室的 y Lee。今天我将向您展示如何从 Mus 骨骼系统的软组织（如骨骼肌）中分离出成体干细胞。您好，我是 Johnny Ward 博士。

我是匹兹堡大学医学院骨科外科的教授。我一直在与 Young Lee 博士密切合作，通过这个程序将不同类型的干细胞与骨骼肌隔离开来，并改变标准组织。我们使用实验室中的程序来分离干细胞，用于转化医学应用的基本研究。

所以让我们来研究一下。让可以从中分离干细胞的组织包括从野生型小鼠后肢的胫骨或比目鱼肌收获的肌腱和骨骼肌。去除皮肤和骨骼残留物后，将组织放入含有补充有 5% FBS 的冷 HBSS 的培养皿中。

接下来，将组织分别放在含有冷 HBSS 的胶原蛋白涂层培养皿上。我们将使用骨骼肌组织来演示组织解离和消化的基本程序。使用微型剪刀和/或手术刀刀片将骨骼组织切碎成粗浆，pH 酶消化组织。

首先将 MIT 组织浆液转移到单独的 15 毫升试管中，在 4 摄氏度下以大约 3， 500 RPM 的速度离心 5 分钟。通过 Resus 悬浮 HBSS 去除 SANE 洗涤液并重复离心。去除上自然后，加入 10 毫升预热的 0.2% 胶原酶消化浆液。

11 型在 37 摄氏度下孵育 60 分钟，孵育 60 分钟后，每 10 分钟用手摇动试管。离心，然后将浆液重悬于 10 毫升 DYS 空间溶液中。在 37 摄氏度下孵育 45 分钟，孵育 45 分钟后每 10 分钟用手摇动一次离心机，然后将浆液悬浮在 10 毫升 0.2% 的 HBSS 溶液中。

我们通常在 15 摄氏度下孵育 20 到 37 分钟，同时每 10 分钟倒置试管，孵育完成。如图所示，当从组织中释放出足够的单细胞时，离心所得细胞并复苏，将细胞沉淀悬浮在 5 毫升增殖中。培养基 PM 将提取物穿过一系列针头两次，然后通过 23 号针头一次，最后通过 27 号针头一次，从而解离细胞悬液。

最后，将细胞提取物通过 70 微米细胞过滤器，开始制备技术。离心刚刚制备的细胞提取物，并重悬沉淀增殖。将 5 毫升细胞混合物接种到涂有胶原蛋白的 T 25 培养瓶上，并以 PP 1 的形式销售，在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳培养箱中孵育 2 小时。

两个小时后。将非粘附细胞转移到新的胶原蛋白包被的 T 25 培养瓶中，作为 PP 2 销售。将 5 毫升 PM 添加到标记为 PP one 的前一个 T 25 培养瓶中。

两个培养瓶放回培养箱中 24 小时。24 小时后，将非贴壁细胞从 PP 2 转移到新的胶原 ENC 包被的 T 25 培养瓶中，并将其标记为 PP 3。将 5 毫升增殖培养基加入标记为 PP 2 的培养瓶中。

将培养瓶放回培养箱中。每 24 小时重复一次该过程，直到群体 PP 6。干细胞群被创造。

分离的 PP six 细胞数量非常少，需要维持在富含 FBS 的增殖培养基中。这种情况每天都在改变。尽管 PP six 培养物中的大多数细胞会在接下来的 1 到 2 周的培养中死亡。

额外的一到两周的扩张后产生一个大型的健康 PP 六种群。也要保持所有其他悬浮细胞组，让它们增殖并使用倒置显微镜定期检查它们。附着在 PP one 和 PP 2 培养瓶上的早期粘附细胞大多是纤维化细胞。

48 至 96 小时内较长时间后粘附在胶原包被培养瓶上的细胞。PP 3 和 PP 4 主要是成肌细胞。虽然肌肉卫星细胞通常主要出现在 PP 5 中，但较晚的 96 小时或更晚的 PP 6 制备细胞被视为成体干细胞，看起来小、圆且半透明。

在分离开始时，可以通过免疫组化进一步表征它们对干细胞标志物（如干细胞、抗原 1 和 CDC 34）的表达。我们刚刚向您展示了如何从小鼠的第二个团块中分离干细胞。何时执行此程序，重要的是要记住在所有程序中保持类固醇。

分离干细胞后，确保以低密度培养这些细胞，以保持细胞的干细胞特性。就是这样。感谢您的观看，祝您的体验好运，祝您在实验中尝试使用它好运。

谢谢。