Name: 定量组织样本中的γH2AX灶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学习使用免疫荧光技术定量检测小鼠组织中的γH2AX灶，评估DNA双链断裂损伤。该方法适用于辐射生物学研究及疾病模型中的DNA损伤分析。

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感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（566559）资助。LM 获得了墨尔本研究奖学金（墨尔本大学）和生物医学影像合作研究中心补充奖学金的支持。莫纳什显微成像中心（Stephen Cody 博士和 Iśka Carmichael 博士）在本研究中提供了 invaluable 的支持。MMT 感谢美国国立卫生研究院 Olga Sedelnikova 博士提供的专业协助与建议。

组织
<ol>
 <li>将肺组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂4583中，使用Leica 1950型恒冷切片机切片（5 μm），并贴附于多聚赖氨酸载玻片上。</li> 
</ol>
冷冻样品由墨尔本儿童研究所的Simon Royce博士提供。肺组织取自未经处理的Balb/c小鼠，以及一种慢性过敏性气道疾病小鼠模型，该模型表现出许多与人类哮喘相似的病理特征6。动物实验均依照墨尔本儿童研究所动物伦理委员会制定的指南和规定进行，该委员会遵循澳大利亚实验动物用于科学目的的护理与使用规范。
<ol start="2">
 <li>切片在室温下静置干燥1小时。</li> 
</ol>
免疫荧光染色
<ol>
	<li>切片在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2%（w/v）多聚甲醛固定20分钟。</li>
	<li>切片用PBS洗涤两次，每次15分钟，进行平衡。</li>
	<li>切片用预冷至-20°C的70%乙醇处理20分钟，随后用PBS洗涤三次，每次10分钟。</li>
</ol>
此时，载玻片可置于密封容器中，在 4°C 下保存长达 2 周。
<ol start="4">
	<li>切片用 PBS 每次 10 分钟，洗涤三次，然后在含 0.5% Tween-20 和 0.1% Triton X-100 的 PBS（PBS-TT）中加入 100 μL 新鲜配制的含 8% BSA 的溶液，在室温下封闭 1 小时。 所有孵育步骤均在湿盒中的染色槽内进行。</li>
	<li>切片用 PBS-TT 洗涤 5 分钟，并用 Pap 笔在组织周围标记疏水边界。</li>
	<li>吸去多余缓冲液后，每张切片加入 100 μL 一抗溶液（兔多克隆抗-γH2AX 抗体，用含 1% BSA 的 PBS 稀释至 1:500，Millipore），在室温下孵育 2 小时。 一抗孵育也可在 4°C 过夜进行。 为进一步证明 γH2AX 焦点代表 DNA 双链断裂（DSB），可同时使用识别 DSB 修复蛋白的一抗。例如，γH2AX 与磷酸化 ATM（phospho-ATM）的共定位是一种常用的组合。</li>
	<li>切片用 PBS-TT 洗涤两次，每次 5 分钟，然后在避光条件下加入 100 μL 二抗溶液（Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG，用含 1% BSA 的溶液稀释至 1:500，Invitrogen），室温孵育 1 小时。（稀释后的抗体在整个操作过程中均需避光保存）。</li>
	<li>切片用 PBS-TT 洗涤三次，每次 5 分钟，然后加入 0.5 mg/mL RNA酶A，在 37°C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用含碘化丙啶的 Vectashield 封片介质进行核复染和封片。</li>
	<li>载玻片用指甲油封固后，在 4°C 避光保存过夜，再进行分析。</li>
</ol>
显微镜 / 分析
<ol>
	<li>使用蔡司 LSM510 Meta 共聚焦显微镜，通过标准 GFP（用于 γH2AX - Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG）和 PI（543 nm）激光获取图像。</li>
</ol>
采用Z轴系列模式采集图像，步长为0.5 μm。分析过程中，对各个成像平面进行去卷积处理并叠加，生成最大强度投影图像，以最大限度减少焦点重叠。
在进行颗粒计数之前创建最大投影图像的方法，仅适用于使用薄切片（例如 5μm）且背景染色可忽略的情况。当必须分析具有显著背景的较厚切片时，应采用更复杂的分析方法，例如 Bolte 和 Cordelieres（2006）所述的 3D 对象计数器7。
<ol start="2"> <li>使用 MetaMorph（Molecular Devices，美国）软件生成融合（红色和绿色）图像，以定量分析焦点数量。</li>
</ol>
尽管可以使用 Metamorph 对焦点数量进行定量分析，但在使用组织切片时，通常通过人工（肉眼）计数以获得更高的准确性。
可根据组织学特征并参考苏木精和伊红染色的连续切片，选择特定的目标细胞类型进行定量，例如肺上皮细胞。

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本实验中，我们使用了未经处理的 Balb/c 小鼠的肺组织以及慢性过敏性气道疾病小鼠模型的肺组织。我们对每细胞中焦点数量的差异进行了定量分析，发现受损肺组织中的平均值略高于未经处理的组织。具体而言，定量结果显示，在未经处理的组织和慢性过敏性气道疾病组织中，每细胞的焦点数分别为 6.5 和 9.4（每组织切片手动计数 20 个细胞）。然而，若使用可诱导 DNA 双链断裂（DSB）的试剂（例如萘），已知其可在小鼠肺模型中诱导 DSB，则会产生更高的焦点数量。事实上，本方案最适合用于研究电离辐射对组织的影响；当使用电离辐射时，γH2AX 焦点的数量和分辨率会获得更为显著的结果。众所周知，在接受 X 射线照射后，γH2AX 焦点迅速形成，焦点数量在 30–60 分钟内达到峰值2。因此，照射后 1 小时的时间点最适合评估初始 DSB 的形成，而更长的时间点（通常长达 48 小时）可用于监测 DNA 修复过程。 总体而言，组织中γH2AX的定量检测可用于监测DNA双链断裂（DSB）的形成与修复。除了在电离辐射研究中的应用外，该方法还可用于评估各类组织中诱导DSB化合物的效...

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA（1%）用于阻断非特异性抗体结合。一抗和二抗均用BSA溶液稀释。</td></tr><tr><td>PBS（不含Ca）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>多聚赖氨酸载玻片</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>通过静电作用吸引冷冻组织切片，减少对额外涂层和黏附剂的需求。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>试剂</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20（0.5%）是一种用于细胞通透的去垢剂</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>使用0.1% Triton X-100对细胞进行通透处理。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化-&amp;#947;H2AX（兔多克隆抗体）</td><td>一抗</td><td>Upstate，Millipore</td><td>07-164</td><td>一抗稀释比例（1:500），溶于1% BSA中。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>在含1% BSA的溶液中稀释二抗（1:500）。</td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td></td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>试剂</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>试剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>一种含碘化丙啶（红色细胞核染料）的甘油基封片介质。该介质必须与匹配其折射率的油镜配合使用。&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;注意：常用的DNA染料为4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI），仅可用于配备相应激发激光的显微镜。</td></tr><tr><td>迷你PAP笔</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（22×50 mm）</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Coplin 玻璃染色缸</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>染色槽</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 冷冻切片机</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>成像分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

组织样本中γh2ax焦点的定量分析

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA双链断裂（DSBs）是一类具有高度致死性和基因毒性的损伤，可由内源性（生理或病理）过程或外源性因素（尤其是电离辐射和放射模拟化合物）引起。组蛋白H2A的变体H2AX在其高度保守的C末端SQEY基序中的丝氨酸-139位点发生磷酸化，形成γH2AX，是DNA双链断裂的早期应答反应。1这一磷酸化事件由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）蛋白家族、共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）、DNA-蛋白激酶催化亚基以及ATM和RAD3相关蛋白（ATR）介导。2总体而言，DSB 诱导会导致形成离散的核内 γH2AX 焦点，可通过免疫荧光显微镜轻松检测和定量2鉴于该标志物具有独特的特异性和灵敏性，对γH2AX焦点的分析已在生物医学研究中得到广泛应用，尤其在辐射生物学和核医学领域。在细胞培养体系中，针对电离辐射诱导的DNA双链断裂（DSBs），γH2AX焦点的定量分析已得到最为广泛的研究。除了用于评估细胞放射敏感性外，基于免疫荧光的检测方法还被用于评价辐射修饰化合物的效果。此外，γH2AX已被用作分子标志物来检测多种诱导DNA双链断裂化合物的有效性，并且最近被视为衰老及疾病（尤其是癌症）的重要标志物。3此外，基于免疫荧光的方法已被改进，适用于检测和定量γH2AX焦点ex vivo和in vivo4,5. 本文展示了一种在小鼠组织中检测和定量γH2AX焦点的典型免疫荧光方法。

基于γH2AX焦点对DNA双链断裂进行定量已成为一种不可或缺的工具，尤其在辐射生物学中，可用于评估组织的放射敏感性以及辐射修饰化合物的作用效果。本文展示了在组织样本中利用免疫荧光法对γH2AX焦点进行定量的方法。

组织样本中γH2AX焦点的定量分析

DNA双链断裂（DSBs）是一种极具致死性和基因毒性的损伤，可由内源性（生理或病理）因素或外源性因素引起。

大家好，我是来自表观基因组医学与人类表观遗传学实验室的 Michelle Tang。本实验室由 Baker IDI 心脏与糖尿病研究所的副教授 Tom Carianne 博士领导。今天我将演示一种体内 γH2AX 免疫荧光检测方法，用于测定疾病组织中 DNA 损伤的程度。H2AX 是一种组蛋白变体，约占总哺乳动物组蛋白 H2A 的 2% 至 10%，在哺乳动物细胞的丝氨酸 139 位点可迅速发生磷酸化。在 DNA 损伤响应中，磷酸化的 H2AX 被称为 γH2AX，已有研究证实，双链断裂的数量与 γH2AX 之间存在直接相关性。γH2AX 是一种敏感的分子标志物，已被证明是双链断裂的早期指示标志。因此，检测 γH2AX 是一种用于检测 DNA 损伤的有效技术。通过荧光显微镜，可以在DNA损伤位点观察到表现为细胞核内焦点的γH2AX。在本实验中，我将使用来自墨尔本儿童研究所Simon Royce博士提供的小鼠肺组织样本。我将研究慢性过敏性气道疾病小鼠模型肺组织中的DNA损伤，该模型表现出许多与人类哮喘相似的病理特征，包括气道高反应性、气道重塑以及气道炎症。现在开始实验。首先将样品放入恒冷切片机中，在零下20摄氏度下冷冻约20分钟。为达到最佳切片温度，使用防脱载玻片，以防止组织切片从载玻片上脱落。进行免疫荧光染色时，使用OCT将样本固定在持样器上，再将持样器安装到切块上，确保其牢固连接。将冷冻切片机设定为切取5 µm厚的组织切片，小心开始切片，用画笔将切下的样本朝向自己拉出，将载玻片置于切片上方，使切片贴附于玻片表面。室温下干燥切片1小时，以确保完全去除水分后再进行后续操作。首先，使用不含钙和镁的 PBS 配制的 2% 戊二醛固定组织切片，固定时间为 20 分钟。倾去多余的戊二醛后，将载玻片放入 Copeland 染色缸中，用 PBS 洗涤两次，每次 15 分钟。透化步骤完成后，将细胞膜样本用 -20°C 的 70% 乙醇处理 20 分钟。随后，样本在 PBS 中洗涤三次，每次 10 分钟。逐一移除每个位点，以防止组织切片干燥。用玻片吸去多余的 PBS，然后用含有 0.5% 至 0.1% Triton X-100 的 8% BSA PBS 溶液（也称为 P-B-S-T-T）封闭切片。将这些玻片在室温下孵育一小时，孵育后用 P-B-S-T-T 洗涤样品五分钟。PBS TT 用于促进抗体进入细胞核。随后将切片吸干以去除多余的 P-B-S-T-T。使用 Pap笔在组织周围画圈，以减少试剂的使用量。使用一抗，即抗磷酸化γH tox快速多克隆抗体。用含1% BSA的PBSTT缓冲液按1:500比例稀释。将这些切片置于湿盒中，在室温下孵育两小时。在进行两次每次五分钟的PBSTT洗涤以去除过量一抗之前，先吸去一抗。取出玻片并吸去多余的PBSTT。使用488标记的山羊抗Reid IJJ抗体。将二抗用含1% BSA的P-B-S-T-T缓冲液按1:500比例稀释后加入样品中。然后将切片置于湿盒中孵育一小时，孵育结束后弃去二抗，用N-P-B-S-T-T缓冲液进行三次、每次五分钟的洗涤，以去除未结合的二抗。用铝箔覆盖 Copeland 罐，以防止每次洗涤步骤期间暴露于光线下。取出载玻片，并吸去多余的 P-B-S-T-T。在 PBS 中添加 0.5 毫克/毫升的 RNAs A，以减少任何细胞质染色。随后将样品在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，去除RNA酶A，用PBSTT缓冲液短暂洗涤样品，以防止组织切片干燥。在加入封片剂之前，应将样品用铝箔包裹并避光保存。每次取出一张玻片，吸去多余的 P-B-S-T-T。在每个切片上滴加含碘化丙啶（一种红色细胞核染料）的 Vector Shield 封片剂。然后小心地盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，并用吸水纸吸去多余的 Vector Shield 封片剂。然后打磨盖玻片边缘以密封并防止样品干燥。最后将样品置于4°C避光处保存，直至显微镜观察时取出。使用Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜，配备63倍油浸物镜，采用波长为488 nm的氩离子激光器和543 nm的氦氖激光器，分别用于激发Alexa Fluor 488和碘化丙啶染色样品。每个视野包含8到15个光学Z轴序列拼接图像，步长为0.5微米，并进行一次缩放。图像以单独的TIF文件导出，并使用MetaMorph软件进行分析。从Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜获取的图像在MetaMorph程序中打开，用于图像分析和初始计数。以Z轴序列采集的荧光图像通过去卷积处理，并利用最大投影滤波器叠加生成二维图像。这样做的目的是尽量减少弱强度焦点的丢失。将最大投影图像转换为二值图像，并应用诸如顶帽变换等形态学滤波器，以降低背景干扰并提高焦点检测的灵敏度。同时加载相应的碘化丙啶图像，并识别出细胞核区域。通过手动绘制细胞核周围的区域来强调这些区域，以计数每视野内的焦点数量。将这些区域转移至顶部帽像，并应用亮阈值滤波。阈值的选择经过仔细的视觉比对，需与焦点一致，并避免包含每个视野内的任何背景信号。采用整合形态学分析（IMA）对焦点进行计数。也可通过人工计数以确保结果的可靠性。至此，体内免疫荧光染色实验流程结束，可用于确定疾病组织中DNA损伤的程度。该技术适用于检测由不同刺激引起的DNA损伤。然而，它最适用于评估对电离辐射的反应及辐射敏感性。以上就是全部内容。感谢观看。

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科研

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生物学

定量组织样本中的γH2AX灶

利用γH2AX形成作为分子标志物来定量DNA双链断裂，已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文展示了使用免疫荧光法对细胞经辐射暴露后γH2AX焦点进行定量分析的方法。...

电离辐射后γH2AX焦点的定量分析

在DNA双链断裂后，H2AX在Ser-139位点发生磷酸化，形成γH2AX焦点，其显微分析已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文中，我们采用针对赖氨酸4位单甲基化组蛋白H3的抗体作为活跃转录的常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导的γH2AX在细胞核内的空间分布。...

电离辐射后γH2AX空间分布的评估

在本视频中，我们介绍了免疫荧光显微技术，用于检测定位于人单个核细胞DNA双链断裂位点的特定DNA损伤应答蛋白。这些蛋白可被特异性的一抗识别，一抗进而结合带有荧光染料标记的二抗；在显微镜观察时，二抗发出荧光，从而使得细胞核内这些蛋白呈现为清晰可辨的荧光焦点，实现可视化观察。...

用于分析DNA双链断裂的免疫荧光显微镜技术

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诱导与定量细胞衰老的技术

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。...

γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

该方法结合了DNA双链断裂（DSBs）的定量分析、细胞周期分布和细胞凋亡检测，能够实现针对细胞周期特异性的DSB诱导与修复评估，以及修复失败所导致后果的分析。...

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γH2AX与细胞凋亡的流式细胞术方法

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

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一种用于人外周血淋巴细胞γ-H2AX焦点检测的自动化显微评分方法

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本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。...

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学习使用免疫荧光技术定量检测小鼠组织中的γH2AX灶，评估DNA双链断裂损伤。该方法适用于辐射生物学研究及疾病模型中的DNA损伤分析。

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