Name: 采用芯片识别亚型特定的靶基因的全基因组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 了解染色质免疫沉淀测序方法，用于全基因组分析KDM5A/RBP2组蛋白去甲基化酶的靶基因。该技术可识别基因组结合位点，助力表观遗传调控研究。

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本工作由美国癌症协会（ACS）提供的115347-RSG-08-271-01-GMC项目以及美国国立卫生研究院（NIH）的CA138631资助项目支持。

该方案最初改编自 B. Ren，2001 年。它是 Odom 等人5所建立方案的轻微修改版本，原始方案可于以下网址获取：<a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a>
1. 抗体与磁珠的预封闭及结合（应在下一步前一晚进行）
<ol>
 <li> 每次免疫沉淀（IP）使用100 μL Dynabeads Protein G（多个IP可合并处理），在1 mL新鲜的BSA/PBS溶液中（10 mL PBS中含50 mg BSA，该溶液可保存一周）洗涤一次。</li>
 <li> 使用磁力架收集磁珠，并重复洗涤步骤两次。</li>
 <li> 接着，每IP向250 μL PBS/BSA溶液中的磁珠悬液中加入10 μg抗体，于4°C在旋转平台上孵育过夜。</li>
 <li> 孵育结束后，用1 mL PBS/BSA溶液洗涤磁珠三次，然后每IP重悬于10 μL PBS/BSA溶液中。</li>
</ol>
2. 细胞交联
<ol>
 <li> 开始该实验前，每项免疫沉淀（IP）需培养约 108 个细胞。本实验使用弥漫性组织细胞性淋巴瘤 U937 细胞，并用 TPA 诱导其向单核细胞分化，持续 96 小时。</li>
 <li> 细胞培养完成后，将甲醛溶液直接加入培养基中，使其终浓度为 1%。轻轻摇动培养瓶混匀，室温静置 10 分钟。随后吸除培养基，用 15 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞一次，重复洗涤一次。</li>
 <li> 接着，将 6 mL 裂解缓冲液 1（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA，10% 甘油，0.5% NP-40，0.25% Triton X-100，含蛋白酶抑制剂）加入冰上的每个培养瓶中，然后在 4°C 条件下轻轻振荡 20 分钟。</li>
 <li> 最后，用细胞刮刀收集细胞，并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。此时细胞可保存于 -80°C。</li>
</ol>
3. 细胞超声处理
<ol>
 <li>如果细胞为冷冻状态，请先将其解冻。解冻后，在 4°C 下以 3,000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。随后将细胞重悬于 6 mL 裂解缓冲液 2（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，200 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，含蛋白酶抑制剂）中，在室温下轻轻摇动试管 10 分钟。</li>
 <li>重复离心操作，并将细胞重悬于 2.5 mL 裂解缓冲液 3（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，0.1% 脱氧胆酸钠，0.5% N-月桂酰肌氨酸，含蛋白酶抑制剂）中。</li>
 <li>接下来，将悬液置于冰水浴中的烧杯内，使用 Branson 450 超声破碎仪，设置微探头振幅为 50% 至 60%，准备进行超声处理。</li>
 <li>以持续 30 秒的超声脉冲处理溶液，随后在冰上冷却 1 分钟。重复该超声-冷却过程 10 至 15 次。然后用移液器反复吹打管内液体，并将其转移至新管中。继续额外进行 5 次超声脉冲并每次冰上冷却。</li>
 <li>超声处理完成后，向溶液总体积中加入终浓度为 10% 的 Triton X-100。将裂解液转移至 1.5 mL 离心管中，在微量离心机中离心去除碎片。随后将细胞裂解液转移至新的离心管中。</li>
</ol>
4. 染色质免疫沉淀
<ol>
 <li>在进行染色质免疫沉淀（ChIP）之前，保留50 μL细胞裂解液作为输入样品。然后将澄清的细胞裂解液与上述方法预先制备的、已结合抗体的Dynabeads混合。将混合物连同50 μL输入样品一起，在4°C下轻轻摇动过夜。</li>
 <li>用1 mL洗涤缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.6，0.5 M LiCl，1 mM EDTA，0.7%脱氧胆酸钠，1% NP-40）洗涤磁珠。使用磁力架收集磁珠并去除上清液。重复此洗涤步骤6至8次。</li>
 <li>用1 mL含50 mM NaCl的TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）进行最终洗涤。在4°C下，以3,000 rpm的转速将磁珠在微量离心机中离心2分钟。离心后，吸除残留的TE缓冲液。</li>
 <li>然后向样品中加入100 μL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA，1% SDS）。立即在65°C下孵育10至15分钟。每隔2分钟将管子在1.5 mL管架上轻轻刮擦，以保持磁珠悬浮状态。</li>
 <li>通过离心和磁力架收集磁珠，并将上清液转移至PCR管中。取出之前保存的输入样品，加入3倍体积的洗脱缓冲液。</li>
 <li>最后，将免疫沉淀（IP）样品和输入样品置于PCR仪中，在65°C下过夜孵育，以逆转交联。</li>
 <li>次日，向样品中加入1倍体积的TE缓冲液。然后加入RNase A，使其终浓度达到0.2 μg/μL。在PCR仪中于37°C孵育1至2小时。</li>
 <li>孵育结束后，加入蛋白酶K，使其终浓度为0.2 μg/μL。然后在PCR仪中于55°C孵育2小时。</li>
 <li>接下来，用等体积的苯酚对样品进行一次抽提。再用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）进行第二次抽提。最后用等体积的氯仿:异戊醇（24:1）再抽提一次。</li>
 <li>然后向每个样品中加入30 μg甘油原。同时加入NaCl使其终浓度为0.2 M，并加入两倍体积的乙醇。在-80°C下孵育30分钟。孵育后离心样品，弃去上清液。用500 μL 75%乙醇洗涤沉淀。随后将沉淀干燥，并重新溶解于40 μL水中。</li>
 <li>为检测超声处理产生的DNA片段大小，取5 μg纯化的输入样品上样至1.8%琼脂糖凝胶中并进行电泳。超声处理应产生大小在150–350碱基对范围内的DNA片段。若片段大小不在该范围内，应通过调整脉冲次数和振幅来优化超声处理条件。</li>
 <li>为评估ChIP实验的稳健性和特异性，使用1 μL IP样品及输入样品的系列稀释液，对对照结合区域进行基因特异性PCR检测。需选择两到三个“结合”区域以及一个非结合对照区域，以评估IP样品和输入样品的质量。</li>
</ol>
5. 基因组DNA的扩增
<ol>
 <li> 从34 μl的IP样品或200 ng的input样品开始，使用Genomic DNA Sample Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn</a>（Illumina, Inc., San Diego, CA）对DNA片段进行末端修复、'A'尾添加以及接头连接。</li>
 <li> 使用MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA，然后将其洗脱于预热至50 °C的缓冲液EB（10 mM Tris Cl，pH 8.5）中。例如，IP和input DNA样品的最终洗脱体积分别使用23 μL和46 μL。</li>
 <li> 使用23 μL带有接头的DNA、25 μL来自试剂盒的Phusion DNA聚合酶、1 μL 20 μM Sol_PCR_1和1 μL 20 μM Sol_PCR_2配制PCR反应体系。PCR扩增程序如下：1）98°C 30秒；2）98°C 10秒；3）65°C 30秒；4）72°C 30秒；重复步骤2–4共18个循环，然后72°C延伸5分钟，最后在4°C保存。</li>
 <li> PCR扩增完成后，使用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA。将15 μL缓冲液EB预热至50 °C并用于DNA洗脱。取0.5 μL样品稀释至1:4，进行Nanodrop测定。</li>
</ol>
6. 扩增产物的凝胶纯化
<ol>
 <li> 为了纯化扩增产物，使用HPLC级水配制50 mL的1.8%琼脂糖凝胶。在琼脂糖完全融化后加入TAE和溴化乙锭。然后倒入凝胶模具。在输入样本和免疫沉淀（IP）样本中各加入4 μL上样缓冲液后上样。随后在120伏电压下电泳运行45分钟。</li>
 <li> 电泳结束后分析凝胶结果。凝胶应显示产生大小在150至350碱基对之间的片段，这些片段代表长度为50至250碱基对的基因组DNA片段以及接头序列。</li>
 <li> 使用手术刀切下含有150至350碱基对范围内产物的凝胶区域。注意避免切下在约120碱基对位置迁移的接头-接头二聚体条带。按照QIAquick凝胶回收试剂盒的制造商说明书回收DNA。具体而言，每份不超过400 mg的凝胶切块使用该试剂盒中的一个纯化柱。开始提取时，向1体积凝胶中加入3体积的QG缓冲液，再加入1体积异丙醇，将混合物上样至纯化柱。用0.5 mL QG缓冲液洗涤柱子，随后按照试剂盒手册中的标准流程操作。使用预热至50°C的H2O洗脱DNA。在离心前，将30 μL H2O加入柱子中，在37°C孵育5分钟。</li>
 <li> 使用无加热功能的真空浓缩仪将样品浓缩至恰好11 μL。取1 μL样品，使用Nanodrop分光光度计测定DNA浓度。</li>
 <li> 最后，按照<a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf</a> 6中所述方法，使用Illumina Genome AnalyzerIIe鉴定富集的基因产物。</li>
</ol>
7. 代表性结果
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="染色质免疫沉淀实验流程图，从交联到基因结合分析的各个步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 下述实验的总体目标是鉴定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的基因组靶标。
（P1）通过制备交联的染色质，并进行超声处理以获得适当大小的DNA片段来实现该过程。（P2）第二步，利用RBP2抗体对与RBP2结合的DNA片段进行免疫沉淀。（P3）随后，对回收的DNA片段进行末端修复，并将接头连接到基因组DNA的末端，以构建适用于Illumina簇生成仪（Illumina Cluster Station）流动池分析的基因组DNA文库。DNA文库通过PCR扩增，使用较少的循环次数。（P4）最后，将Illumina测序获得的短读长序列唯一比对至人类基因组，识别出显著的富集峰，并注释到最近的基因，以确定RBP2富集区域。（P5）研究结果揭示了基于全基因组范围内RBP2富集区域鉴定所得的RBP2靶基因相关的分子功能。
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="凝胶电泳结果，DNA分离，100 bp DNA标记，U937样本，对照，350 bp条带" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2. 检测染色质超声破碎结果 为检测超声破碎处理所产生的DNA片段大小，将5 μg（1/10）纯化的输入样品上样至1.8%琼脂糖凝胶。如预期所示，我们的超声破碎程序产生的片段大小在150–350 bp范围内。然而，若片段大小不在该范围内，应通过调整脉冲次数和振幅对超声破碎程序进行相应优化。
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="显示DNA片段的电泳凝胶；分子量标记、接头-接头条带、免疫沉淀样品。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 扩增产物的凝胶纯化。 将PCR产物进行凝胶电泳，以去除接头并选择适合簇生成平台的模板大小范围。该凝胶显示产生了大小在150至350碱基对之间的片段，对应长度为50至250碱基对的基因组DNA片段及接头。我们使用解剖刀切下选定的凝胶区域。操作时应避免切到在约120碱基对位置处的接头-接头条带。
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="RBP2异构体示意图；蛋白质结构域、氨基酸区域、用于大/小异构体分析的抗体。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. 异构体特异性抗体可区分RBP2的大和小异构体。 RBP2蛋白结构以结构域形式展示。RBP2包含多个结构域：催化组蛋白去甲基化的JmjC结构域及其相关的JmjN结构域、能够序列特异性结合DNA的ARID结构域、可能与DNA或其他蛋白质相互作用的C5HC2型锌指结构域，以及多个PHD结构域。用于区分RBP2异构体的两种抗RBP2抗体是针对图中粗线所示的RBP2片段制备的。
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="染色体定位；示意图；染色体10；基因位置；异构体；遗传分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5a"> 
 图5a. RBP2结合区域在染色体及Ensembl基因上的分布概览。 已鉴定出的富集RBP2（所有异构体及大异构体）结合区域的基因组坐标按染色体分别展示。Ensembl基因（版本54；hg18）在染色体上的分布（本图中为染色体10）以黑色条形表示（上图面板）。每个RBP2结合区域以一条垂直线表示，其中中图面板显示所有RBP2异构体在染色体10上的结合区域，下图面板显示RBP2大异构体的结合区域。中图和下图面板展示了RBP2异构体在染色体10上结合区域的重叠与特异性占据情况。
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="RBP2异构体功能的基因本体图解，突出显示核苷酸结合和转录功能。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5b"> 
 图5b. RBP2靶基因的功能富集分析。 热图显示了RBP2（全部异构体及大分子异构体）结合的基因（RBP2结合区域最近的基因）中FDR校正后显著富集（p值 ≤0.05）的GO分子功能类别。颜色越偏红色表示统计学显著性越高，黄色表示统计学显著性较低，灰色表示无统计学显著性。富集分析揭示了RBP2靶基因在分子功能上的重叠性及异构体特异性。

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

RBP2 亚型之间的功能差异尚未确定。我们采用了一种综合方法来鉴定 RBP2 亚型结合的基因组区域，并确定这些区域所代表的功能类别。该目标通过 ChIP-Seq 分析及对获得的测序读长进行生物信息学分析得以实现。

RBP2 可修饰组蛋白尾部的甲基化赖氨酸残基。我们发现，包含甲基化组蛋白赖氨酸识别模块的 RBP2 大亚型与缺乏该模块的 RBP2 小亚型结合于人类基因组中的不同区域（图 5A）。重要的是，这些亚型特异性结合区域以及重叠区域对应于具有不同分子功能的基因（图 5B）。例如，“染色质结合”和“转录因子结合”功能可归因于 RBP2 小亚型的靶基因，而不能归因于 RBP2 大亚型的靶基因（图 5B）。通过比较为所有亚型以及 RBP2 大亚型生成的实际基因集合（数据未显示），我们还可以确定大亚型是否被特异性招募至某些基因。

<table><tbody><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>USB公司，Affymetrix</td><td>10852</td><td></td></tr><tr><td>氯仿/异戊醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>基因组DNA样本制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-102-1001</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>低分子量DNA标准品</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>N-月桂酰基肌氨酸</td><td>MP Biomedicals</td><td>194008</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>mt21040cv</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540S</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>TE（用于大提物试剂盒的无内毒素）</td><td>Qiagen</td><td>19048</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>超纯琼脂糖，认证低熔点级</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;寡核苷酸序列 2006 Illumina, Inc. 保留所有权利。&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Sol_PCR_1&lt;br/&gt;序列 5&amp;rsquo;—AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T—3&amp;rsquo;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sol_PCR_2&lt;br/&gt;序列 5&amp;rsquo;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3&amp;rsquo;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

转录因子和表观遗传因子被招募至其靶位点是调控过程中的关键步骤。在招募过程中，能够结合特定组蛋白修饰的蛋白质结构域尤为突出。其中一种结构域是植物同源异型域（plant homeodomain, PHD），存在于多种染色质结合蛋白中。表观遗传因子 RBP2 含有多个 PHD 结构域，但这些结构域具有不同的功能（图4）。特别是，在人类白血病中发现的 RBP2 致癌融合蛋白所包含的 C 末端 PHD 结构域能够结合组蛋白 H3 第4位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K4me3）1。在原始单核细胞、淋巴瘤来源的 U937 细胞向单核细胞分化过程中，包含 C 末端 PHD 的 RBP2 亚型对应的转录本逐渐积累2。与上述两组数据一致，全基因组分析显示，在分化的 U937 细胞中，RBP2 蛋白定位于富含 H3K4me3 的基因组区域3。RBP2 在其靶位点的定位与其组蛋白去甲基化酶活性相关，导致 H3K4me3 水平下降，并伴随转录活性降低。相比之下，RBP2 的另外两个 PHD 结构域无法结合 H3K4me3。值得注意的是，较小的 RBP2 亚型中缺失了 C 末端的 PHD 结构域4。可以推测，缺乏与 H3K4me3 相互作用能力的小亚型在基因组上的定位与较大的亚型不同。RBP2 不同亚型在基因组定位上的差异可能解释了其功能的多样性。具体而言，RBP2 是视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）介导的细胞分化过程中的关键调控因子。与这些数据一致，此前未区分亚型的全基因组分析鉴定了两类不同的 RBP2 靶基因：1）以不依赖于分化的方式被 RBP2 结合的基因；2）以依赖于分化的方式被 RBP2 结合的基因。
为了鉴定不同亚型在定位上的差异，我们通过ChIP-Seq进行了全基因组定位分析。利用可检测两种RBP2亚型的抗体，我们确定了所有RBP2的靶位点。此外，我们还拥有仅结合大分子量RBP2亚型而不结合小分子量亚型的抗体（图4）。在鉴定出大分子量亚型的靶位点后，可将其从全部RBP2靶位点中扣除，从而揭示小分子量亚型的靶位点。这些数据表明了染色质相互作用结构域在将蛋白招募至基因组结合位点过程中的作用。

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程，用于对在组蛋白结合结构域上存在差异的蛋白质亚型进行全基因组定位分析。我们将其应用于ChIP-Seq分析，以鉴定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的作用靶点。

转录因子和表观遗传因子向其靶点的募集是调控过程中的关键步骤。在募集过程中显著发挥作用的是……

以下实验的总体目标是鉴定组蛋白去甲基化酶KDM5A-JARID1A和RBBP2所作用的基因组靶点。该目标通过以下步骤实现：首先制备交联染色质，并通过超声处理将其打断为合适大小的DNA片段；随后，使用RBBP2抗体对与RBBP2结合的DNA片段进行免疫沉淀。接下来，通过PCR扩增回收的基因组DNA以进行测序。最后，将Illumina测序获得的短读长序列唯一比对到人类基因组，并将显著的峰注释到最近的基因。为了鉴定RbbB2的靶基因，基于全基因组范围内RbbB2富集区域的鉴定结果，获得显示与RrbB2靶基因相关的分子功能的数据。您好，我是 Mike，来自芝加哥伊利诺伊大学生物化学与分子遗传学系 Elizabeth Bencia 博士的实验室。我是 ala，来自 BARCEL 生物医学研究园大学 PO P fea 的 NGA 博士领导的生物医学基因组学实验室。我是 Danielle Dal，这位是 William Richter。我们俩都在仁心技能实验室工作。今天我们将向您展示一种染色质免疫沉淀测序的实验方法。我们在实验室中使用该方法来研究组蛋白修饰的结合位点。现在让我们开始吧。开始此实验步骤时，培养约 10 的 8 次方个细胞，用于每次免疫沉淀（ip）。此处为弥散性溶骨性淋巴瘤。使用U 9 37细胞，并在细胞生长后用TPA诱导单核细胞分化96小时，随后向培养基中直接加入甲醛溶液，使其终浓度为1%。轻轻摇动培养瓶片刻，室温静置10分钟。然后吸除培养基，用15毫升预冷的PBS冲洗细胞。重复此洗涤步骤一次。接下来，向冰上的每个烧瓶中加入6毫升裂解缓冲液一。然后在4°C下轻轻摇动烧瓶20分钟。最后，使用细胞刮刀收集细胞，并将其转移至15毫升锥形管中。此时，细胞可在 -80 摄氏度下保存。如果细胞已冷冻，请将其融化。融化后，离心收集细胞，并弃去上清液。然后将细胞重悬于6 mL裂解缓冲液二中，在室温下轻轻摇动离心管10分钟。重复离心操作，并将细胞重悬于2.5 mL裂解缓冲液三中。接下来，将悬液置于冰水浴中的烧杯内，使用Branson 450超声破碎仪，设置微探头振幅为50%至60%，准备进行超声处理。将溶液进行32秒的持续超声处理，并在冰上冷却。重复此脉冲处理10至15次，每次持续1分钟，然后用移液器将管内液体上下吹打混匀，转移至新管。继续对溶液进行脉冲处理并冷却。超声处理后，再额外进行五次，每次向溶液总体积的十分之一中加入10%的Triton X-100。然后将裂解物转移至1.5毫升离心管中，在进行染色质免疫沉淀或芯片分析之前，使用微量离心机离心去除碎片。保留50微升细胞裂解物作为输入样品。然后将澄清的细胞裂解液与预先按照书面实验方案制备的、结合有抗体的磁珠混合。将混合物与50 µL的输入样品一起在4°C下轻轻摇动过夜。用1 mL洗涤缓冲液洗涤磁珠。然后使用磁力架收集磁珠，并移除上清液。此洗涤步骤重复六到八次。最后用一毫升含50毫摩尔氯化钠的TE缓冲液进行一次终末洗涤。离心后，在微量离心机中旋转磁珠，吸去残留的TE缓冲液。然后向样品中加入100 µL洗脱缓冲液。立即进行下一步操作。将样品在 65 摄氏度孵育 10 至 15 分钟。每两分钟用试管在 1.5 毫升管架上刮擦一次，以保持珠子悬浮。使用离心机和磁力架收集珠子，并将上清液转移至 PCR 管中。然后取出先前保存的输入样品，加入三倍体积的洗脱缓冲液。最后将免疫沉淀样品和输入样品放入热循环仪中，在65摄氏度下孵育过夜。次日，为逆转交联，向样品中加入一倍体积的TE缓冲液。然后加入RNAs A，使其终浓度为0.2微克每微升。将样品在37摄氏度的热循环仪中孵育1至2小时。孵育结束后，加入蛋白酶K，使其终浓度为0.2微克每微升。然后将样品在55摄氏度的热循环仪中孵育2小时。接着用一个体积的苯酚抽提样品一次。再用一个体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提样品第二次。最后，用等体积的氯仿-异戊醇再次提取样品。然后向每个样品中加入 30 微克的糖原。同时，将氯化钠加入样品中，使其终浓度为 0.2 摩尔，并加入两倍体积的乙醇。在负80摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，离心样品并弃去上清液。用500微升75%乙醇洗涤沉淀，然后将沉淀干燥，并重悬于40微升水中。为了检测超声处理（SONICATION）程序产生的DNA片段大小，将五微克纯化的输入样品加入1.8%琼脂糖凝胶中并进行电泳。超声处理应产生长度在150至350个碱基对之间的片段。然而，如果片段大小不在该范围内，则应在扩增基因组DNA之前，通过调整脉冲次数和振幅来优化超声处理程序。按照书面方案中所述，检测样品的大小、浓度和富集情况。开始基因组DNA扩增时，取34微升IP样品和200纳克输入样品。使用Illumina基因组DNA文库制备试剂盒，按照书面方案所述，对DNA片段进行末端修复、加尾及接头连接。使用小型离心柱PCR纯化试剂盒纯化DNA，然后用预热至50摄氏度的EB缓冲液洗脱。IP和input DNA样本分别使用23微升和46微升。取23微升DNA进行PCR反应，加入25微升融合引物和试剂盒中的DNA聚合酶。取1 µL浓度为20 µM的sole PCR一和1 µL浓度为20 µM的sole PCR二，按照书面实验方案所述进行PCR反应。PCR扩增完成后，使用Qiagen mini loop PCR纯化试剂盒纯化DNA。将15微升缓冲液EB预热至50摄氏度，取0.5微升样品进行1:4稀释，使用NanoDrop测定以纯化扩增产物。使用HPLC级水配制50毫升1.8%琼脂糖凝胶，待琼脂糖完全融化后加入TAE和溴化乙锭。然后倒入凝胶，上样电泳。向输入样品和免疫沉淀样品中加入4 µL上样缓冲液后，在120伏电压下电泳45分钟。电泳结束后分析凝胶结果，应显示产生大小在150至350碱基对之间的片段。它们代表长度在50至250个碱基对之间的基因组DNA片段。使用手术刀切下凝胶中包含150至350个碱基对范围内物质的区域。注意避免切下位于约120个碱基对处的接头二聚体条带。按照制造商的说明，使用Kayak快速凝胶回收试剂盒回收DNA。在无加热条件下，使用浓缩仪将样品精确浓缩至11微升。取1微升样品，使用NanoDrop分光光度计测定DNA浓度。最后，使用Illumina基因组分析仪鉴定富集的基因产物，并按照书面实验方案中所述分析结合位点和靶基因。鉴定出的富集RB结合蛋白2（RBP2）结合区域的基因组坐标以按染色体划分的格式呈现。染色体上基因集合的占据情况可可视化为黑色VARs。此处显示了10号染色体上的占据情况，rbp两个结合区域以垂直线表示。中间图显示了rbp两个异构体在10号染色体上的所有结合区域，底部图显示了rbp两个大异构体的结合区域。该信息提供了rbp两个异构体在10号染色体上重叠及特异性占据的总体概况。此处显示了一个热图，展示了在 RBP 结合的基因中，经错误发现率（FDR）校正后显著富集的基因本体（GO）分子功能类别。越接近红色的两种颜色表示统计学显著性越高；黄色表示统计学显著性较低，灰色表示无统计学显著性。富集分析显示了R BP两个靶基因的重叠及亚型特异性分子功能。我们刚刚向您展示了如何在此过程中鉴定转录因子结合位点。产生适当大小范围和产量的DNA片段至关重要。这可以通过在超声处理步骤中遵循我们的指南来实现。就这样。祝您的实验顺利，感谢观看。

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采用芯片识别亚型特定的靶基因的全基因组分析

我们的贝叶斯变点（BCP）算法基于利用隐马尔可夫模型对变点建模的前沿进展，并将其应用于染色质免疫沉淀测序（ChIPseq）数据分析。BCP在宽峰和尖峰数据类型中均表现良好，尤其擅长准确识别弥散型组蛋白富集的稳定且可重复的区域。...

一种用于多种ChIPseq数据类型全基因组分析的新型贝叶斯变点算法

在本视频中，我们演示了染色质免疫沉淀技术，用于鉴定少突胶质前体细胞基因组DNA特定区域上的蛋白质结合位点 通过...

染色质免疫沉淀法鉴定基因组DNA上靶蛋白结合位点

染色质免疫沉淀与超深度高通量测序（ChIP-seq）相结合，可识别并定位特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA 相互作用。本文以转录因子 TCF7L2 为例，概述了如何制备高质量的 ChIP...

高质量染色质免疫沉淀DNA模板的制备用于高通量测序（ChIP-seq）

大规模 SNP 分型应用的 Infinium 检测

本文视频介绍了一种基于体外微阵列的 in vitro...

DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。本实验方案描述了利用人工设计的DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，来鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA的操作步骤。...

通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

表观遗传因素可与遗传程序相互作用，从而调控基因表达并调节B细胞功能。通过结合 体外...

全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

该论文描述了一种基于芯片的数字PCR检测方法，用于检测胃癌患者新鲜冷冻的正常组织和肿瘤组织中一种罕见的CDH1转录本变异体（CDH1a）。...

通过基于芯片的数字PCR在新鲜冷冻胃癌组织中检测到一种罕见的CDH1转录本变异体

我们提出了一种利用三维染色质相互作用来鉴定全基因组关联研究（GWAS）所识别的非编码变异功能意义的实验方案。...

利用染色质构象的计算分析将阿尔茨海默病相关变异映射至其靶基因

本文介绍了一种半自动化的微量染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）方案，该方案利用ChIP液体处理平台，针对与特定组蛋白修饰（H3K27ac）相关的DNA区域进行检测，随后采用标签化片段化（tagmentation）方法构建文库。该流程包含对产物质量和数量的质量控制评估步骤，且可适用于其他组蛋白修饰或转录因子的研究。...

一种用于大规模表观遗传学研究的半自动化ChIP-Seq实验流程

了解染色质免疫沉淀测序方法，用于全基因组分析KDM5A/RBP2组蛋白去甲基化酶的靶基因。该技术可识别基因组结合位点，助力表观遗传调控研究。

使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

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