Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

以下实验的总体目标是确定 KDM 5 的基因组靶标 a Jared 1 和 RBB 2 组蛋白去甲基化酶。这是通过制备交联染色质来实现的，第二步是经过超声处理以产生适当大小的 DNA 片段。RBB 两个结合的 DNA 片段用 RBB 两个抗体进行免疫沉淀。

接下来，通过 PCR 扩增回收的基因组 DNA 进行测序。最后，Illumina 测序的短读长与人类基因组唯一比对，并识别出显著的峰并注释到最近的基因。为了鉴定 rbbb 两个靶基因，基于对 Rbbb 两个富集区域的全基因组鉴定，获得显示与 Rrb B 两个靶基因相关的分子功能的结果。

大家好，我是 Mike。她来自芝加哥伊利诺伊大学生物化学和分子遗传学系 Elizabeth Bencia 博士的实验室。我是来自 BARCEL 生物医学研究园大学 PO P fea 由 NGA 博士领导的生物医学基因组学实验室的校友。

我是 Danielle Dal。我是 William Richter。我们俩也在仁爱技能实验室。

今天，我们将向您展示染色质、免疫沉淀和测序的程序。我们在实验室使用该程序来研究他的皮肤科医生的结合位点。那么让我们开始吧。

要开始此过程，请生长大约 10 到第 8 个细胞。对于每种免疫沉淀或 ip。这里，弥漫性溶骨性淋巴瘤。

使用U 9 37细胞，并在细胞在甲醛溶液中直接生长至培养基中至终浓度为1%后，用TPA诱导进行单核细胞分化96小时，然后短暂旋转培养瓶，让它们在室温下静置10分钟。然后吸出培养基并用 15 毫升冰冷的 PBS 冲洗细胞。重复此洗涤一次。

接下来，在冰上向每个培养瓶中加入 6 mL 裂解缓冲液 1 mL。然后在 4 摄氏度下摇动培养瓶 20 分钟。最后，使用细胞刮刀收获细胞并将它们转移到 15 毫升锥形管中。

此时，细胞可以储存在零下 80 摄氏度。如果细胞被冷冻，请将它们排出。解冻后，将细胞向下旋转并丢弃 snat。

然后将细胞重悬于 6 mL 裂解缓冲液 2 中，在室温下轻轻摇动试管 10 分钟。重复离心并将细胞重悬于 2.5 mL 裂解缓冲液 3 中。接下来，将悬浮液放入装有冰水的烧杯中，将 Branson 450 sonier 的微尖端设置为 50% 至 60% 振幅，以准备超声处理。

对溶液进行超声处理以进行第 32 次持续爆发并在冰上冷却。重复这些脉冲 1 到 15 次 1 分钟，然后上下移液管中的内容物并将其转移到新试管中。继续脉冲并冷却溶液。

超声处理后再添加 5 次，将 10% Triton X 100 加入溶液体积的十分之一。然后将裂解物转移到 1.5 mL离心管中，并在染色质、免疫沉淀或芯片之前在微量离心机中将碎片旋转出来。保存 50 μL 细胞裂解物作为输入样品。

然后将澄清的细胞裂解物与与先前制备的抗体结合的 dyna 珠子混合，如书面方案中所述。除了 50 μL 的输入样品外，还将混合物在 4 摄氏度下摇动过夜。用 1 毫升洗涤缓冲液洗涤珠子。

然后使用磁力架收集珠子并去除上清液。重复此洗涤 6 到 8 次。用 1 mL TE 和 50 mLmol 氯化钠进行最终洗涤。

离心后，在微量离心机中离心珠子，吸出任何残留的 TE 缓冲液。然后向样品中加入 100 微升 elu 缓冲液。紧接着。

将样品在 65 摄氏度下孵育 10 至 15 分钟。每两分钟用 1.5 毫升的试管架刮擦试管，以保持磁珠悬浮。使用离心和磁力架收集珠子，并将 SNAT 转移到 A PCR 管中。

然后检索之前保存的输入样品并添加 3 体积的洗脱缓冲液。最后，将 IP 和输入样品放入热循环仪中，在 65 摄氏度下过夜。为了在第二天逆转交联，向样品中加入一体积的 TE 缓冲液。

然后加入 RNA A 至终浓度为 0.2 μg/μL。将样品在热循环仪中于 37 摄氏度孵育 1 至 2 小时。孵育后，添加蛋白酶 K 至终浓度为 0.2 μg/μL。

然后将样品在 55 摄氏度的热循环仪中孵育 2 小时。接下来，用 1 体积的苯酚提取样品一次。用一体积的苯基氯仿异戊醇第二次提取样品。

最后，用一体积的氯仿异戊醇再次提取样品。然后向每个样品中加入 30 μg 糖原。此外，向样品中加入终浓度为 0.2 摩尔的氯化钠和两种体积的乙醇。

将它们在零下 30 摄氏度下孵育 80 分钟。孵育后，离心样品并倒出 snat。用 500 微升 75% 乙醇洗涤沉淀，然后干燥沉淀并重悬于 40 微升水中。

为了检查 SONICATION 程序产生的 DNA 片段的大小，将 5 μg 纯化的输入样品加载到 1.8% agro 凝胶中并运行凝胶。超声处理程序应产生 150 至 350 个碱基对范围内的片段。但是，如果片段不在此范围内，则应在扩增基因组 DNA 之前通过改变爆发次数和振幅来调整超声处理程序。

按照书面方案中的说明检查样品的大小、浓度和富集度。要开始扩增基因组 DNA，请获得 34 μL 的 IP 样品和 200 ng 的输入样品。如书面方案中所述，使用 Illumina 基因组 DNA 样品制备试剂盒进行接头与 DNA 片段的尾部添加和连接。

使用 mini lut PCR 纯化试剂盒纯化 DNA，然后在预热至 50 摄氏度的缓冲液 EB 中洗脱。分别对 IP 和输入 DNA 样品使用 23 μL 和 46 μL。使用 23 μL DNA 和接头 25 μL 融合 DNA 进行 PCR 反应，从试剂盒中取出 DNA 聚合酶。

1 微升 20 微摩尔单一 PCR，1 微升和 1 微升 20 微摩尔。因此，PCR 2 在 PCR 扩增后按照书面方案中的说明运行 PCR 反应。使用 Qiagen 迷你环 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA。

将 15 微升缓冲液 EB 预热至 50 摄氏度并稀释 DNA，稀释 0.5 微升样品 1 至 4 次，然后进行 NanoDrop 读数以纯化扩增产物。使用 HPLC 级水制备 50 毫升的 1.8% AGROS 凝胶，在 agros 熔化后加入 TAE 并溴化物。然后倒入凝胶，上样凝胶。

向起始样品和 IP 样品中加入 4 μL 上样缓冲液后，然后在 120 伏电压下运行凝胶 45 分钟。电泳后分析凝胶。应该显示会产生 150 到 350 个碱基对范围内的片段。

它们代表长度在 50 到 250 个碱基对之间的基因组 DNA 片段。适配器用手术刀切除含有 150 至 350 碱基对范围内的材料的凝胶区域。注意避免切除适配器适配器带，该适配器带以大约 120 个碱基对运行。

按照制造商的说明使用 kayak 快速凝胶提取试剂盒回收 DNA。将样品精确干燥至 11 μL，无需加热即可快速返回。取出一微升样品，并使用 NanoDrop 分光光度计测量 DNA 浓度。

最后，使用 Illumina 基因组分析仪鉴定富集的基因产物，并按照书面方案中的描述分析结合位点和靶基因。鉴定的富集 RB 结合蛋白 2 或 RBP 2 结合区的基因组坐标以染色体格式呈现。集合基因在染色体中的占据可以可视化为黑色 VAR。

这里显示 10 号染色体占据 rbp，两个结合区显示为垂直线。中间面板显示了 10 号染色体上的所有 rbp 两个亚型结合区，底部面板显示了 rbp 两个大的亚型结合区。此信息概述了 RBP 两种亚型在 10 号染色体上的重叠和特异性占有率。

这里显示了一个热图，错误发现率或 FDR 校正，显着富集了 rbp 结合的基因中的基因本体或 go 分子功能类别。两种趋向红色的颜色表示高统计显著性。黄色表示低统计显著性，灰色表示没有统计显著性。

富集分析显示 R BP 两个靶基因的重叠和亚型特异性分子功能。我们刚刚向您展示了如何在此过程中识别转录因子结合位点。生产适当大小范围和产量的 DNA 片段非常重要。

这可以通过在 SONICATION 步骤中遵循我们的指南来实现。就是这样。祝您的实验好运，感谢您的观看。